发明创造名称：B型肝炎病毒表面抗原基因中止型突变的侦测技术
外观设计名称：
决定号：201399
决定日：2020-01-16
委内编号：1F237052
优先权日：2012-08-19
申请（专利）号：201380044168.6
申请日：2013-06-06
复审请求人：财团法人卫生研究院
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：吴立
合议组组长：张弛
参审员：张艳霞
国际分类号：C12Q1/70，C12Q1/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：发明实际解决的技术问题应当根据要求保护的发明与最接近的现有技术相比的区别特征所能达到的技术效果确定，本领域的技术人员根据该申请说明书中所记载的内容和现有技术无法得知的技术效果不能作为确定技术问题的基础。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380044168.6，名称为“B型肝炎病毒表面抗原基因中止型突变的侦测技术”的发明专利申请。申请人为财团法人卫生研究院。本申请的申请日为2013年06月06日，优先权日为2012年08月19日，公开日为2015年09月23日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年07月25日发出驳回决定，驳回了本发明专利申请，其理由是：权利要求1-16不符合专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定所依据的文本为：2015年02月17日提交的说明书附图、说明书摘要、摘要附图，2015年06月15日提交的说明书核苷酸和氨基酸序列表，2015年07月10日提交的说明书第1-148段，以及2017年05月18日提交的权利要求第1-16项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 第一组引子对和第二组引子对的组合在制备用于体外侦测一被分离的核甘酸检体是否具有一可编码小表面蛋白的B型肝炎病毒表面抗原基因C端截断突变的试剂中的用途，该试剂之侦测方法包括：
a)提供第一组引子对和第二组引子对：该第一组引子对包括一第一前置引子和一反置引子；该第二组引子对包括一第二前置引子和一反置引子；其中，
(i)该第一前置引子包括一段可黏合至S基因5'-端的核苷酸序列，且该核苷酸序列的5'-端标记有一FLAG标记序列；该反向引子具有可黏合至S基因3'-端序列的特征；该第一组引子对具有产生一第一次聚合酶连锁反应产物的特征，该产物的5'-端具有一FLAG标记序列；
(ii)该第二前置引子包括一方向为5'端至3'端的一T7或一Sp6启动子序列、一Kozak序列及一3'-端序列，该3'-端序列可黏合至第一次PCR产物5'-端FLAG标记序列；而该第二组引子对具有产生第二次PCR产物的特征：其5'-端具有T7或Sp6启动子序列、具有Kozak序列和FLAG标记序列，其中该Kozak序列位在T7或Sp6启动子序列和FLAG标记序列之间；
b)于一第一反应混合物中进行一第一次PCR，该混合物包括一分离出的核苷酸检体和第一组引子对来产生第一次PCR产物，其中该分离出的核苷酸检体来自于B型肝炎病毒带原者或疑似B型肝炎病毒带原者；
c)于一第二反应混合物中进行一第二次PCR，该混合物包括第一次PCR产物和第二组引子对来产生第二次PCR产物；
d)将该第二次PCR产物转译成一蛋白质；
e)将该蛋白质的尺寸与控制组或野生型小表面蛋白的尺寸进行比较；及
f)检测该核苷酸检体是否具有B型肝炎表面基因C端截断突变：当该蛋白质的尺寸相较于控制组或野生型的小表面蛋白尺寸有变小的状况，则该检体具有B型肝炎表面基因的C端截断突变，其中该HBV S基因的C-端截断突变系选自由sL15*、sL21*、sS61*、sC69*、sL95*、sW156*、sW163*、sW172*、sW182*、sW196*和sL216*组成的群组。
2. 如权利要求1所述的用途，其中该核苷酸样本系取自一疑似受到B型肝炎病毒感染或肝细胞癌的病患、或肝功能不正常的病患、或有肝硬化的病患。
3. 如权利要求1所述的用途，其中该核苷酸样本系萃取自于一新鲜的冷冻肝组织、一福尔马林固定的石蜡组织切片或一血液样本。
4. 如权利要求1所述的用途，其中该第一次PCR产物延展HBV S基因以编码小表面蛋白序列，该序列延展的范围至少为编号2号氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸位置123到227的长度；且该第一次PCR产物的5'-端标示有一FLAG标记序列。
5. 如权利要求1所述的用途，其中该第一次PCR产物延展HBV S基因中负责编码小表面蛋白的序列，该序列延展的范围由SEQ ID NO:2的氨基酸位置30到227，或由SEQ ID NO:2的氨基酸位置123到227。
6. 如权利要求1所述的用途，其中该Kozak共有序列为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
7. 如权利要求1所述的用途，其中
a)该第一组引子对的第一前置引子包括由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16组成之一核苷酸序列；
b)该第二组引子对的第二前置引子包括由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17组成之一核苷酸序列；及
c)该反置引子包括SEQ ID NO:9核苷酸序列。
8. 如权利要求6所述的用途，其中该第一前置引子和该第二前置引子分别包括选自由下列群组所组成的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO:8和10；
(b)SEQ ID NO:11和12；
(c)SEQ ID NO:8和12；
(d)SEQ ID NO:13和12；
(e)SEQ ID NO:13和10；
(f)SEQ ID NO:14和12；
(g)SEQ ID NO:14和15；
(h)SEQ ID NO:14和10；及
(i)SEQ ID NO:16和17。
9. 如权利要求7所述的用途，其中该第一前置引子的序列为SEQ ID NO:14，
该第二前置引子的序列为SEQ ID NO:15。
10. 如权利要求1所述的用途，其中
a)该第一组引子对的第一前置引子由一核苷酸序列组成，该核苷酸序列选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16组成的群组；
b)该第二组引子对的第二前置引子由一核苷酸序列组成，该核苷酸序列选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17组成的群组；及
c)该反置引子由SEQ ID NO:9核苷酸序列组成。
11. 如权利要求1所述的用途，其中该比较步骤是以一西方点墨法或一化学发光检测系统来做比较。
12. 第一前置引子和反置引子以及第二前置引子和反置引子的组合在制备用于体外侦测一被分离的核苷酸检体是否具有一可编码小表面蛋白的HBV S基因C端截断突变的试剂中的用途，该试剂之侦测方法包括：
a)提供一第一前置引子和一反置引子；该第一前置引子包括一用于黏合至S基因5'-端的核苷酸序列，且该核苷酸序列的5'-端具有一FLAG标记序列；该反置引子包括一用于黏合至S基因3'-端的核苷酸序列；
b)于一第一反应混合物中进行一第一次PCR，该混合物包括该核苷酸检体、第一前置引子和反置引子来产生第一次PCR产物；该第一次PCR产物包括在其5'-端的一FLAG标记序列；该核苷酸检体来自一人类受试者，其为HBV带原者或HBV疑似带原者；
c)提供一第二前置引子和反置引子，该第二前置引子包括一方向为5'-端至3'-端的一T7或一Sp6启动子序列、一具有一空间子及一3'-端序列的Kozak序列，该3'-端序列具有可黏合至第一次PCR产物5'-端FLAG标记序列的特征；
d)于一第二反应混合物中进行一第二次PCR；该第二反应混合物包含第一次PCR产物、该第二前置引子和反置引子来产生一第二次PCR产物；该第二次PCR产物包含位在该第二次PCR产物5'-端的T7或Sp6启动子序列、Kozak序列和FLAG标记序列；该Kozak序列位在T7或Sp6启动子序列和FLAG标记序列之间；
e)将第二次PCR产物转译成一蛋白质；
f)将该蛋白质的尺寸与控制组或野生型的小表面蛋白的尺寸进行比较；及
g)检测该核苷酸检体是否具有B型肝炎表面基因C端截断突变：如果该蛋白质的尺寸小于野生型小表面蛋白的尺寸，则该检体具有B型肝炎表面基因的C端截断突变，其中该HBV S基因的C-端截断突变系选自由sL15*、sL21*、sS61*、sC69*、sL95*、sW156*、sW163*、sW172*、sW182*、sW196*和sL216*组成的群组。
13. 一种用于侦测一核酸样本是否存在HBV S基因C端截断突变的体外诊断套组，包括：
(a)一第一组引子对，该引子对可在第一次PCR反应中黏合至一核苷酸检体中的HBV S基因，以产生一第一次PCR产物；该第一次PCR产物延展HBV S基因序列，以至少由SEQ ID NO:2的氨基酸位置123到227编码一小表面蛋白，且该第一次PCR产物的5'-端标示有一FLAG标记序列；及
(b)一第二组引子对，其具有于一第二次PCR黏合至第一次PCR产物的特征，以产生一第二次PCR产物；该第二次PCR产物延展第一次PCR产物的序列，且该第二次PCR产物的5'-端包含一T7或Sp6启动子序列、一Kozak序列和FLAG标记序列；该Kozak序列位在T7或Sp6启动子序列和FLAG标记序列之间；
其中该第一组引子对包含一第一前置引子和一反置引子；该第二组引子对包含一第二前置引子和前述反置引子；
a)该第一组引子对的第一前置引子包含一选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16组成的核苷酸序列；
b)该第二组引子对的第二前置引子包含一选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17组成的核苷酸序列；及
c)该反置引子包含SEQ ID NO:9核苷酸序列；
其中该HBV S基因的C-端截断突变系选自由sL15*、sL21*、sS61*、sC69*、sL95*、sW156*、sW163*、sW172*、sW182*、sW196*和sL216*组成的群组。
14. 如权利要求13所述的体外诊断套组，其中该第一次PCR产物由SEQ ID NO:
2的氨基酸位置30到227或由SEQ ID NO:2的氨基酸位置123到227延 展HBV S基因中负责编码小表面蛋白的序列。
15. 如权利要求13所述的体外诊断套组，其中该第一组引子对包含一第一前置引子和一反置引子；该第二组引子对包含一第二前置引子和该反置引子；
其中
(i)该第一前置引子的5'-端包含一FLAG标记序列；及
(ii)该第二前置引子包含一方向为5'-端至3'-端的T7或Sp6启动子、该Kozak序列和一3'-端序列，该3'-端序列具有一可黏合至第一PCR产物5'-端FLAG标记序列的特征。
16. 如权利要求13所述的体外诊断套组，其中
a)该第一组引子对的第一前置引子由一核苷酸序列组成，该核苷酸序列选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16组成的群组；
b)该第二组引子对的第二前置引子由一核苷酸序列组成，该核苷酸序列选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17组成的群组；及
c)该反置引子由SEQ ID NO:9核苷酸序列组成。”
驳回决定认为：（1）对比文件1（US2009/0280474A1，公开日为：2009年11月12日）公开了检测核酸样本是否存在HBV基因的方法，其中SEQ ID NO:2是HBV S基因（参见说明书第3、5、56-57段，表2）。对比文件2（US2004/0014071A1，公开日为：2004年01月22日）公开了检测核酸样本是否存在基因C端截断突变的试剂盒，包括：两对引物对，检测基因的3’C端截断突变，以及5'N端标示有一FLAG标记序列。引物中还可包括T7启动子序列、Kozak序列，Kozak序列位在T7启动子序列和FLAG标记序列之间（参见说明书第1、129、302段，实施例24、25、36，图53）。在对比文件1公开的基础上，结合对比文件2给出的技术启示，本领域技术人员容易想到设计两对引物，在第一次PCR反应中黏合至HBV S基因，第一次PCR产物延展SEQ ID NO:2的HBVS序列3’C端截断突变，5'-端标示有一FLAG标记序列；及第二次PCR黏合至第一次PCR产物，第二次PCR产物5'-端包含T7启动子序列、Kozak序列和FLAG标记序列。Sp6启动子是和T7启动子类似的启动子，因而可常规选择替换。对于HSV S基因的核苷酸序列，结合现有技术公开的序列，以及通过常用的商业化软件和有限的试验即可获得PCR的引物序列。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2和常规技术获得权利要求1的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备创造性。基于类似的理由，权利要求12、13也不具备创造性。权利要求2-11直接或间接引用权利要求1，权利要求14-16引用了权利要求13，其附加技术特征或者被对比文件2公开，或者是本领域的常规实验手段，因此，权利要求2-11、14-16也不具备创造性。（2）对于申请人的意见陈述，驳回决定认为：sW182*和sL216*均是现有技术已知的C端截断突变，且权利要求保护范围中还包括了除sL95*、sW182*和sL216*以外的其他突变系，本领域技术人员有动机将对比文件2公开的方法用于很多种基因例如对比文件1公开的HBV S基因，上述应用不存在技术障碍，引物对设计也是本领域的常规实验手段，所产生的技术效果是可以预期的，本申请仅是实际验证了具体结果，因而不具备创造性。
申请人财团法人卫生研究院（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年11月09日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。复审请求人认为：（1）权利要求1的基因组合和步骤流程的设计，使得能用于多种B型肝炎特征病患的微量基因的检测诊断；对比文件1与2没有公开前置引子标记序列，由于多种突变同时存在，不易辨别，基于对比文件1和3不能想到所使用的两对引物；体外转译系统有许多不稳定因素，可能无法获得正确产物，未知片段的体外转译需要多次试验才能实现；对比文件1和2均未揭示相同的方法和顺序，且基因群组是经大量实验选出的最佳基因。（2）本发明技术可制作成一个肝癌诊断套组，市场接受度更好。除已完成的上百例肝癌检测以及动物实验外，还有肝癌检体的检测及临床分析，这些数据并非都由对比文件1和2轻易地推断出来；期刊文章（即答复第三次审查意见通知书的附件1）表明B型肝炎表面基因具有C端截断突变是发明人的创造性劳动成果，申请日之前本领域技术人员无法获知该信息。（3）本申请美国和台湾地区同族专利申请已经获得授权。
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年11月21日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中重申了驳回理由，并进一步指出，（1）用引物进行PCR获得微量产物是本领域的常规技术手段，含量少不会导致不能进行PCR。用两对引物进行PCR以及体外转译系统均属于常规操作，通过常用的商业化软件即可设计获得，并且进而即可获得试剂盒。动物实验、肝癌检体的检测及临床分析的存在并不能证明本申请就具有创造性。（2）其他国家或地区的审查不能影响本申请的审查。因此认为复审请求人的意见不具有说服力，不能克服本申请不具备创造性的缺陷。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019 年02 月01 日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1-16不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（1）权利要求1与对比文件2相比的区别特征在于：引子对针对的目标基因是来源于B型肝炎病毒带原者或疑似B型肝炎病毒带原者的编码小表面的蛋白的B型肝炎病毒表面抗原基因，以判断基因是否具有权利要求1所列C端截断突变；包括一个第一组引子对，通过两次PCR扩增获得用于转译的PCR产物。其实际解决的技术问题是：如何检测另一种基因的C端截断突变。但是，首先，编码小表面的蛋白的B型肝炎病毒表面抗原基因具有C端截断突变是现有技术已知的，本领域技术人员有动机检测该基因以研究分析其是否属于C端截断突变，从而有动机将对比文件1公开的检测方法用于上述基因C端截断突变的检测。对比文件1公开了HBV S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；而针对已知的序列设计扩增引物上的互补序列（即分别黏合至S基因5’和3’端的核苷酸序列）是本领域的常规技术手段。其次，对比文件2还公开了可以使用包含T7启动子、His6标签、FLAG表位、APC互补区域的引物进行扩增，可利用FLAG表位进行捕获以促进翻译产物的分离。在此基础上，本领域技术人员有动机在最终扩增产物中引入FLAG表位以分离纯化翻译产物。而通过两步PCR扩增分别连接不同元件是本领域的常规实验手段，且对比文件2给出了可以通过两轮PCR扩增提高检测灵敏度的技术启示。因此，权利要求1相对于对比文件1-2和本领域常规实验手段的结合不具备创造性。从属权利要求2-11的附加技术特征或者被对比文件2所公开，或者属于本领域常规技术，在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求2-11也不具备创造性。基于与针对权利要求1的评述相似的理由，权利要求12也不具备创造性。权利要求13与权利要求1的区别对应于权利要求4、7、10的特征。权利要求14的附加技术特征对应于权利要求5的特征。权利要求15-16的附加技术特征已经隐含或包含在其引用的权利要求13中。因此，基于类似的理由，权利要求13-16也不具备创造性。（2）对于复审请求人的意见陈述，合议组认为：首先，使用两轮PCR和能用于多种变体的检测已经被对比文件2公开，引物设计是常规实验手段，没有证据证明体外转译检测HBV S基因截短突变体存在技术障碍，也没有证据表明权利要求限定的步骤顺序和引物序列能够产生预料不到的技术效果。其次，根据权利要求限定的特征和本申请说明书验证了的技术效果可知，本申请实际解决的技术问题是引物组在制备截短型突变体检测试剂中的用途，而非制备肝癌检测试剂中的用途。用途权利要求1-12保护范围中包括了不用于肝癌检测，仅检测截短突变体的技术方案，而对于产品权利要求13-16用途特征对其不具有限定作用。最后，其他国家或地区知识产权局对同族专利申请的审查结果不是本申请审查的法律依据。因此，复审请求人的理由不成立。
复审请求人于2019 年04 月03 日提交了意见陈述书和修改的权利要求书（共4页15项），其中修改了原权利要求1、12和13，删除了权利要求7，并适应性地修改了权利要求的编号和引用关系。复审请求人认为：修改后的权利要求限定了用途和诊断套组是用于体外检测B型肝炎病毒相关的肝癌变，本申请设计的特殊引子组不限定于检测sL95*、sW182*、sL216*这三种突变型，其他截短突变型也能被检测出来；对比文件2体外转译的目的是为了解决传统以放射性标记带来的不便与危险，没有给出用第一和第二引子对进行PCR反应后将第二次PCR产物转译成蛋白质检测B型肝炎表面基因的C端截短突变的启示；虽然sW182*、sL216*是已知的突变型，现有技术未公开其致癌活性，因此，修改后的权利要求1-15具备创造性。修改后的权利要求1、12和13如下：
“1. 第一组引子对和第二组引子对的组合在制备用于体外侦测一B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂中的用途，其特征在于该试剂以体外转译的方法侦测被分离的核甘酸检体是否具有一可编码小表面蛋白的B型肝炎病毒表面抗原基因C端截断突变，侦测方法包括：
a)提供第一组引子对和第二组引子对：该第一组引子对包括一选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16组成的群组的核苷酸序列的第一前置引子和一包括SEQ ID NO:9核苷酸序列的反置引子；该第二组引子对包括一选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17组成的核苷酸序列的第二前置引子和一包括SEQ ID NO:9核苷酸序列的反置引子；其中，
(i)该第一前置引子包括一段可黏合至S基因5'-端的核苷酸序列，且该核苷酸序列的5'-端标记有一FLAG标记序列；该反向引子具有可黏合至S基因3'-端序列的特征；该第一组引子对具有产生一第一次聚合酶连锁反应产物的特征，该产物的5'-端具有一FLAG标记序列；
(ii)该第二前置引子包括一方向为5'端至3'端的一T7或一Sp6启动子序列、一Kozak序列及一3'-端序列，该3'-端序列可黏合至第一次PCR产物5'-端FLAG标记序列；而该第二组引子对具有产生第二次PCR产物的特征：其5'-端具有T7或Sp6启动子序列、具有Kozak序列和FLAG标记序列，其中该Kozak序列位在T7或Sp6启动子序列和FLAG标记序列之间；
b)于一第一反应混合物中进行一第一次PCR，该混合物包括一分离出的核苷酸检体和第一组引子对来产生第一次PCR产物，其中该分离出的核苷酸检体来自于B型肝炎病毒带原者或疑似B型肝炎病毒带原者；
c)于一第二反应混合物中进行一第二次PCR，该混合物包括第一次PCR产物和第二组引子对来产生第二次PCR产物；
d)将该第二次PCR产物转译成一蛋白质；
e)将该蛋白质的尺寸与控制组或野生型小表面蛋白的尺寸进行比较；及
f)检测该核苷酸检体是否具有B型肝炎表面基因C端截断突变：当该蛋白质的尺寸相较于控制组或野生型的小表面蛋白尺寸有变小的状况，则该检体具有B型肝炎表面基因的C端截断突变，其中该HBV S基因的C-端截断突变系选自由sL15*、sL21*、sS61*、sC69*、sL95*、sW156*、sW163*、sW172*、sW182*、sW196*和sL216*组成的群组。
12. 一种用于侦测一B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂中的体外诊断套组，其特征在于以体外转译的方法侦测核酸样本是否存在HBV S基因C端截断突变，包括：
(a)一第一组引子对，包含一第一前置引子和一反置引子，该引子对可在第一次PCR反应中黏合至一核苷酸检体中的HBV S基因，以产生一第一次PCR产物；该第一次PCR产物延展HBV S基因序列，以至少由SEQ ID NO:2的氨基酸位置123到227编码一小表面蛋白，且该第一次PCR产物的5'-端标示有一FLAG标记序列；及
(b)一第二组引子对，包含一第二前置引子和前述反置引子，其具有于一第二次PCR黏合至第一次PCR产物的特征，以产生一第二次PCR产物；该第二次PCR产物延展第一次PCR产物的序列，且该第二次PCR产物的5'-端包含一T7或Sp6启动子序列、一Kozak序列和FLAG标记序列；该Kozak序列位在T7或Sp6启动子序列和FLAG标记序列之间；
其中
a)该第一组引子对的第一前置引子包含一选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16组成的核苷酸序列；
b)该第二组引子对的第二前置引子包含一选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17组成的核苷酸序列；及
c)该反置引子包含SEQ ID NO:9核苷酸序列；
且其中该HBV S基因的C-端截断突变系选自由sL15*、sL21*、sS61*、sC69*、sL95*、 sW156*、sW163*、sW172*、sW182*、sW196*和sL216*组成的群组。
13. 如权利要求12所述的体外诊断套组，其中该第一次PCR产物由SEQ ID NO:2的氨基酸位置30到227或由SEQ ID NO:2的氨基酸位置123到227延展HBV S基因中负责编码小表面蛋白的序列。”
合议组于2019 年07 月25 日再次向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1-15不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（1）权利要求1与对比文件2相比的区别特征在于：权利要求1限定了引子对针对的目标基因是来源于B型肝炎病毒带原者或疑似B型肝炎病毒带原者的编码小表面的蛋白的B型肝炎病毒表面抗原基因，以实现判断基因是否具有权利要求1所列C端截断突变的技术效果，进而实现检测B型肝炎病毒相关的肝癌变的技术效果；包括一个第一组引子对，通过两次PCR扩增获得用于转译的PCR产物；限定了引子对的具体结构。对于权利要求1中涉及除sL95*、sW182*、sL216*突变体以外的其他突变体的并列技术方案，其要解决的技术问题在于如何检测另一种基因的C端截断突变。但是，首先，该基因具有C端截断突变是现有技术已知的，本领域技术人员有动机检测并分析其是否属于C端截断突变。且对比文件1公开了HBV S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；而针对已知的序列设计扩增引物上的互补序列是本领域的常规技术手段。其次，对比文件2还公开了可以使用包含T7启动子、His6标签、FLAG表位、APC互补区域的引物进行扩增，从而可以利用FLAG表位进行捕获以促进翻译产物的分离。在此基础上，本领域技术人员有动机在最终扩增产物中引入FLAG表位以分离纯化翻译产物。而通过两步PCR扩增分别连接不同元件是本领域的常规实验手段。且对比文件2给出了可以通过两轮PCR扩增提高检测灵敏度的技术启示。最后，引子对的具体结构是本领域技术人员根据待扩增序列的已知结构可以常规调整确定的，没有证据表明使用所限定的引子对能够使请求保护的用途具有预料不到的技术效果。因此，权利要求1相对于对比文件1-2和本领域常规实验手段的结合不具备创造性。从属权利要求2-10的附加技术特征或者被对比文件2所公开，或者属于本领域常规技术，在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求2-10也不具备创造性。基于与针对权利要求1的评述相似的理由，权利要求11也不具备创造性。 权利要求12-15的用途特征限定并未使得诊断套组在结构和组成上发生变化，因此，本领域技术人员出于检测HBV S基因C端截断突变体的目的，能够显而易见的获得权利要求12-15请求保护的体外诊断套组。权利要求12-15也不具备创造性。（2）对于复审请求人的意见陈述，合议组认为：首先，本领域技术人员不能预期除sL95*、sW182*、sL216*突变体以外的其他技术方案能够检测肝癌变，因而其解决的技术问题仅为检测C端截断突变；其次，对比文件2公开了对体外转译产物进行可视化分析的方法，也给出了使用FLAG促进产物分离的技术启示，而两组引物扩增产物所包含的元件种类和顺序均是本领域常规实验手段，因此，复审请求人的理由不成立。
复审请求人于2019 年09月09 日提交了意见陈述书、附件1-2和修改的权利要求书（共4页15项），其中，修改了权利要求1、11、12和14。附件1-2如下：
附件1：“Identification of nonsense mutations in hepatitis B virus S gene in patients with hepatocellular carcinoma developed after lamivudine therapy”，Ming-Wei Lai等，Antiviral Therapy，第14卷第2期，第249-261页，公开日：2009年01月31日，英文复印件共13页。
附件2：“Hepatocarcinogenesis in transgenic mice carrying hepatitis B virus pre-S/S gene with the sW172* mutation”，M-W Lai等，Oncogenesis，第5期，公开日：2016年12月31日，英文复印件共10页。
结合附件1-2，复审请求人认为：（1）附件1证明了sL15*，sL21*，sW156*和sW172*突变型具有致瘤发生性，附件2公开了关于sW172突变的研究成果，补充提交的sC69*与肝癌相关的实验结果可以证明肝癌患者样品中能够检测到除了说明书中已证实C端截短突变以外的其他突变；（2）对比文件2并未给出将Sp6启动子用于设计第二组引子对来产生PCR产物和体外转译的技术启示。本申请的特殊引子对的用途并非是单纯用于检测B型肝炎表面基因的C端截断突变，而是通过体外转译方法，藉由体外检测截断突变进而检验肝癌变；（3）修改后的权利要求12中删除了“以体外转译的方法侦测核酸样本是否存在HBV S基因C端截断突变”的叙述，因此权利要求12要求保护的为用于侦测B型肝炎相关的肝癌变诊断套组，由于先前文件未揭示所述突变和肝癌的关系，因此修改后的权利要求12-15具备创造性。
修改后权利要求1、11、12、14如下：
“1. 第一组引子对和第二组引子对的组合在制备用于以体外转译的方法体外侦测一B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂中的用途，其特征在于该侦测方法包括：
a)提供第一组引子对和第二组引子对：该第一组引子对包括一选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16组成的群组的核苷酸序列的第一前置引子和一包括SEQ ID NO:9核苷酸序列的反置引子；该第二组引子对包括一选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17组成的核苷酸序列的第二前置引子和一包括SEQ ID NO:9核苷酸序列的反置引子；其中，
(i)该第一前置引子包括一段可黏合至S基因5'-端的核苷酸序列，且该核苷酸序列的5'-端标记有一FLAG标记序列；该反向引子具有可黏合至S基因3'-端序列的特征；该第一组引子对具有产生一第一次聚合酶连锁反应产物的特征，该产物的5'-端具有一FLAG标记序列；
(ii)该第二前置引子包括一方向为5'端至3'端的一Sp6启动子序列、一Kozak序列及一3'-端序列，该3'-端序列可黏合至第一次PCR产物5'-端FLAG标记序列；而该第二组引子对具有产生第二次PCR产物的特征：其5'-端具有Sp6启动子序列、具有Kozak序列和FLAG标记序列，其中该Kozak序列位在Sp6启动子序列和FLAG标记序列之间；
b)于一第一反应混合物中进行一第一次PCR，该混合物包括一分离出的核苷酸检体和第一组引子对来产生第一次PCR产物，其中该分离出的核苷酸检体来自于B型肝炎病毒带原者或疑似B型肝炎病毒带原者；
c)于一第二反应混合物中进行一第二次PCR，该混合物包括第一次PCR产物和第二组引子对来产生第二次PCR产物；
d)将该第二次PCR产物转译成一蛋白质；
e)将该蛋白质的尺寸与控制组或野生型小表面蛋白的尺寸进行比较；及
f)检测该核苷酸检体是否具有B型肝炎表面基因C端截断突变：当该蛋白质的尺寸相较于控制组或野生型的小表面蛋白尺寸有变小的状况，则该检体具有B型肝炎表面基因的C端截断突变，其中该HBV S基因的C-端截断突变系选自由sL15*、sL21*、sS61*、sC69*、sL95*、sW156*、sW163*、sW172*、sW182*、sW196*和sL216*组成的群组。
11. 第一前置引子和反置引子以及第二前置引子和反置引子的组合在制备用于体外侦测一B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂中的用途，其特征在于该侦测方法包括：
a)提供一第一前置引子和一反置引子；该第一前置引子包括一用于黏合至S基因5'-端的核苷酸序列，且该核苷酸序列的5'-端具有一FLAG标记序列；该反置引子包括一用于黏合至S基因3'-端的核苷酸序列；其中该第一组引子对的第一前置引子由一核苷酸序列组成，该核苷酸序列选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16组成的群组及该反置引子由SEQ ID NO:9核苷酸序列组成；
b)于一第一反应混合物中进行一第一次PCR，该混合物包括该核苷酸检体、第一前置引子和反置引子来产生第一次PCR产物；该第一次PCR产物包括在其5'-端的一FLAG标 记序列；该核苷酸检体来自一人类受试者，其为HBV带原者或HBV疑似带原者；
c)提供一第二前置引子和反置引子，该第二前置引子包括一方向为5'-端至3'-端的或一Sp6启动子序列、一具有一空间子及一3'-端序列的Kozak序列，该3'-端序列具有可黏合至第一次PCR产物5'-端FLAG标记序列的特征；其中该第二组引子对的第二前置引子由一核苷酸序列组成，该核苷酸序列选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17组成的群组及该反置引子由SEQ ID NO:9核苷酸序列组成；
d)于一第二反应混合物中进行一第二次PCR；该第二反应混合物包含第一次PCR产物、该第二前置引子和反置引子来产生一第二次PCR产物；该第次PCR产物包含位在该第二次PCR产物5'-端的Sp6启动子序列、Kozak序列和FLAG标记序列；该Kozak序列位在Sp6启动子序列和FLAG标记序列之间；
e)将第二次PCR产物转译成一蛋白质；
f)将该蛋白质的尺寸与控制组或野生型的小表面蛋白的尺寸进行比较；及
g)检测该核苷酸检体是否具有B型肝炎表面基因C端截断突变：如果该蛋白质的尺寸小于野生型小表面蛋白的尺寸，则该检体具有B型肝炎表面基因的C端截断突变，其中该HBV S基因的C-端截断突变系选自由sL15*、sL21*、sS61*、sC69*、sL95*、sW156*、sW163*、sW172*、sW182*、sW196*和sL216*组成的群组。
12. 一种用于以体外转译的方法侦测一B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂中的体外诊断套组，包括：
(a)一第一组引子对，包含一第一前置引子和一反置引子，该引子对可在第一次PCR反应中黏合至一核苷酸检体中的HBV S基因，以产生一第一次PCR产物；该第一次PCR产物延展HBV S基因序列，以至少由SEQ ID NO:2的氨基酸位置123到227编码一小表面蛋白，且该第一次PCR产物的5'-端标示有一FLAG标记序列；及
(b)一第二组引子对，包含一第二前置引子和前述反置引子，其具有于一第二次PCR黏合至第一次PCR产物的特征，以产生一第二次PCR产物；该第二次PCR产物延展第一次PCR产物的序列，且该第二次PCR产物的5'-端包含一Sp6启动子序列、一Kozak序列和FLAG标记序列；该Kozak序列位在Sp6启动子序列和FLAG标记序列之间；
其中
a)该第一组引子对的第一前置引子包含一选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16组成的核苷酸序列；
b)该第二组引子对的第二前置引子包含一选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17组成的核苷酸序列；及
c)该反置引子包含SEQ ID NO:9核苷酸序列；
且其中该套组系以体外转译的方法侦测选自HBV S基因sL15*、sL21*、sS61*、sC69*、sL95*、sW156*、sW163*、sW172*、sW182*、sW196*和sL216*的C-端截断突变。
14. 如权利要求12所述的体外诊断套组，其中该第一组引子对包含一第一前置引子和一反置引子；该第二组引子对包含一第二前置引子和该反置引子；其中
(i)该第一前置引子的5'-端包含一FLAG标记序列；及
(ii)该第二前置引子包含一方向为5'-端至3'-端的Sp6启动子、该Kozak序列和一3'-端序列，该3'-端序列具有一可黏合至第一PCR产物5'-端FLAG标记序列的特征。
15. 如权利要求12所述的体外诊断套组，其中
a)该第一组引子对的第一前置引子由一核苷酸序列组成，该核苷酸序列选自由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16组成的群组；
b)该第二组引子对的第二前置引子由一核苷酸序列组成，该核苷酸序列选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17组成的群组；及
c)该反置引子由SEQ ID NO:9核苷酸序列组成。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
复审请求人于2019年09月09日提交了修改的权利要求书全文替换页（共4页15项），经审查，所做修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定，因此，本复审请求审查决定所针对的文本是：2015年02月17日进入中国国家阶段时提交的国际申请的中文译文的说明书附图第1-5页（即图1-图9）、说明书摘要、摘要附图，2015年06月15日提交的说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-5页，2015年07月10日提交的说明书第1-22页（即第1-148段），以及2019年09月09日提交的权利要求第1-15项。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
发明实际解决的技术问题应当根据要求保护的发明与最接近的现有技术相比的区别特征所能达到的技术效果确定，本领域的技术人员根据该申请说明书中所记载的内容和现有技术无法得知的技术效果不能作为确定技术问题的基础。
就本案而言：
1、权利要求1请求保护第一组引子对和第二组引子对的组合在制备用于体外侦测一B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂中的用途，其实质是检测核苷酸检体是否具有B型肝炎表面基因C段截断突变。对比文件2公开了基于使用N-末端标签快速截短分析方法，分离基因组DNA，使用引入T7启动子和Kozak序列的引物进行扩增APC基因的特定区域（第15外显子片段2），将PCR产物不经纯化直接添加到Promega rabbit reticulocyte TnT Quick系统的小等分试剂中，其还含有BODIPY-Lys-tRNA，翻译产物使用SDS-PAGE分离后，通过荧光成像，或者适用抗BODIPY多抗的化学发光Western blotting程序使之可视化，截短突变和野生型显示出不同的分子量大小的条带（参见实施例24）。权利要求1与对比文件2相比的区别特征在于：（1）权利要求1限定了引子对针对的目标基因是来源于B型肝炎病毒带原者或疑似B型肝炎病毒带原者的编码小表面的蛋白的B型肝炎病毒表面抗原基因，以实现判断基因是否具有权利要求1所列C端截断突变的技术效果，进而实现检测B型肝炎病毒相关的肝癌变的技术效果；（2）包括一个第一组引子对，通过两次PCR扩增获得用于转译的PCR产物；（3）限定了启动子为Sp6和引子对的具体结构序列。
由于，一方面，本申请说明书中仅验证了sL95*、sW182*、sL216*这三种突变体在肝癌检测中的作用，另一方面，附件1（参见表2）公开了sL21*、sW156*、sW172*这三种突变体的致瘤性，对于权利要求中涉及其他突变的并列技术方案，本领域技术人员根据说明书记载的实验数据和现有技术无法预先确定其可以用于肝癌检测，且附件1（参见表2）公开了sL15*突变体不具有致瘤性。因此，对于权利要求1中涉及除sL21*、sL95*、sW156*、sW172*、sW182*、sL216*突变体以外的其他突变体的并列技术方案，本领域技术人员无法认定其实际解决的技术问题是“制备用于以体外转译的方法体外侦测B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂”，仅能将其认定为：如何检测另一种基因的C端截断突变。
对于区别特征（1），首先，编码小表面的蛋白的B型肝炎病毒表面抗原基因具有C端截断突变是现有技术已知的，本领域技术人员有动机检测来自B型肝炎病毒带原者或疑似B型肝炎病毒带原者的编码小表面的蛋白的B型肝炎病毒表面抗原基因，以研究分析其是否属于C端截断突变，从而有动机将对比文件1公开的检测方法用于编码小表面的蛋白的B型肝炎病毒表面抗原基因的C端截断突变的检测。其次，对比文件1公开了HBV S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示（参见说明书第56-57段和表2）；而针对已知的序列设计扩增引物上的互补序列（即分别黏合至S基因5’和3’端的核苷酸序列）是本领域的常规技术手段。
对于区别特征（2），对比文件2（参见说明书第302段、实施例25）还公开了可以使用包含T7启动子、His6标签、FLAG表位、APC互补区域的引物进行扩增，从而可以利用FLAG表位进行捕获，促进翻译产物的分离。在此基础上，本领域技术人员有动机在最终扩增产物中引入FLAG表位，从而可利用FLAG分离纯化翻译产物以利于后续显色步骤。而通过第一组引物对扩增获得包含FLAG和HBV S基因的扩增产物，再通过第二组引物对扩增获得依次包含启动子、Kozak、FLAG和HBV S基因的扩增产物，即通过两步PCR扩增分别连接不同元件是本领域的常规实验手段。且对比文件2（参见实施例36）给出了可以通过两轮PCR扩增提高检测灵敏度的技术启示。
对于区别特征（3），T7启动子和Sp6启动子均为本领域的常规启动子，可以常规替换；引子对的具体结构序列是本领域技术人员根据待扩增序列的已知结构可以常规调整确定的，没有证据表明使用所限定的启动子和引子对能够使请求保护的用途具有预料不到的技术效果。
因此，在对比文件2的基础上，结合对比文件1和本领域的常规实验手段获得权利要求1的保护范围中包括的涉及除sL21*、sL95*、sW156*、sW172*、sW182*、sL216*突变体以外的其他突变体的并列技术方案是显而易见的，其具有的能够用于检测HBV S基因截断变体的技术效果是可以预料到的，权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2、对于权利要求2-10：（1）权利要求2-3的附加技术特征限定了样本的来源，没有证据表明不同的样品会造成试剂盒的结构和/或组成的改变，因而对于引物在制备试剂盒中的用途不起限定作用；
（2）权利要求4-9限定了引物和扩增片段的具体序列，针对已知的序列设计引物是本领域的常规技术手段，而具体延展序列是本领域技术人员根据扩增效果和引物设计的一般规则，可以做出的常规选择，具体的Kozak序列也是现有技术已知的；
（3）权利要求10限定了比较的步骤，如针对权利要求1的评述中所述，对比文件2中已经公开了Western blotting化学发光来比较野生型和截断突变体。
因此，在其引用的权利要求不具有创造性的情况下，权利要求2-10也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、权利要求11请求保护第一前置引子和反置引子以及第二前置引子和反置引子的组合在制备用于体外侦测一B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂中的用途。其与权利要求1的区别在于，在第二前置引子的启动子和Kozak序列之间包含空间子，而在两个元件之间增加间隔序列是本领域的常规实验手段。因此，基于与针对权利要求1的评述相似的理由，权利要求11也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
4、权利要求12-15请求保护一种用于以体外转译的方法侦测B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂中的体外诊断套组。其中使用用途特征“用于侦测一B型肝炎病毒相关的肝癌变”对请求保护的体外诊断套组进行了限定，但没有证据表明该用途特征使得体外诊断套组在结构和/或组成上发生变化，即本领域技术人员无法区分用于“肝癌检测”的诊断套组和用于“HBV S基因C端截断突变检测”的诊断套组。因此，本领域技术人员出于检测HBV S基因C端截断突变体的目的，能够想到将所述检测试剂制备成诊断（检测）套组，在权利要求1的用途不具备创造性的情况下，权利要求12-15请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）对复审请求人相关意见的评述
针对复审请求人的意见，合议组认为：（1）首先，根据附件1表2记载的实验数据可知，sL15*突变体不具有致瘤性，因而检测该突变体的存在无法用于侦测B型肝炎病毒相关的肝癌变；其次，本领域技术人员根据本申请记载的实验数据和附件1-2无法预期除sL21*、sL95*、sW156*、sW172*、sW182*、sL216*突变体以外的其他突变体可用于侦测B型肝炎病毒相关的肝癌变，也没有现有技术证据足以证明上述其他突变体可用于侦测B型肝炎病毒相关的肝癌变；最后，2019年09月09日提交的意见陈述书附件第2页记载的补充提交的sC69*与肝癌相关的实验结果既未记载在本申请的原始申请文件中，也没有证据表明其属于现有技术，因而，本领域技术人员无法在本申请的申请日或优先权日依据上述实验结果认定sC69*与肝癌相关。因此，对于除sL21*、sL95*、sW156*、sW172*、sW182*、sL216*突变体以外的其他突变体，如针对权利要求1的评述中所述，本领域技术人员不能预先确定其可以解决体外检测B型肝炎病毒相关的肝癌变的技术问题，当请求保护的涉及其他突变型的技术方案实际解决的技术问题仅为如何检测另一种基因的C端截断突变时，其不具备创造性；（2）SP6启动子和T7启动子均为本领域常规使用的启动子，可以相互替换使用，在对比文件2已经公开了引物可以包含T7启动子的基础上，本领域技术人员可以常规选用在引物中包含SP6启动子，不论该启动子包含在第一组还是第二组引物中，其发挥的均是在扩增过程中向扩增产物引入启动子的功能，都能够在扩增产物中发挥原本的启动子功能。如针对权利要求1的评述中所述，由于本领域技术人员不能预先确定除sL21*、sL95*、sW156*、sW172*、sW182*、sL216*突变体以外的其他突变体可以解决体外检测B型肝炎病毒相关的肝癌变的技术问题，因而无法认可其用途为检验B性肝炎病毒带原者或疑似B型肝炎病毒带原者是否发生B性肝炎病毒相关的肝癌变，仅能认定其用途为单纯用于检测B型肝炎表面基因的C端截断突变，仍然不具备创造性。（3）权利要求12-15涉及用于检测B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂中的体外诊断套组，删除了“以体外转译的方法侦测核酸样本是否存在HBV S基因C端截断突变”的修改未使得体外诊断套组在结构和/或组成上发生变化，因此，该“用于侦测B型肝炎病毒相关的肝癌变的试剂中的体外诊断套组”与“侦测一核酸样本是否存在HBV S基因C端截断突变的体外诊断套组”在保护范围上依然没有实质区别。综上，复审请求人意见陈述的理由不成立，权利要求1-15仍然不具备创造性。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年07 月25 日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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