发明创造名称：人骨代谢标志物检测双胶体金试纸条及应用其的检测装置
外观设计名称：
决定号：201655
决定日：2020-01-20
委内编号：1F279096
优先权日：
申请（专利）号：201610777294.8
申请日：2016-08-30
复审请求人：吕炜锋
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：毕秀华
合议组组长：石剑平
参审员：王晓媛
国际分类号：G01N33/543,G01N33/558,G01N33/577,G01N33/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求与作为最接近现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，而这些区别技术特征可由本领域普通技术人员基于其他对比文件公开的内容并结合公知常识而得到，并且该权利要求的技术方案并没有由于这些区别技术特征而具有预料不到的技术效果，则该项权利要求相对于上述对比文件没有突出的实质性特点和显著的进步，不具有创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610777294.8，名称为“人骨代谢标志物检测双胶体金试纸条及应用其的检测装置”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请日为2016年08月30日，公开日为2017年02月01日，申请人为吕炜锋。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2019年01月14日发出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：权利要求第1-8项不符合专利法第22条第3款的规定。驳回决定引用如下对比文件：
对比文件1：KR 2013-0051429A，公开日期为 2013年05月20日；
对比文件2：CN 105137081A，公开日期为2015年12月09日；
对比文件3：CN 104101706A ，公开日期为2014年10月15日。
驳回决定所依据的文本为：申请日即2016年08月30日提交的权利要求书第1-8项、说明书第1-44段、说明书附图图1-图2、说明书摘要、摘要附图。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，包括试纸条底衬(1)、样品垫(2)、第一结合垫(3)、第二结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)及吸收垫(6)，其特征在于，所述试纸条底衬(1)上顺次相互搭接粘贴的样品垫(2)、第一结合垫(3)、第二结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)及吸收垫(6)，所述的硝酸纤维素膜(5)上设有一条预先包被羊抗鼠IgG抗体的质控线(8)，硝酸纤维素膜(5)上还设有与上述质控线(8)平行的检测线(7)，检测线(7)上包被有能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的抗体，所述的第一结合垫(3)涂覆有金标链霉亲和素，所述的金标链霉亲和素可以与金标生物素化抗体特异结合，所述的第二结合垫(4)涂覆有金标生物素化抗体，所述的金标生物素化抗体是能与待测人骨代谢标志物抗原特异结合的抗体。
2. 根据权利要求1所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的抗体为能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的单克隆抗体。
3. 根据权利要求2所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述的检测线(7)为包被抗人骨代谢标志物单克隆抗体。
4. 根据权利要求2所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述的金标生物素化抗体为胶体金标记的生物素化单克隆抗体。
5. 根据权利要求1所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述金标链霉亲和素制备方法为：取胶体金溶液，使用碳酸钾溶液调节pH值；加入链霉亲和素；室温下孵育15min后加入PEG-20000；混匀后离心、重悬，4℃保持备用。
6. 根据权利要求1所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述的金标生物素化抗体制备方法为：取胶体金溶液，使用碳酸钾溶液 调节pH值；加入抗人骨代谢标志物单克隆抗体；缓慢搅拌；4℃孵育；加入3’端生物素化单链核苷酸；4℃孵育；加入PEG-20000；混匀后离心、重悬，4℃保持备用。
7. 一种应用权利要求1-6任一项所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条以及包裹所述试纸条的卡塞(201)，所述卡塞(201)进一步包括面板(202)和底板(203)，所述面板(202)上设置有观察槽(204)和加样口(205)，所述加样口(205)开口于所述样品垫(2)上部，并露出部分或全部所述样品垫(2)，所述观察槽(204)开口于所述硝酸纤维素膜上侧，并露出全部所述的检测线(7)和质控线(8)。
8. 根据权利要求7所述的检测装置，其特征在于，所述卡塞(201)的面板(202)和底板(203)采用高密度聚乙烯材料制成。”
驳回决定主要认为：1. 权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）权利要求1要求保护的是双胶体金试纸条，包括两个结合垫、第一结合垫涂覆有金标链霉亲和素，第二结合垫涂覆有金标生物素化的能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的抗体；（2）权利要求1中试纸条具有底衬结构，底衬上顺次相互搭接粘贴的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、硝酸纤维素膜及吸收垫。对于区别（1），对比文件2给出了在试纸条上设置相互连接的两个金标垫，一个固定有金标亲和素，另一个固定有金标生物素化抗体，利用生物素-亲和素亲和力强以及纳米金颗粒的信号增大效应，可大大提高检测灵敏度的教导。在面对如何增强人骨代谢标志物检测用试纸的纳米金颗粒信号以提高检测灵敏度这一技术问题时，本领域技术人员有动机采用相同的结合垫设置，从而在试纸条上设置两个结合垫，第一结合垫涂覆金标亲和素，第二结合垫涂覆有金标生物素化的能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的抗体，构成人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条。链霉亲和素是常用的亲和素。对于区别（2），对比文件2公开了基于单克隆抗体的吡虫啉检测金放大试纸条，包括衬板，衬板的一面自上而下依次黏贴吸水纸、检测到、金标垫1（放大）、金标垫2（检测）和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接。因此，相对于对比文件1和对比文件2以及公知常识的结合，权利要求1不具备创造性。2. 对于从属权利要求2-5，其附加技术特征是所属领域常规技术手段，因此也不具备创造性。3. 对于权利要求6，对比文件3采用了金标生物素结合物垫、链霉亲和素-金-抗体结合物垫，链霉亲和素-金-抗体结合物垫直接涂覆链霉亲和素和抗体两者，链霉亲和素与抗体不偶联。此外，制备胶体金偶联物的方法是本领域常规的，3’端生物素单链核苷酸常用于金颗粒表面生物素标签的固定，具体的制备方法是本领域技术人员采用常用技术手段能够选择和调整的，因此权利要求6也不具备创造性。4. 权利要求7要求保护一种应用权利要求1-6任一项所述的认股代谢标志物检测用双胶体金试纸条的检测装置，对比文件1进一步公开了具有观察槽和加样口的卡塞结构。此外，包括面板和底板的卡塞，加样口开口与样品垫上部并露出部分或全部样品垫是常规选择。因此引用权利要求1-6任一项的权利要求7也不具备创造性。5. 从属权利要求8的附加特征属于常规选择，因此权利要求8也不具备创造性。
申请人吕炜锋（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2019年04月12日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书的全文修改替换页。修改涉及：在驳回决定所依据文本的基础上，将权利要求2和3的附加技术特征加入权利要求1，并相应修改其他权利要求的序号和引用关系。修改后权利要求书共包括权利要求1-6项，其具体内容如下：
“1. 人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，包括试纸条底衬(1)、样品垫(2)、第一结合垫(3)、第二结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)及吸收垫(6)，其特征在于，所述试纸条底衬(1)上顺次相互搭接粘贴的样品垫(2)、第一结合垫(3)、第二结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)及吸收垫(6)，所述的硝酸纤维素膜(5)上设有一条预先包被羊抗鼠IgG抗体的质控线(8)，硝酸纤维素膜(5)上还设有与上述质控线(8)平行的检测线(7)，检测线(7)上包被有能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的抗体，所述的第一结合垫(3)涂覆有金标链霉亲和素，所述的金标链霉亲和素可以与金标生物素化抗体特异结合，所述的第二结合垫(4)涂覆有金标生物素化抗体，所述的金标生物素化抗体是能与待测人骨代谢标志物抗原特异结合的抗体；
所述能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的抗体为能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的单克隆抗体；
所述的检测线(7)为包被抗人骨代谢标志物单克隆抗体。
2. 根据权利要求1所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述的金标生物素化抗体为胶体金标记的生物素化单克隆抗体。
3. 根据权利要求1所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述金标链霉亲和素制备方法为：取胶体金溶液，使用碳酸钾溶液调节pH值；加入链霉亲和素；室温下孵育15min后加入PEG-20000；混匀后离心、重悬，4℃保持备用。
4. 根据权利要求1所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述的金标生物素化抗体制备方法为：取胶体金溶液，使用碳酸钾溶液调节pH值；加入抗人骨代谢标志物单克隆抗体；缓慢搅拌；4℃孵育；加入3’端生物素化单链核苷酸；4℃孵育；加入PEG-20000；混匀后离心、重悬，4℃保持备用。
5. 一种应用权利要求1-4任一项所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条以及包裹所述试纸条的卡塞(201)，所述卡塞(201)进一步包括面板(202)和底板(203)，所述面板(202)上设置有观察槽(204)和加样口(205)，所述加样口(205)开口于所述样品垫(2)上部，并露出部分或全部所述样品垫(2)，所述观察槽(204)开口于所述硝酸纤维素膜上侧，并露出全部所述的检测线(7)和质控线(8)。
6. 根据权利要求5所述的检测装置，其特征在于，所述卡塞(201)的面板(202)和底板(203)采用高密度聚乙烯材料制成。”
复审请求人认为：1. 对比文件1试纸条仅包括一个结合垫，无法达到本申请提高检测灵敏度的效果。对比文件1没有相邻各垫的具体连接方式，不如本申请具体。对比文件2检测的是吡虫啉，与人骨代谢标志物在分子结构、空间位阻等性质上有巨大差异，检测原理和难度也大不相同。对比文件2使用竞争法，本申请使用双抗体夹心法。对比文件2的可视检测限为5ng/ml，本申请的分析灵敏度为0.5ng/ml。2. 对比文件2中生物素标记是直接连接在抗体上，生物素标记的抗体与胶体金偶联，至少需要分为两步，本申请仅需一步制备。两个方案中生物素标签试剂的偶联对象是不同的，胶体金颗粒的尺寸远大于抗体，拥有更多的生物素结合位点，生物素直接标记抗体可能会造成部分抗体的变性，造成抗原抗体结合能力的降低。对比文件3用链霉亲和素标记胶体金-抗体，可能会遮盖抗体的结合位点，链霉亲和素分子可能与抗体竞争与胶体金颗粒结合的位点。本申请中生物素分子很小，并且使用生物素化单链核苷酸作为生物素化试剂，减小了位阻效应。本申请的金标生物素化抗体制备方法，是经过反复实验得到的，制备时加入的溶液，各组分加入的次序和时机、制备的混匀、离心、重悬步骤，以及制备完成后的保存温度，都是本申请创造性的体现。3. 本申请的创造性还体现在能够达到以下积极效果：可以用来检测人骨代谢标志物液体样品，将全血、血浆或血清滴加在样品垫上，将试纸条放入与其配套的金标定量阅读仪中，反应10分钟后，通过金标定量阅读仪得出检测结果。通过金标链霉亲和素和金标生物素化抗体放大胶体金产生的信号，达到提高检测灵敏度的目的；检测结果准确，快速，操作简便，可以广泛用于骨质疏松诊断和药物治疗效果的评价。本申请还以人骨代谢标志物中的一种标志物人血清骨钙素为例对试纸条进行检测实验。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年04月22日依法受理了该复审请求，并将本案转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局依法成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年10月21日向复审请求人发出复审通知书，指出：1. 权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）权利要求1的试纸条包含两个结合垫，第一结合垫涂覆有金标链霉亲和素，第二结合垫涂覆有金标生物素化抗体；（2）权利要求1中的试纸具有底衬，抗体为单克隆抗体。对于区别（1），对比文件2给出了技术启示：设置两个依次连接的结合垫，其中一个设置金标亲和素，另一个设置金标生物素化的待测物抗体，利用生物素-亲和素和纳米金颗粒的信号增大效应来提高传统试纸条的灵敏度。链霉亲和素属于常用的亲和素，两个结合垫的具体前后位置，本领域技术人员能够合理预期两种前后位置的选择能够起到的技术效果是一致的。对于区别（2），对比文件2公开了衬板以及在衬板上依次粘贴试纸条的各部件。单克隆抗体属于常规选择。因此，权利要求1相对于对比文件1和对比文件2以及公知常识的结合不具备创造性。2. 权利要求2和3的附加技术特征被对比文件2公开或属于公知常识，因此也不具备创造性。3. 对于权利要求4，对比文件2公开了纳米金-抗体-生物素标签的合成方法，对比文件3给出了通过一步法将抗体和链霉亲和素分别标记在胶体金上的技术启示，在对比文件2已经公开了金标生物素抗体作为放大体系中标记抗体的前提下，在需要制备该复合物时，本领域技术人员有动机采用对比文件3中的制备方法，将生物素和抗体同时标记在胶体金上，从而能够获得一步完成标记胶体金的技术效果。此外，通过单链核苷酸将生物素标记在胶体金上是本领域公知常识。至于在核苷酸3’端连接生物素、胶体金标记物中加入PEG20000、在4℃孵育及保存胶体金标记物等均属于常规选择。4. 独立权利要求5要求保护一种应用权利要求1-4任一项所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条的检测装置，对比文件1进一步公开了卡塞结构，包括面板和底板的卡塞属于常规结构，因此引用权利要求1-4任一项的权利要求5不具备创造性。5. 从属权利要求6的附加技术特征属于常规选择，因此也不具备创造性。复审通知书还针对复审请求人的陈述意见作了答复。
复审请求人于2019年10月30日提交了意见陈述书和权利要求书的全文替换页。权利要求书的修改涉及：在复审通知书所依据的审查文本基础上，将权利要求2的附加技术特征加入权利要求1，删除权利要求2，并相应调整其他权利要求序号和引用关系。修改后，权利要求书共包括权利要求1-5项，其内容为：
“1. 人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，包括试纸条底衬(1)、样品垫(2)、第一结合垫(3)、第二结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)及吸收垫(6)，其特征在于，所述试纸条底衬(1)上顺次相互搭接粘贴的样品垫(2)、第一结合垫(3)、第二结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)及吸收垫(6)，所述的硝酸纤维素膜(5)上设有一条预先包被羊抗鼠IgG抗体的质控线(8)，硝酸纤维素膜(5)上还设有与上述质控线(8)平行的检测线(7)，检测线(7)上包被有能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的抗体，所述的第一结合垫(3)涂覆有金标链霉亲和素，所述的金标链霉亲和素可以与金标生物素化抗体特异结合，所述的第二结合垫(4)涂覆有金标生物素化抗体，所述的金标生物素化抗体是能与待测人骨代谢标志物抗原特异结合的抗体；
所述能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的抗体为能与待测人骨代谢标志物抗原特异性结合的单克隆抗体；
所述的检测线(7)为包被抗人骨代谢标志物单克隆抗体；
所述的金标生物素化抗体为胶体金标记的生物素化单克隆抗体。
2. 根据权利要求1所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述金标链霉亲和素制备方法为：取胶体金溶液，使用碳酸钾溶液调节pH值；加入链霉亲和素；室温下孵育15min后加入PEG-20000；混匀后离心、重悬，4℃保持备用。
3. 根据权利要求1所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，其特征在于，所述的金标生物素化抗体制备方法为：取胶体金溶液，使用碳酸钾溶液调节pH值；加入抗人骨代谢标志物单克隆抗体；缓慢搅拌；4℃孵育；加入3’端生物素化单链核苷酸；4℃孵育；加入PEG-20000；混匀后离心、重悬，4℃保持备用。
4. 一种应用权利要求1-3任一项所述的人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条以及包裹所述试纸条的卡塞(201)，所述卡塞(201)进一步包括面板(202)和底板(203)，所述面板(202)上设置有观察槽(204)和加样口(205)，所述加样口(205)开口于所述样品垫(2)上部，并露出部分或全部所述样品垫(2)，所述观察槽(204)开口于所述硝酸纤维素膜上侧，并露出全部所述的检测线(7)和质控线(8)。
5. 根据权利要求4所述的检测装置，其特征在于，所述卡塞(201)的面板(202)和底板(203)采用高密度聚乙烯材料制成。”
复审请求人认为：1. 修改后的权利要求1与对比文件解决的技术问题不同，权利要求1解决的技术问题是，临床上使用电化学免疫法和ELISA法检测骨代谢标志物，检测时间长，操作复杂；并且本申请是进行骨代谢的检测，与对比文件1检测的骨钙素不是同种物质。2. 本申请的试纸条包括底衬以及硝酸纤维素膜，设置有两层结合垫，这是对比文件1不具备的。对比文件1试纸条仅包括一个结合垫，只公开了试纸条具有样品垫、与样品垫相连的结合垫、与结合垫相连的信号垫和与信号垫相连的吸收垫，没有相邻各垫的具体连接方式。3. 对比文件2检测的是吡虫啉，本申请中的人骨代谢标志物为生物大分子，在分子结构、空间位阻等性质上有巨大差异，检测原理和难度也大不相同，解决的技术问题不同，采用的技术方案与达到的技术效果也不相同。对比文件2使用竞争法，而本申请使用双抗体夹心法。对比文件2的可视检测限为5ng/ml，本申请的分析灵敏度为0.5ng/ml。4. 对比文件2中生物素标记是直接连接在抗体上，生物素标记的抗体与胶体金偶联，至少需要分为两步，本申请仅需一步制备。两个方案中生物素标签试剂的偶联对象是不同的，胶体金颗粒的尺寸远大于抗体，拥有更多的生物素结合位点，生物素直接标记抗体可能会造成部分抗体的变性，造成抗原抗体结合能力的降低。对比文件3用链霉亲和素标记胶体金-抗体，可能会遮盖抗体的结合位点，链霉亲和素分子可能与抗体竞争与胶体金颗粒结合的位点。本申请中生物素分子很小，并且使用生物素化单链核苷酸作为生物素化试剂，减小了位阻效应。本申请的金标生物素化抗体制备方法，是经过反复实验得到的，制备时加入的溶液，各组分加入的次序和时机、制备的混匀、离心、重悬步骤，以及制备完成后的保存温度，都是本申请创造性的体现。5. 本申请的创造性还体现在能够达到以下积极效果：可以用来检测人骨代谢标志物液体样品，将全血、血浆或血清滴加在样品垫上，将试纸条放入与其配套的金标定量阅读仪中，反应10分钟后，通过金标定量阅读仪得出检测结果。通过金标链霉亲和素和金标生物素化抗体放大胶体金产生的信号，从而达到提高检测灵敏度的目的；检测结果准确，快速，操作简便，可以广泛用于骨质疏松诊断和药物治疗效果的评价。本申请还以人骨代谢标志物中的一种标志物人血清骨钙素为例对试纸条进行检测实验。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，依法作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
在复审程序中，复审请求人于2019年10月30日提交了最终的权利要求书的全文修改替换页，经审查，其中所作的修改符合专利法第33条及专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本决定以申请日即2016年08月30日提交的说明书第1-44段、说明书附图图1-图2、说明书摘要、摘要附图；2019年10月30日提交的权利要求书第1-5项为基础作出。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果一项权利要求与作为最接近现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，而这些区别技术特征可由本领域普通技术人员基于其他对比文件公开的内容并结合公知常识而得到，并且该权利要求的技术方案并没有由于这些区别技术特征而具有预料不到的技术效果，则该项权利要求相对于上述对比文件没有突出的实质性特点和显著的进步，不具有创造性。
具体到本案，
1. 权利要求1要求保护人骨代谢标志物检测用双胶体金试纸条，对比文件1公开了一种检测骨质疏松和骨转化率的试纸条（参见对比文件1说明书第8、19、21、26-27、37段），包括：样品垫，结合垫，信号检测垫，吸收垫；结合垫与样品垫一端相互交叠，固定有偶联至金纳米颗粒的第一抗体，第一抗体是骨钙素或CTX的抗体。信号检测垫与结合垫一端相互交叠，包含硝酸纤维素膜以及检测线和控制线，检测线固定有能够与骨钙素或CTX结合的第二抗体，质控线固定有羊抗鼠IgG抗体。
骨钙素与CTX均属于人骨代谢标志物；由对比文件1附图1可以看出，样品垫、结合垫、信号结合垫、吸收垫顺次相互搭接。权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）权利要求1的试纸条包含两个结合垫，第一结合垫涂覆有金标链霉亲和素，第二结合垫涂覆有金标生物素化单克隆抗体；而对比文件1仅含有一个结合垫，固定有金标抗体。（2）权利要求1中的试纸条具有底衬，检测线抗体为单克隆抗体。基于上述区别技术特征，权利要求1的技术方案实际解决的技术问题是如何提高试纸条的灵敏度。
对于区别（1），对比文件2公开了一种吡虫啉试纸条，包括衬板，衬板的一面自上而下依次黏贴吸水纸、检测垫、金标垫1(放大)、金标垫2 (检测)和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接。检测垫为硝酸纤维素膜，该膜自上而下设计1条质控线和3条检测线；质控线包被有兔抗鼠 IgG；检测线包被有吡虫啉包被半抗原-鸡卵清白蛋白偶联物；金标垫1(放大)为玻璃纤维素膜，喷涂有亲和素标记的纳米金颗粒；金标垫2(检测)为玻璃纤维素膜，喷涂有纳米金标记的抗吡虫啉单克隆抗体（参见对比文件2权利要求1）。对比文件2的实施例1中公开了纳米金标记的抗吡虫啉单克隆抗体为纳米金-抗体-生物素。对比文件2指出，利用生物素-亲和素亲和力强以及纳米金颗粒的信号增大效应，可大大提高检测灵敏度，与使用相同抗体的传统试纸条相比，灵敏度可提高10倍（参见对比文件2说明书第17段）。可见，对比文件2提供了这样的技术启示：设置两个依次连接的结合垫，其中一个设置金标亲和素，另一个设置金标生物素化的待测物抗体，利用生物素-亲和素和纳米金颗粒的信号增大效应来提高传统试纸条的灵敏度。那么，在对比文件1公开的试纸条结构的基础上，当面临如何提高灵敏度这样的技术问题时，本领域技术人员有动机采用上述信号放大体系，将结合垫设置为两个，其中一个设置金标亲和素，另一个设置金标生物素化的骨钙素抗体。此外，链霉亲和素属于常用的亲和素。至于两个结合垫的具体前后位置，本领域技术人员能够合理预期两种前后位置的选择能够起到的技术效果是一致的。
对于区别（2），对比文件2公开了衬板以及在衬板上依次粘贴试纸条的各部件。对于抗体，单克隆抗体属于免疫检测领域的常规选择。
复审请求人认为：（1）权利要求1解决的技术问题是，临床上使用电化学免疫法和ELISA法检测骨代谢标志物，检测时间长，操作复杂；对比文件1-2解决的技术问题与本申请不同；并且本申请是进行骨代谢物的检测，与对比文件1检测的骨钙素不是同种物质。（2）本申请的试纸条包括底衬以及硝酸纤维素膜，设置有两层结合垫，这是对比文件1不具备的。对比文件1试纸条仅包括一个结合垫，只公开了试纸条具有样品垫、与样品垫相连的结合垫、与结合垫相连的信号垫和与信号垫相连的吸收垫，而没有相邻各垫的具体连接方式。（3）对比文件2检测的是吡虫啉，与人骨代谢标志物在分子结构、空间位阻等性质上有巨大差异，检测原理和难度也大不相同，解决的技术问题不同，采用的技术方案与达到的技术效果也不相同。对比文件2使用竞争法，而本申请使用双抗体夹心法。对比文件2的可视检测限为5ng/ml，本申请的分析灵敏度为0.5ng/ml。（4）本申请的创造性还体现在能够达到以下积极效果：可以用来检测人骨代谢标志物液体样品，将全血、血浆或血清滴加在样品垫上，将试纸条放入与其配套的金标定量阅读仪中，反应10分钟后，通过金标定量阅读仪得出检测结果。通过金标链霉亲和素和金标生物素化抗体放大胶体金产生的信号，从而达到提高检测灵敏度的目的；检测结果准确，快速，操作简便，可以广泛用于骨质疏松诊断和药物治疗效果的评价。本申请还以人骨代谢标志物中的一种标志物人血清骨钙素为例对试纸条进行检测实验。
对此，合议组认为：
对于第（1）点和第（3）点，对比文件1-2均是通过免疫层析试纸对待测物检测，均解决了检测时间长、操作复杂的技术问题。并且，对比文件1中检测的骨钙素是人骨代谢标志物之一，本申请的实施例也是以骨钙素为例进行检测的。在针对权利要求1的评述中，以对比文件1作为最接近的现有技术，“提高试纸条的灵敏度”是基于本申请权利要求1与该最接近的现有技术的区别认定的发明实际解决的技术问题，此时，创造性的评判，关键是要看现有技术是否给出了技术启示，使得本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进最接近的现有技术。如前所述，对比文件2给出了如何提高试纸条灵敏度的技术启示。对比文件2的待测物以及免疫反应形式虽然与本申请待测物不同，但是与本申请以及对比文件1同属于免疫层析试纸领域，并且都是基于抗原-抗体反应对待测物进行检测。当面临如何提高试纸条灵敏度的技术问题时，本领域技术人员显然有动机在相同的技术领域内寻找解决手段，基于对比文件2给出的教导，本领域技术人员有动机在对比文件1所公开的试纸中采用对比文件2所述的信号放大体系。至于夹心法和竞争法均是免疫层析试纸中根据待测物不同而选择的常规方法（参见Elsevier出版社2014年出版的系列技术手册《Comprehensive Analytic Chemistry》中Lourdes Rivas等人所编写的第14章“基于金纳米颗粒的侧流传感器”第572页图2“侧流分析的典型形式”）。关于灵敏度，对比文件2与本申请的待测物不同，读取结果的方式不同，因此无法直接比较二者的灵敏度孰优孰劣。《Comprehensive Analytic Chemistry》一书第580页列出了多种侧流装置检测蛋白质的最低检测限，不同待测物的检测限如0.01ng/ml、200pg/ml、1ng/ml、1.5 ng/ml、5ng/ml等，可见本申请获得的0.5ng/ml的灵敏度在常规范围内，并非本领域技术人员预料之外的技术效果。
对于第（2）点，对比文件1说明书第24段记载了信号检测垫包含硝酸纤维素膜以及检测线和控制线；说明书第19段、24段分别记载了结合垫与样品垫相互交叠、信号检测垫与结合垫相互交叠，根据图1可以看出信号检测垫与吸水垫相互交叠，也就是说对比文件1公开了相邻各垫的具体连接方式。对于底衬，对比文件2给出了在衬板上依次粘贴试纸条的各部件的技术启示。
对于第（4）点，对比文件1已经公开了检测人骨钙素的试纸条，能够检测血液等液体样品（参见对比文件1说明书第44段）。快速、操作简便、反应10min、能够通过金标阅读仪来读取结果均是试纸条所具有的公知的效果。对比文件2已经给出了通过金标亲和素和金标生物素化抗体来提高试纸条灵敏度的技术启示。可见本申请并未获得本领域技术人员预料不到的技术效果。
综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及所属领域公知常识获得权利要求1的技术方案对于本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
2. 从属权利要求2对金标链霉亲和素的制备方法作了进一步限定，对比文件2公开了亲和素标记的纳米金颗粒（参见对比文件2权利要求1，说明书第31段）。对于标记纳米金颗粒的制备方法，在免疫检测领域属于公知的技术手段，例如唐秋艳等人主编、海洋出版社于2008年9月出版的《免疫诊断试剂实用技术》一书第6章“胶体金免疫技术”中披露了“最为常用的标记步骤”：用0.1mol/L K2CO3调节金溶胶至所需pH，加入最佳标记量的蛋白质溶液，搅拌2-3min，加入PEG 20000溶液，离心，吸去上清液，将沉淀悬浮于含PEG20000的缓冲液中，置4℃保存。该书籍中还例举了标记物是链霉亲和素时的pH和离心参数。此外，本领域技术人员具备调整孵育时间这样的细节参数的常规试验能力。可见，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域公知常识获得权利要求2的技术方案对于本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求2不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
3. 权利要求3引用权利要求1，对金标生物素化抗体的制备方法做了进一步限定。对比文件2公开了纳米金-抗体-生物素标签的合成方法（参见对比文件2说明书第27段）：用0.2M的K2CO3调整纳米金溶液的pH值至9.0，在快速搅拌胶体金的同时，按照特定比例逐滴加入抗吡虫啉抗体-生物素标签，并在室温下孵育1小时。孵育后，反应液中加入10%的BSA溶液，并持续搅拌5分钟，搅拌停止后，继续在室温下孵育1小时。孵育后，离心，重悬。虽然，对比文件2制备金标生物素抗体的方法是将生物素化抗体标记在胶体金上，而本申请权利要求3中是将生物素和抗体均标记在胶体金上，但是对比文件3公开了一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条，其所包含的链霉亲和素-金-抗体结合物垫的制备包括：调节胶体金溶液的pH值，然后加入甲流标记抗体和链霉亲和素，在室温下震荡反应，然后加入BSA封闭多余位点，反应并离心后，取得上清液，将沉淀物进行恢复，将其涂覆在玻璃纤维膜上面（参见对比文件3权利要求1和6）。可见，对比文件3给出了通过一步法将抗体和链霉亲和素分别标记在胶体金上的技术启示。在对比文件2已经公开了金标生物素抗体作为放大体系中标记抗体的前提下，在需要制备该复合物时，本领域技术人员有动机采用对比文件3中的制备方法，将生物素和抗体同时标记在胶体金上，从而能够获得一步完成标记胶体金的技术效果。此外，通过单链核苷酸将生物素标记在胶体金上是本领域公知常识，例如Elsevier出版社2014年出版的系列技术手册《Comprehensive Analytic Chemistry》中Lourdes Rivas等人所编写的第14章“基于金纳米颗粒的侧流传感器”披露了一种检测肌钙蛋白I和肌红蛋白的侧流方法，采用双标记金纳米颗粒复合物，其中以生物素化单链DNA连接两种不同大小的金纳米颗粒（参见该文献第581页第3段）。因此，本领域技术人员有动机将单链核苷酸作为生物素和金纳米颗粒的间隔臂用于制备生物素和抗体标记的胶体金。至于在核苷酸3’端连接生物素、胶体金标记物中加入PEG20000、在4℃孵育及保存胶体金标记物等均属于常规选择，而且本申请说明书中也没有实验数据可以证实上述制备步骤的采用可以带来预料不到的检测效果。
复审请求人认为：对比文件2中生物素标记是直接连接在抗体上，生物素标记的抗体与胶体金偶联，至少需要分为两步，本申请仅需一步制备。两个方案中生物素标签试剂的偶联对象是不同的，胶体金颗粒的尺寸远大于抗体，拥有更多的生物素结合位点，生物素直接标记抗体可能会造成部分抗体的变性，造成抗原抗体结合能力的降低。对比文件3用链霉亲和素标记胶体金-抗体，可能会遮盖抗体的结合位点，链霉亲和素分子可能与抗体竞争与胶体金颗粒结合的位点。本申请中生物素分子很小，并且使用生物素化单链核苷酸作为生物素化试剂，减小了位阻效应。本申请的金标生物素化抗体制备方法，是经过反复实验得到的，制备时加入的溶液，各组分加入的次序和时机、制备的混匀、离心、重悬步骤，以及制备完成后的保存温度，都是本申请创造性的体现。对此，合议组认为：
对比文件3提供了这样的技术启示：在胶体金溶液中加入链霉亲和素和抗体，仅需一步即可制备得到亲和素、抗体标记的胶体金。在对比文件2公开了以金标生物素抗体作为放大体系中标记抗体的前提下，在需要制备该复合物时，本领域技术人员有动机采用对比文件3中的制备方法，将生物素和抗体同时标记在胶体金上，从而能够获得一步完成标记胶体金的技术效果。此外，在生物素分子上连接连接臂以使其与大分子或固相载体结合后不受位阻效应的影响，这属于本领域的公知常识（参见汪世华主编、军事医学科学出版社2008年出版的《抗体技术》一书第19页）。至于使用单链核苷酸作为生物素与胶体金的连接臂，如前所述，这也属于本领域的公知常识。
对于具体的步骤，对比文件2已经公开了用K2CO3调整纳米金溶液的pH值、加入标记物、孵育、加入保护剂后搅拌、离心、重悬等步骤。对比文件3也公开了调节胶体金溶液的pH值、加入甲流标记抗体和链霉亲和素、反应、加入BSA、反应、离心、恢复等步骤，这些与权利要求3的步骤都是相对应的。此外，4℃孵育和保存均属常规选择；PEG20000也是常用的胶体金标记物的保护剂（参见唐秋艳等人主编、海洋出版社于2008年9月出版的《免疫诊断试剂实用技术》一书第6章“胶体金免疫技术”披露的“最为常用的标记步骤”中即加入PEG20000作为保护剂）。此外，本申请说明书中也没有试验数据显示权利要求3的细节参数起到了本领域技术人员预料不到的技术效果。
可见，在对比文件1的基础上结合对比文件2、3以及本领域公知常识获得权利要求3的技术方案对于本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求3不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
4. 权利要求4要求保护一种应用权利要求1-3任一项所述的人骨代谢标志物检测用双标胶体金试纸条的检测装置。对比文件1也公开了安装有试纸条的诊断盒，由对比文件1图3可以看出，试纸位于包裹其的卡塞中，卡塞面板上设置有将样品滴加在样品垫上的加样口，和露出全部检测线和质控线的窗口（参见对比文件1说明书第47段，附图图3）。此外，包括面板和底板的卡塞是固定试纸条的常规结构。此外，根据前面的评述可知，权利要求1-3要求保护的试纸条不具备创造性。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2和公知常识，或者结合对比文件2和3和公知常识得到权利要求4的技术方案，对于本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求4不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
5. 从属权利要求5引用权利要求4，对卡塞的面板和底板材料作了进一步限定。而高密度聚乙烯材料是制备包装卡塞的常用材料。因此在其引用的权利要求4不具备创造性的情况下，权利要求5也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
综上所述，本申请权利要求1-5不符合专利法第22条第3款的规定。
基于上述理由，合议组依法作出以下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2019年01月14日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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