发明创造名称：失活和提取耐酸细菌以用于使用质谱分析法表征和/或鉴定的方法
外观设计名称：
决定号：201152
决定日：2020-01-17
委内编号：1F234913
优先权日：
申请（专利）号：201380025243.4
申请日：2013-05-15
复审请求人：生物梅里埃有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：刘红霞
合议组组长：安玉苹
参审员：张丽颖
国际分类号：C12Q1/24,G01N33/569,G01N33/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：评价一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别技术特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中存在这种启示，并且所获得的发明的技术效果是可以预期的，则该发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380025243.4，名称为“失活和提取耐酸细菌以用于使用质谱分析法表征和/或鉴定的方法”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为生物梅里埃有限公司。本申请的申请日为2013年05月15日，最早优先权日为2012年05月17日，公开日为2015年01月14日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年07月07日以本申请权利要求1-17不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：2014年11月14日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书第1-14页（即第1-61段）、说明书附图第1-2页、说明书摘要、摘要附图，以及2017年03月27日提交的权利要求书第1-17项。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种用于失活和提取测试样品中的耐酸细菌的方法，所述方法包括以下连续步骤：
(a)从包含耐酸细菌的固体或半固体培养基中获得测试样品，并将所述测试样品悬浮于包含乙醇和珠的容器中；
(b)珠磨所述容器以打碎所述容器中的团块和/或破坏所述容器中的耐酸细菌细胞；
(c)随后通过在室温下温育所述悬浮液至少约10分钟失活所述测试样品中包含的耐酸细菌细胞；
(d)离心所述容器以沉淀所述耐酸细菌样品并除去上清液；
(e)重悬耐酸细菌沉淀于甲酸中；以及
(f)随后通过将乙腈加入至所述容器中从失活的细胞提取细胞蛋白，
其中所述甲酸和乙腈从所述失活的细胞提取并溶解细胞蛋白。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下另外的连续步骤：
(g)离心所述容器以沉淀来自步骤(f)的失活的耐酸细菌并随后将上清液的等分试样转移至质谱分析法的靶载玻片并将基质溶液加入至所述上清液；以及
(h)通过质谱分析法询问所述质谱分析法的靶载玻片上的测试样品以获得所述耐酸细菌的一种或更多种质谱，并且通过将所获得的一种或更多种质谱与一种或更多种参考质谱比较来表征和/或鉴定所述测试样品中的所述耐酸细菌。
3. 如权利要求1所述的方法，其中所述耐酸细菌为分枝杆菌属(Mycobacteria)或诺卡氏菌属(Nocardia)。
4. 如权利要求1所述的方法，其中将来自步骤(d)的上清液直接或作为水悬浮液，应用至质谱分析法的载玻片。
5. 如权利要求1所述的方法，其中所述容器包含70％乙醇。
6. 如权利要求1所述的方法，其中所述珠是0.5mm玻璃珠。
7. 如权利要求1所述的方法，其中在步骤(e)中将沉淀重悬于70％甲酸中。
8. 如权利要求1所述的方法，其中加入乙腈至从约35％至约65％的终浓度。
9. 如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括珠磨步骤(b)中的容器约1分钟至约30分钟。
10. 如权利要求1所述的方法，其中在步骤(e)中将所述沉淀重悬于至少约3μL的甲酸中。
11. 如权利要求1所述的方法，其中在步骤(f)中将至少约3μL乙腈加入至重悬的沉淀。
12. 如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(f)之后离心所述容器中的测试样品。
13. 如权利要求2所述的方法，其中所述基质溶液包含α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。
14. 如权利要求2所述的方法，其中将所述耐酸细菌鉴定至属、种和/或菌株水平。
15. 一种用于失活和提取来自固体或半固体培养基中的耐酸细菌以及随后表征和/或鉴定所述耐酸细菌的方法，所述方法包括以下连续步骤：
(a)从包含耐酸细菌的固体或半固体培养基中获得测试样品，并将所述测试样品悬浮于包含70％乙醇和0.5mm玻璃珠的容器中；
(b)珠磨所述容器以打碎所述容器中的团块和/或破坏所述容器中的耐酸细菌细胞；
(c)随后通过在室温下温育所述悬浮液至少约10分钟失活所述测试样品中包含的耐酸细菌细胞；
(d)离心所述容器以沉淀所述耐酸细菌并除去所述上清液；
(e)将耐酸细菌沉淀重悬于至少3μL甲酸中；
(f)通过将至少3μL乙腈加入至所述容器中从失活的细胞提取细胞蛋白，其中所述甲酸和乙腈从所述失活的细胞提取并溶解细胞蛋白；
(g)离心所述容器以沉淀来自步骤(f)的失活的耐酸细菌并随后将上清液的等分试样转移至质谱分析法的靶载玻片并将基质溶液加入至所述上清液；以及
(h)通过质谱分析法询问所述质谱分析法的靶载玻片上的测试样品以获得所述耐酸细菌的一种或更多种质谱，并且通过将所获得的质谱与一种或更多种参考质谱比较来表征和/或鉴定所述耐酸细菌。
16. 如权利要求15所述的方法，其中所述耐酸细菌为分枝杆菌属或诺卡氏菌属。
17. 如权利要求15或16所述的方法，其中将所述耐酸细菌鉴定至科、属、种和/或菌株水平。”
驳回决定认为，对比文件1（“Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice”，Amel等，PLOSONE，第6卷，第9期，第1-7页，公开日2011年09月30日）公开了一种使用MALDI-TOF质谱检测分枝杆菌的方法，权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1中在失活分枝杆菌时使用了珠磨所述容器以打碎所述容器中的团块和/或破坏所述容器中的耐酸细菌细胞且公开了加入乙腈的目的是从失活的细胞提取细胞蛋白，甲酸和乙腈从所述失活的细胞提取并溶解细胞蛋白，而对比文件1在失活分枝杆菌后菌体蛋白提取时使用玻璃珠和涡旋。由于对比文件1公开了使用70%乙醇失活分枝杆菌以及使用玻璃珠和涡旋震荡完成蛋白提取的技术内容，为获得更好的失活效果，本领域技术人员容易想到在失活时也进行玻璃珠磨以充分打碎菌体团块和破坏菌体细胞。对比文件1还公开了离心后取沉淀重悬于5-50μl的70%甲酸和5-50μl的100%乙腈进而进行质谱的技术内容，因而本领域技术人员容易想到乙腈和甲酸可以从失活的细胞提取并溶解细胞蛋白，离心后去除上清液是本领域技术人员的常规技术手段。最后，本申请也没有公开有效的实验数据证明所述方法的技术效果。因此权利要求1不具有创造性。基于同样的理由，权利要求15也不具有创造性。从属权利要求2-14、16-17的附加技术特征或者被对比文件1公开，或者属于本领域技术人员的常规选择，因此也不具有创造性。
申请人生物梅里埃有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2017年10月19日向国家知识产权局提出了复审请求，没有修改申请文件。复审请求人提交了如下附件：
附件1：W.Michael Dunne等，“Rapid inactivation of Mycobacterium and Nocardia species before identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry”, Journal of Clinical Microbiology,第52卷，第3654-3659页，2014年10月，英文复印件共6页。
复审请求人认为：对比文件1没有公开或教导将珠磨与乙醇中的温育组合使用或在乙醇中的温育之前使用珠磨以用于失活耐酸细菌。在对比文件1中，来自用70%乙醇失活的分枝杆菌的质谱的分辨率是非常低的，因此对比文件1教导针对热失活的分枝杆菌使用质谱。与对比文件1不同的是，本申请通过将珠磨与乙醇中的温育组合使用或在乙醇中的温育之前组合使用珠磨失活耐酸细菌之后，能够成功地鉴定耐酸细菌例如分枝杆菌。附件1证明了本申请的效果，即在乙醇温育之前进行珠磨，相较于乙醇温育之后进行珠磨可得到均匀的失活。因此本申请所述方法采用了特定顺序取得了预料不到的技术效果，本申请具有创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年02月01日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年05月28日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1相比，区别技术特征在于：权利要求1中在失活耐酸细菌细胞时使用了珠磨所述容器以打碎所述容器中的团块和/或破坏所述容器中的耐酸细菌细胞，对比文件1是在失活分枝杆菌时使用吐温20防止细菌细胞聚集成团。权利要求1相对于对比文件1实际要解决的技术问题是提供一种破坏细胞团块的替换方式。对比文件1公开了分枝杆菌细胞容易聚集成团，从而阻碍MALDI-TOF质谱检测分析，因此对比文件1中采用吐温20来打破细胞成团，对比文件1还公开了破碎细胞壁也是提取分枝杆菌蛋白的关键步骤。同时，本领域公知，珠磨是非常有效的一种细胞物理破碎法（参见公知常识证据1：《生化工程》（第二版），伦世仪主编，中国轻工业出版社，2008年02月出版，第244页），为了克服化学试剂吐温20带来的污染从而增加分离纯化步骤，本领域技术人员容易想到用珠磨代替吐温20，通过破坏细胞壁来阻止细胞团块生成，因此权利要求1不具有创造性。从属权利要求2-14的附加技术特征或者被对比文件1公开，或者属于本领域技术人员的常规选择，因此也不具有创造性。结合针对权利要求1和2的评述意见，权利要求15不具有创造性，从属权利要求16-17的附加技术特征属于本领域技术人员结合对比文件1公开的内容可作出的常规选择，也不具有创造性。
复审请求人于2019年09月12日提交了意见陈述书以及权利要求书全文替换页（共2页12项），与复审通知书所针对的权利要求书相比，所作修改在于：将原权利要求2和5的附加技术特征并入权利要求1中；将权利要求1步骤（h）中的“质谱分析法”限定为“MALDI-TOF质谱法”；删除原权利要求2、5、15-17；适应性修改权利要求的编号和引用关系。修改后的权利要求1如下：
“1. 一种用于失活和提取测试样品中的耐酸细菌的方法，所述方法包括以下连续步骤：
(a)从包含耐酸细菌的固体或半固体培养基中获得测试样品，并将所述测试样品悬浮于包含70％乙醇和珠的容器中；
(b)珠磨所述容器以打碎所述容器中的团块和/或破坏所述容器中的耐酸细菌细胞；
(c)随后通过在室温下温育所述悬浮液至少约10分钟失活所述测试样品中包含的耐酸细菌细胞；
(d)离心所述容器以沉淀所述耐酸细菌样品并除去上清液；
(e)重悬耐酸细菌沉淀于甲酸中；
(f)随后通过将乙腈加入至所述容器中从失活的细胞提取细胞蛋白，
其中所述甲酸和乙腈从所述失活的细胞提取并溶解细胞蛋白；
(g)离心所述容器以沉淀来自步骤(f)的失活的耐酸细菌并随后将上清液的等分试样转移至质谱分析法的靶载玻片并将基质溶液加入至所述上清液；
(h)通过MALDI-TOF质谱分析法询问所述质谱分析法的靶载玻片上的测试样品以获得所述耐酸细菌的一种或更多种质谱；以及
(i)通过将所获得的一种或更多种质谱与一种或更多种参考质谱比较来鉴定所述测试样品中的所述耐酸细菌。”
复审请求人认为：对比文件1虽然使用了乙醇来灭活，但是对比文件1却发现了乙醇灭活的分枝杆菌不适于MALDI-TOF质谱分析法。在对比文件1的图1（a）中，仅存在两个峰，很明显的是这并不足以准确鉴定细菌。对比文件1不会促使本领域技术人员去使用70％乙醇来失活之后将要用MALDI-TOF质谱分析法来鉴定的分支杆菌。相比之下，本申请确定了在权利要求1中所采用的特定步骤失活了分支杆菌，并产生了可用于鉴定的分枝杆菌蛋白谱。因此权利要求1的技术方案是非显而易见的，具备创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审程序中，复审请求人于2019年09月12日提交了权利要求书的全文替换页（共3页12项）。经审查，所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审请求审查决定依据的文本为：2014年11月14日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书第1-14页（即第1-61段）、说明书附图第1-2页、说明书摘要、摘要附图，以及2019年09月12日提交的权利要求书第1-12项。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，评价一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别技术特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中存在这种启示，并且所获得的发明的技术效果是可以预期的，则该发明不具备创造性。
本案中，权利要求1要求保护一种用于失活和提取测试样品中的耐酸细菌的方法，所述方法包括以下连续步骤：(a)从包含耐酸细菌的固体或半固体培养基中获得测试样品，并将所述测试样品悬浮于包含70％乙醇和珠的容器中；(b)珠磨所述容器以打碎所述容器中的团块和/或破坏所述容器中的耐酸细菌细胞；(c)随后通过在室温下温育所述悬浮液至少约10分钟失活所述测试样品中包含的耐酸细菌细胞；(d)离心所述容器以沉淀所述耐酸细菌样品并除去上清液；(e)重悬耐酸细菌沉淀于甲酸中；(f)随后通过将乙腈加入至所述容器中从失活的细胞提取细胞蛋白，其中所述甲酸和乙腈从所述失活的细胞提取并溶解细胞蛋白；(g)离心所述容器以沉淀来自步骤(f)的失活的耐酸细菌并随后将上清液的等分试样转移至质谱分析法的靶载玻片并将基质溶液加入至所述上清液；(h)通过MALDI-TOF质谱分析法询问所述质谱分析法的靶载玻片上的测试样品以获得所述耐酸细菌的一种或更多种质谱；以及(i)通过将所获得的一种或更多种质谱与一种或更多种参考质谱比较来鉴定所述测试样品中的所述耐酸细菌。
对比文件1公开了一种使用MALDI-TOF质谱检测分枝杆菌的方法，包括失活和提取菌体蛋白步骤，从包含分枝杆菌的固体或液体培养基中获得样品，将所述样品溶于水和吐温-20,在95℃下热失活1小时，悬浮液水洗离心后，使用玻璃珠和HPLC水将菌体涡旋3分钟；离心后取沉淀重悬于5-50μl的70%甲酸和5-50μl的100%乙腈以提取细胞蛋白，将悬浮液离心取上清液，并将上清液转移至靶载玻片上，加入基质溶液，该基质溶液包括α-氰基-4-羟基肉桂酸，通过MALDI-TOF质谱检测分枝杆菌获得分枝杆菌的一种或更多种质谱，与参考质谱比较来表征和/或鉴定分枝杆菌，可鉴定到属、种等水平。作为细胞失活的替代方案，细胞失活也可采用在70%乙醇中处理10分钟（参见对比文件1摘要，第2-4页方法和结果部分，第5页讨论部分，图1，表2）。
权利要求1与对比文件1相比，区别技术特征在于：权利要求1中在失活耐酸细菌细胞时使用了珠磨所述容器以打碎所述容器中的团块和/或破坏所述容器中的耐酸细菌细胞，对比文件1是在失活分枝杆菌时使用吐温20防止细菌细胞聚集成团。因此，基于上述区别技术特征可以确定，权利要求1相对于对比文件1实际要解决的技术问题是提供一种破坏细胞团块的替换方式。
对比文件1公开了分枝杆菌细胞容易聚集成团，从而阻碍MALDI-TOF质谱检测分析，因此对比文件1中采用吐温20来打破细胞成团（参见对比文件1第2页左栏最后1段，第5页右栏第2段），对比文件1还公开了破碎细胞壁也是提取分枝杆菌蛋白的关键步骤（参见对比文件1第5页右栏第2段）。同时，本领域公知，珠磨是非常有效的一种细胞物理破碎法（参见公知常识证据1第244页），为了克服化学试剂吐温20带来的污染从而增加分离纯化步骤，本领域技术人员容易想到用珠磨代替吐温20，通过破坏细胞壁来阻止细胞团块生成。因此，在对比文件1的基础上结合本领域公知常识得到权利要求1请求保护的技术方案对本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2对耐酸细菌作进一步限定，对比文件1公开了使用MALDI-TOF质谱检测分枝杆菌（参见摘要），诺卡氏菌属(Nocardia)也是本领域常见的已知耐酸细菌，因此选择对其进行MALDI-TOF质谱检测对本领域技术人员来说是显而易见的。因此在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求3限定权利要求1的方法中将来自步骤(d)的上清液直接或作为水悬浮液，应用至质谱分析法的载玻片。而经过细胞破碎失活等步骤，细胞蛋白会存在于溶液中，因此采用上述步骤对本领域技术人员来说是显而易见的。因此在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求3也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求4-12作进一步限定，玻璃珠的粒径可通过优化实验选择确定；对比文件1公开了70%甲酸的使用（参见对比文件1第4页左栏第1段）；本领域技术人员可通过有限的实验确定乙腈的终浓度；珠磨的时间可通过优化实验选择确定；对比文件1公开了甲酸和乙腈的用量为5-50μL（第4页左栏第1段）；公开了甲酸和乙腈提取细胞蛋白后，将悬浮液离心取上清液；公开了基质溶液包含α-氰基-4-羟基肉桂酸（参见对比文件1第4页左栏第1段）；公开了将分支杆菌鉴定到种的水平（参见对比文件1第5页左栏第1段），因而进一步鉴定到菌株水平也是可预期的。因此在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求4-12也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、对复审请求人相关意见的评述
合议组认为，乙醇失活是本领域熟知的细菌失活的一种处理方式，也是对比文件1公开的一个备选项，虽然对比文件1公开MALDI-TOF质谱分析法用于乙醇灭活的分枝杆菌效果不佳，但对比文件1同时还公开了分枝杆菌细胞容易聚集成团，从而阻碍MALDI-TOF质谱检测分析，因此对比文件1中采用吐温20来打破细胞成团（参见对比文件1第2页左栏最后1段，第5页右栏第2段），也就是说，分枝杆菌细胞聚集成团是影响MALDI-TOF质谱分析的重要因素，对比文件1已经教导了在细胞失活之前采取打破细胞团的操作来消除其不利影响。因此，无论采用何种细胞失活方式，都需要先打破细胞团（本申请同样也是乙醇和珠磨同时使用，并非单纯乙醇失活）。同时，本领域公知，珠磨是非常有效的一种细胞物理破碎法（参见公知常识证据1第244页），为了克服化学试剂吐温20带来的污染从而增加分离纯化步骤，本领域技术人员容易想到用珠磨代替吐温20，通过破坏细胞壁来阻止细胞团块生成。因此在对比文件1的基础上结合本领域公知常识得到权利要求1的技术方案是显而易见的，其效果是可以预期的。综上所述，复审请求人的陈述意见不具有说服力。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年07月07日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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