发明创造名称：通用型基因打靶载体
外观设计名称：
决定号：200950
决定日：2020-01-15
委内编号：1F261274
优先权日：
申请（专利）号：201510118781.9
申请日：2015-03-18
复审请求人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：杨莹跃
合议组组长：邹凯
参审员：韩世炜
国际分类号：C12N15/85
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：考察所属领域的技术人员是否容易想到对现有技术进行改进，是指所属领域技术人员基于申请日以前的现有技术能否会产生动机进行有目的的改进，而不是在知晓了发明的技术方案之后，再去考虑这种改进的可能性和难易程度。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510118781.9，名称为“通用型基因打靶载体”的发明专利申请。申请人为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所。本申请的申请日为2015年03月18日，公开日为2015年05月27日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年07月12日以权利要求1-4不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为：申请日2015年03月18日提交的权利要求第1-4项，说明书第1-119段，说明书附图，说明书摘要和摘要附图。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种通用型基因打靶载体，其特征在于，包含正选择标记和负选择标记，使用新霉素磷酸转移酶和EGFP为正选择标记，DsRed为负选择标记；靠正选择标记表达框的5′和3′端分别含有一个同向排列的LoxP位点，可在Cre/LoxP重组酶系统的作用下删除正选择标记表达框；在5′LoxP位点的上游和3′LoxP位点的下游各含有一段具有稀有限制性内切酶位点的多克隆位点，便于基因打靶臂的克隆；该载体还含有2个归巢限制性内切酶位点，分别为I-CeuI和I-SceI，可作为通用酶切位点将该载体线性化。
2.根据权利要求1所述的通用型基因打靶载体，其特征在于，所述的通用型基因打靶载体全长7640bp，为序列表中SEQ.ID.NO.1所示的核酸分子。
3.根据权利要求1所述的通用型基因打靶载体，其特征在于，所述的基因打靶臂，包括编码蛋白质的DNA和非蛋白质编码的DNA。
4.根据权利要求1所述的通用型基因打靶载体，其特征在于，所述的基因打靶，包括天然同源重组、锌指核酸酶技术、转录样激活因子核酸酶技术、CRISPR/Cas9或Cas9 Nickase。”
驳回决定认为：权利要求1与对比文件1（陈兴启等，通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定生物工程学报，第24卷，第10期，第194-201页，公开日期：2014年02月28日）的区别在于：（1）正负选择标记不同；（2）使用归巢限制性内切酶。基于上述区别技术特征，权利要求实际解决的技术问题是提供一种便利的基因打靶载体。对于区别技术特征（1），正选择标记loxP-CMV-Neo-IRES-EGFP-loxP已经被对比文件2（王志蕊等，Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能评价，中国生物化学与分子生物学报，第30卷，第2期，第194-201页，公开日期：2014年02月28日）公开，同时对比文件2还公开了可视化报告基因还包括红色荧光蛋白基因（DsRed）的内容，在已经使用绿色荧光蛋白作为正向标记的基础上，本领域技术人员有动机采用红色荧光蛋白作为负向标记；对于区别技术特征（2），对比文件3（沈林等，通过一种新发明使T7基因I置换araBAD基因簇，生物技术通讯，第20卷第5期，第643-646页，公开日期：2009年12月31日）公开了一种高拷贝数的打靶质粒，给出了采用归巢内切酶进行高效线性化的技术启示。而I-CeuI和I-SceI都是本领域常用的归巢内切酶位点。综上，在对比文件1的基础上结合对比文件2、3得到权利要求1的技术方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，因此该权利要求不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求2-4的附加技术特征是本领域的常规技术，在权利要求1不具备创造性的情况下，上述权利要求也不符合专利法第22条第3款的规定。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年09月12日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。
复审请求人认为：（1）本申请的技术方案涉及将DsRed作为负选择标记，在对比文件2的基础上结合公知常识，本领域技术人员并不会选择本申请的DsRed作为负选择标记。（2）本领域技术人员不能容易地想到本申请的2个归巢内切酶是否能够用于本申请的打靶载体上，而相对于1个归巢位点，使用2个归巢位点使载体线性化出现冗余位点的可能性趋近无穷小，与对比文件3相比，实用性更强。因此本申请的技术方案具备突出的实质性特点和显著的进步。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年09月30日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中强调，对比文件2给出了可以选取DsRed作为报告基因的明确启示，本领域技术人员有动机对其进行改进选用DsRed作为负选择标记；在对比文件3公开了归巢内切酶I-SceI切割效率高，特异性强时，本领域技术人员有动机选取不同的归巢内切酶位点添加到打靶载体上。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年11月04日向复审请求人发出复审请求口头审理通知书，定于2019年11月26日在专利局审协湖北中心3号楼203室进行口头审理。
口头审理如期举行，复审请求人委托代理人参加了口审。口审过程确定了如下事实：
（1）对比文件2公开了EGFR和neo组合作为正选择标记，但未公开选择DsRed作为负选择标记。对比文件2只是在前言中提到DsRed，在载体构建中并未用到DsRed。而且，荧光标记一般用作正选择，并没有采用荧光标记作为负选择标记的启示。
（2）负选择一般都是通过药物来筛选掉表达该标记的细胞，对细胞有不利影响，而本申请由于选择红色荧光蛋白-DsRed作为负选择标记，可在荧光显微镜下根据所发射的荧光通过肉眼挑选出相应的细胞，无需加入负选择的药物。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人在复审程序中均未修改申请文件，因此，本次复审决定所针对的文本为驳回决定所针对的文本，即申请日2015年03月18日提交的权利要求第1-4项，说明书第1-119段，核苷酸和氨基酸序列第1-11页，说明书附图图1-7，说明书摘要和摘要附图。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
考察所属领域的技术人员是否容易想到对现有技术进行改进，是指所属领域技术人员基于申请日以前的现有技术能否产生动机进行改进，而不是在知晓了发明的技术方案之后，再去考虑这种改进的可能性和难易程度。
本申请权利要求1请求保护一种通用型基因打靶载体，其特征在于，包含正选择标记和负选择标记，使用新霉素磷酸转移酶（即neo）和EGFP为正选择标记，DsRed为负选择标记；靠正选择标记表达框的5′和3′端分别含有一个同向排列的LoxP位点，可在Cre/LoxP重组酶系统的作用下删除正选择标记表达框；在5′LoxP位点的上游和3′LoxP位点的下游各含有一段具有稀有限制性内切酶位点的多克隆位点，便于基因打靶臂的克隆；该载体还含有2个归巢限制性内切酶位点，分别为I-CeuI和I-SceI，可作为通用酶切位点将该载体线性化。
对比文件1同样涉及一种基因打靶载体，其中使用neo作为正选择标记，使用HSV-tk1和HSV-tk2作为负选择标记，neo两端各有一个同向LoxP序列，用于在打靶后以Cre/LoxP系统去除neo表达框 (参见摘要，对比文件1的图4、2.1.2节）。因此，权利要求1所请求保护的技术方案与对比文件1公开的基因打靶载体的区别技术特征在于：（1）正、负选择所使用的标记不同：对于正选择标记，权利要求1选择了Neo-IRES-EGFP，而对比文件1则是neo；对于负选择标记，权利要求1选择了DsRed，而对比文件1则是HSV-tk1和HSV-tk2。（2）权利要求1的载体中还含有2个不同的归巢限制性内切酶位点。
本申请说明书中记载：“负选择基因……常用HSV-tk基因。……。但存在几个缺陷，……，经过正负筛选，家畜原代细胞本身遭受了两次药物处理，发育潜能大为降低，很难再用于体细胞核移植”、“本发明所要解决的技术问题是提供一种既能提高中靶细胞的富集效率，又能在筛选之后删除选择标记，同时还能减少化学药物对细胞冲击的通用型基因打靶载体”（参见说明书第2页第1-3段）。根据说明书的上述记载可知，本申请中采用DsRed代替HSV-tk基因作为负选择标记基因，在进行负选择筛选时无需再经过药物（GVC）筛选，从而可在一定程度上减少化学药物的施用对细胞所带来的冲击和损伤。基于说明书中的上述记载和区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题是提供一种既能提高中靶细胞富集效率，同时也能减少对细胞所带来的损伤的通用型基因打靶载体。
对于负选择标记的选择，驳回决定和前置审查意见中指出，对比文件2已经公开了选择标记包括EGFR、DsRed等，而在已经使用EGFR作为正选择标记的基础上，本领域技术人员有动机选择DsRed作为负选择标记。
对此，合议组认为：
（1）在判断对现有技术的改进是否是显而易见的时候，应该从现有技术而非本申请的技术方案出发，考察的是本领域技术人员基于现有技术是否有改进的动机和启示，而不是改进之后的技术方案对于本领域技术人员是否是容易理解和实现的。在判断是否有技术启示的时候，应充分考虑现有技术的技术手段为解决某一问题所体现出来的技术构思/解决思路。如果本申请技术方案与现有技术为解决同一个问题采用了不同的构思/解决思路，尽管本领域技术人员能够很容易理解和实现该构思/思路，但在没有明确技术启示的情况下，并不能认为本申请的技术方案就是显而易见的。本申请中采用DsRed作为负选择标记，EGFR作为正选择标记，结合本申请说明书的记载和复审请求人口审当庭的解释可知，由于EGFR和DsRed在荧光显微镜下分别发出绿色和红色荧光，因此，本申请的技术方案是通过荧光来进行正负选择的筛选，即正选择时，挑选的是发射绿色荧光的细胞，而负选择时，则是挑选发射红色荧光的细胞，随后将这些细胞去除，剩下的即是所需要的受体细胞。可见，本申请采用DsRed后所进行的负选择筛选实际上分为两个步骤：第一步是基于DsRed的表达来挑选细胞，本质上仍是一个挑选表达负选择标记/基因的细胞的正向选择过程，第二步去除上述挑选出来的细胞才使得整个筛选过程体现出“负选择”的特性。而对比文件1/本领域中通常使用的负选择过程所体现的构思则是利用负选择标记/基因直接或间接杀死细胞，使细胞根本无法存活，即在其构思下必然需要使用对细胞会产生直接或间接毒性的标记或基因，使得在实际情况中不可能会出现“表达负选择标记/基因的细胞”以供“挑选”的步骤，可见，二者为实现负选择所体现出来的整体构思是不同的。尽管在知晓本申请的技术方案之后，本领域技术人员很容易理解和实现本申请中负选择的原理和过程，但在没有明确技术启示的情况下，本领域技术人员在知晓本申请的技术方案之前并不能容易地想到可以使用其目的不在于杀死细胞的DsRed基因去替换对比文件1中所使用的旨在直接杀死或间接杀死细胞的HSV-tk基因。
（2）对比文件2仅仅在其前言或背景技术中涉及了DsRed：“随着转基因技术的不断发展及其应用的日益广泛……，其中一个重要的安全隐患来自各种选择标记的使用。选择标记分为两类……；另一类为可视化报告基因，……红色荧光蛋白基因（DsRed）……”（参见第195页左栏第一段），而在实际的载体构建过程中，使用了EGFR作为正选择标记基因，并未将DsRed或其他荧光蛋白作为负选择标记。可见，对比文件2泛泛列举了转基因技术中可选择使用的一些荧光标记，并未明确教导将DsRed或其他荧光标记作为基因打靶载体的负选择标记使用。
（3）本领域公知的是，在基因打靶过程中，正选择标记/基因通常位于同源区内部，其在随机整合和同源重组中均可正常表达，在针对正选择标记/基因进行筛选时，需要将表达正选择标记/基因的细胞挑选出来，而不表达正选择标记/基因的细胞将被排除在外，故本领域中常常选择氨基糖苷磷酸转移酶基因（neo）作为正选择基因，该基因编码的产物能够赋予细胞对于G418的耐药性，因此表达neo基因的细胞能够在G418的作用下存活而被挑选出来，不表达该基因的细胞则不能存活，从而形成正筛选。负选择标记/基因则通常位于同源区外部，是用于将随机整合了打靶载体的细胞排除在外，即在负选择过程中，需要使不表达负选择标记/基因的细胞存活，将表达负选择标记/基因的细胞杀死。本领域中通常选择HSV-tk基因作为负选择标记，该基因编码的产物能够使培养液中的GVC转变成毒性核苷酸，从而杀死表达该基因的细胞，而不表达该基因的细胞则存活，形成负筛选。根据上述内容，本领域技术人员对于本领域所普遍知晓和广泛使用的正选择和负选择的基本认识和理解将是正负选择所体现的筛选原理通常是相反的，两者对于所使用的标记/基因的需求一般是不同的，即能用于正选择的标记基因不一定能够用于负选择，因此，如果站在本领域技术人员的角度，从上述认识出发，在没有明确技术启示的情况下，本领域技术人员基于对比文件2采用EGFR作为正选择标记并不能显而易见地想到将EGFR或其他荧光蛋白，例如其中提及的DsRed作为负选择标记。此外，对比文件3中并未涉及EGFR或DsRed，也没有相应的技术教导。
综上所述，对比文件2-3并未公开或教导采用DsRed作为负选择标记/基因，其对于本领域技术人员而言并非显而易见的，因此，驳回决定认为权利要求1相对于对比文件1-3的组合不具备创造性的理由不成立。相应地，驳回决定在权利要求1不具备创造性的基础上进一步认为权利要求2-4不具备创造性的理由也不成立。
基于以上事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2018年07月12日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本次复审决定所针对文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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