发明创造名称：脂联素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用
外观设计名称：
决定号：200255
决定日：2020-01-13
委内编号：1F272891
优先权日：
申请（专利）号：201610505400.7
申请日：2016-06-30
复审请求人：深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：汤晨光
合议组组长：肖霞
参审员：邓晓蓓
国际分类号：G01N33/74;G01N33/532;G01N21/76
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求所请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征，该区别技术特征部分被其它对比文件公开且给出了技术启示，部分属于公知常识，在最接近的现有技术的基础上结合其它对比文件和公知常识获得该权利要求请求保护的技术方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610505400.7、名称为“脂联素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用”的发明专利申请（下称本申请），本申请的申请日为2016年06月30日，公开日为2016年12月07日，申请人为深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司。
经实质审查，国家知识产权局专利实质审查部门于2018年10月29日针对本申请作出驳回决定，驳回决定认为：权利要求1-10不具备专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定所针对的审查文本是：申请日2016年06月30日提交的说明书第1-19页、说明书附图第1页、说明书摘要、摘要附图，2018年06月26日提交的权利要求第1-10项。
驳回决定引用的对比文件如下：
对比文件2：CN102565405A，公开日为2012年07月11日。
对比文件3：CN104614536A，公开日为2015年05月13日。
对比文件4：“Analytical evaluation of a high-molecular-weight (HMW) adiponectin chemiluminescent enzyme immunoassay”，Suguru Hayama等，Clinica Chimica Acta，第411卷，第2073-2078页，公开日为2010年09月16日。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体；
所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体中，所述化学发光标记物为吖啶酯；
所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体中，所述化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素，所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体；
所述吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体通过如下制备方法制备得到：取脂联素单克隆抗体溶液，加入500μL pH8.0的磷酸盐缓冲液，加入0.1mg生物素琥珀酰亚胺混合，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中的液体保存，得到生物素标记的脂联素单克隆抗体；取链霉亲和素溶液，加入0.1mol/L～0.2mol/L、pH 9.0～9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温下避光反应，1～2h后取出，用zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的吖啶酯标记的链霉亲和素；将生物素标记的脂联素单克隆抗体和吖啶酯标记的链霉亲和素混合，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体。
2. 根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体为表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒。
3. 根据权利要求2所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒为表面带有氨基、羧基、甲苯磺酰基或环氧乙烷基的磁微粒。
4. 根据权利要求2或3所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒的粒径为0.05μm～3μm。
5. 根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于， 所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素。
6. 根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括脂联素定标品。
7. 一种权利要求1～6中任一项所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将脂联素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到脂联素单克隆抗体包被的固相载体；以及
将化学发光标记物和脂联素单克隆抗体混合并充分反应，得到化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体；其中，所述化学发光标记物为吖啶酯；所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体中，所述化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素，所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体，所述吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体通过如下制备方法制备得到：取脂联素单克隆抗体溶液，加入500μL pH8.0的磷酸盐缓冲液，加入0.1mg生物素琥珀酰亚胺混合，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中的液体保存，得到生物素标记的脂联素单克隆抗体；取链霉亲和素溶液，加入0.1mol/L～0.2mol/L、pH 9.0～9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温下避光反应，1～2h后取出，用zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的吖啶酯标记的链霉亲和素；将生物素标记的脂联素单克隆抗体和吖啶酯标记的链霉亲和素混合，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体。
8. 根据权利要求7所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体为表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒；
所述将脂联素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到脂联素单克隆抗体包被的固相载体的操作为：取表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用缓冲液重悬，接着活化剂活化所述表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒的表面连接基团，接着加入脂联素单克隆抗体，室温下充分反应，磁分离去除上清后重悬，得到脂联素单克隆抗体包被的表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒。
9. 根据权利要求7所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素；
所述将脂联素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到脂联素单克隆抗体包被的固相载体的操作为：将偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素的固相载体和偶联有生物素的脂联素单克隆抗体在缓冲液中混合，充分反应后得到脂联素单克隆抗体包被的固相载体。
10. 一种非疾病诊断和治疗目的的脂联素的浓度的检测方法，采用如权利要求1～6中任一项所述脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素的浓度的检测方法包括如下步骤：
使用脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体对待测样本进行夹心免疫试验，所述待测样本中的脂联素与脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体反应，形成夹心复合物，经过清洗分离后，测得待测样本的发光强度；
使用脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体对脂联素定标品进行夹心免疫试验，所述脂联素定标品中的脂联素与脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体反应，形成夹心复合物，经过清洗分离后，测得脂联素定标品的发光强度，根据所述脂联素定标品的发光强度和所述脂联素定标品的浓度构建横纵坐标分别为浓度和发光强度的脂联素的标准曲线；以及
将所述待测样本的发光信号带入所述脂联素的标准曲线中，计算得到所述待测样本中的脂联素的浓度。”
驳回决定具体指出：（1）权利要求1请求保护的技术方案与对比文件4公开的内容相比，区别在于：权利要求1是检测试剂盒，化学发光标记物是吖啶酯，并且限定了吖啶酯标记抗体的制备方法，而对比文件4是检测方法，化学发光标记物是碱性磷酸酶。该区别技术特征部分被对比文件2公开并给出了技术启示、部分被对比文件3公开并给出了技术启示、部分为本领域公知常识。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（2）从属权利要求2-6的附加技术特征或被对比文件4公开、或被对比文件2公开、或为公知常识。因此，权利要求2-6不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（3）权利要求7请求保护一种权利要求1-6中任一项所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，权利要求7请求保护的技术方案与对比文件4公开的内容相比，区别在于：权利要求7是检测试剂盒的制备方法，脂联素单克隆抗体包被的固相载体制备，以及与化学发光标记物混合通过生物素-链酶亲和素体系制备化学发光标记物吖啶酯标记的单克隆抗体，而对比文件4是脂联素的检测方法。该区别技术特征部分被对比文件2公开并给出了技术启示、部分被对比文件3公开并给出了技术启示、部分为本领域公知常识。因此，权利要求7不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（4）权利要求8请求保护根据权利要求7所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒。参见权利要求7的评述，本领域技术人员可以获得权利要求7所述的试剂盒。其进一步限定的特征部分被对比文件3公开、部分为本领域公知常识。因此，权利要求8不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（5）权利要求9请求保护根据权利要求7所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒。参见权利要求7的评述，本领域技术人员可以获得权利要求7所述的试剂盒。其进一步限定的特征部分被对比文件2公开、部分为本领域公知常识。因此，权利要求9不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（6）权利要求10要求保护一种脂联素的浓度的检测方法。参见权利要求1-6的评述本领域技术人员可以获得相关的脂联素检测试剂盒。权利要求10请求保护的技术方案与对比文件4公开的内容相比，区别进一步包括：权利要求10是用于非疾病诊断和治疗目的的脂联素浓度检测。该区别技术特征为本领域公知常识。因此，权利要求10不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2019年01月31日向国家知识产权局提出复审请求，提交了权利要求书的全文修改替换页，修改涉及：在权利要求1中进一步限定化学发光标记物还可以为碱性磷酸酶，化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体还可以为碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体，删除“所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体中，所述化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素”；在权利要求7中进一步限定化学发光标记物还可以为碱性磷酸酶，化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体或碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体，将“将化学发光标记物和脂联素单克隆抗体混合并充分反应，得到化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体”修改为“制备脂联素单克隆抗体包被的固相载体”；并将说明书具体实施方式中的三种制备方法的具体步骤加入到权利要求1和7中形成三个并列技术方案。同时陈述了本申请具备创造性的理由：本申请权利要求1解决的技术问题是如何提供试剂盒批内及批间稳定性好且检测灵敏度较高的脂联素化学发光免疫检测试剂盒。（1）本申请方案一、二、三中，单抗类型、磁珠与单抗的连接方法、单抗与磁微粒的混合物比例、反应温度和反应时间与对比文件3不同，这些都是发明人经过反复试验、不断研究才能够获得的，对试剂盒的抗干扰性、精密度和检测灵敏度有重要影响。并且，本申请采用含2%BSA的0.1mol/L、pH为8.0的Tris缓冲液重悬，Tris缓冲液对磁微粒包被母液进行小分子封闭，保证磁微粒包被母液的稳定性，保证试剂盒的批内及批间稳定性。（2）对于化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体制备，本申请方案二、三中均采用未活化吖啶酯标记的单抗，而对比文件2教导了采用预活化吖啶酯标记的单抗能够提高检测灵敏度，本领域技术人员没有动机采用未预活化的吖啶酯，本申请省略了预先活化吖啶酯的步骤仍然能够制备具有较高检测灵敏度的试剂盒。进一步，本申请方案三的生物素标记单抗制备过程中采用生物素琥珀酰亚胺，即琥珀酰亚胺修饰后的生物素，室温反应1~2h；而对比文件2采用预活化的生物素衍生物，室温反应30min，其教导了采用生物素衍生物在室温下合成具有较高检测灵敏度的生物素化抗体需要预先活化生物素衍生物，对比文件3采用生物素，于37℃反应2h，其教导了采用未经修饰的生物素直接标记单抗以提高灵敏度，并且需要提高反应温度至37℃，因此，本领域技术人员没有动机将生物素琥珀酰亚胺直接与脂联素单克隆抗体在室温下进行反应得到生物素标记的脂联素单克隆抗体以提高检测灵敏度。（3）对比文件4中所用的抗体为IH7单克隆抗体，即能与高分子量脂联素中的三聚体C-末端球状结构域发生抗原抗体结合，对于低分子量脂联素无法形成抗体抗原反应，与本申请中的脂联素单克隆抗体本质上属于两种完全不同功能的物质。并且，对于本申请方案一，对比文件4中检测脂联素的试剂盒为商业化的CLEIA试剂盒，其中的碱性磷酸酶偶联的IH7单克隆抗体的制备方法并未公开，本领域技术人员在申请日之前不能获得其制备方法，也不能从中获得实质性技术贡献。复审请求时提交的权利要求书如下：
“1. 一种脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体；
所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体中，所述化学发光标记物为吖啶酯或碱性磷酸酶；所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体或碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体；
其中，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg的甲苯磺酰基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用pH9.0～11.0的硼酸盐缓冲液重悬，加入2mg～4mg的脂联素单克隆抗体，加入0.5mL～2mL饱和硫酸铵溶液，37℃下旋转混合反应20h～30h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；所述碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体过如下制备方法制备得到：取500μL、2.0mg/mL的脂联素单克隆标记抗体，加入500μL、pH5.0的MES酸性缓冲液，加入1mg碱性磷酸酶混匀，然后加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐交联剂或加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐及1mg的N-羟基琥珀酰亚胺混合交联剂，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，得到碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体；
或者，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg的羧基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用0.02M、pH为5.5的MES缓冲液悬浮，加入0.5mL～2mL的10mg/mL的EDC水溶液，加入3mg～5mg的脂联素单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；所述吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体通过如下制备方法制备得到：取500μL、1.0mg/mL的脂联素单克隆标记抗体溶液，加入500μL、0.1～0.2M、pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液混匀，加入10μL～20μL、5mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1h～2h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体；
或者，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到： 取50mg的羧基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用0.02M、pH为5.5的MES缓冲液悬浮，加入0.5mL～2mL的10mg/mL的EDC水溶液，加入3mg～5mg的脂联素单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体中，所述化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素，所述吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体通过如下制备方法制备得到：取脂联素单克隆抗体溶液，加入500μL pH8.0的磷酸盐缓冲液，加入0.1mg生物素琥珀酰亚胺混合，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中的液体保存，得到生物素标记的脂联素单克隆抗体；取链霉亲和素溶液，加入0.1mol/L～0.2mol/L、pH 9.0～9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温下避光反应，1～2h后取出，用zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的吖啶酯标记的链霉亲和素；将生物素标记的脂联素单克隆抗体和吖啶酯标记的链霉亲和素混合，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体。
2. 根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体为表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒。
3. 根据权利要求2所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒为表面带有氨基、羧基、甲苯磺酰基或环氧乙烷基的磁微粒。
4. 根据权利要求2或3所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒的粒径为0.05μm～3μm。
5. 根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素。
6. 根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括脂联素定标品。
7. 一种权利要求1～6中任一项所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备脂联素单克隆抗体包被的固相载体；以及
将化学发光标记物和脂联素单克隆抗体混合并充分反应，得到化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体；其中，所述化学发光标记物为吖啶酯或碱性磷酸酶；所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体或碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体；
其中，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg的甲苯磺酰基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用pH9.0～11.0的硼酸盐缓冲液重悬，加入2mg～4mg的脂联素单克隆抗体，加入0.5mL～2mL饱和硫酸铵溶液，37℃下旋转混合反应20h～30h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；所述碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体过如下制备方法制备得到：取500μL、2.0mg/mL的脂联素单克隆标记抗体，加入500μL、pH5.0的MES酸性缓冲液，加入1mg碱性磷酸酶混匀，然后加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐交联剂或加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐及1mg的N-羟基琥珀酰亚胺混合交联剂，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，得到碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体；
或者，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg的羧基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用0.02M、pH为5.5的MES缓冲液悬浮，加入0.5mL～2mL的10mg/mL的EDC水溶液，加入3mg～5mg的脂联素单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；所述吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体通过如下制备方法制备得到：取500μL、1.0mg/mL的脂联素单克隆标记抗体溶液，加入500μL、0.1～0.2M、pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液混匀，加入10μL～20μL、5mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1h～2h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，得到吖啶 酯标记的脂联素单克隆抗体；
或者，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg的羧基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用0.02M、pH为5.5的MES缓冲液悬浮，加入0.5mL～2mL的10mg/mL的EDC水溶液，加入3mg～5mg的脂联素单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体中，所述化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素，所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体中，所述化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素，所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体，所述吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体通过如下制备方法制备得到：取脂联素单克隆抗体溶液，加入500μL pH8.0的磷酸盐缓冲液，加入0.1mg生物素琥珀酰亚胺混合，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中的液体保存，得到生物素标记的脂联素单克隆抗体；取链霉亲和素溶液，加入0.1mol/L～0.2mol/L、pH 9.0～9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温下避光反应，1～2h后取出，用zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的吖啶酯标记的链霉亲和素；将生物素标记的脂联素单克隆抗体和吖啶酯标记的链霉亲和素混合，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体。
8. 根据权利要求7所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体为表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒；
所述将脂联素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到脂联素单克隆抗体包被的固相载体的操作为：取表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用缓冲液重悬，接着活化剂活化所述表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒的表面连接基团，接着加入脂联素单克隆抗体，室温下充分反应，磁分离去除上清后重悬，得到脂联素单克隆抗体包 被的表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒。
9. 根据权利要求7所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素；
所述将脂联素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到脂联素单克隆抗体包被的固相载体的操作为：将偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素的固相载体和偶联有生物素的脂联素单克隆抗体在缓冲液中混合，充分反应后得到脂联素单克隆抗体包被的固相载体。
10. 一种非疾病诊断和治疗目的的脂联素的浓度的检测方法，采用如权利要求1～6中任一项所述脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素的浓度的检测方法包括如下步骤：
使用脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体对待测样本进行夹心免疫试验，所述待测样本中的脂联素与脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体反应，形成夹心复合物，经过清洗分离后，测得待测样本的发光强度；
使用脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体对脂联素定标品进行夹心免疫试验，所述脂联素定标品中的脂联素与脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体反应，形成夹心复合物，经过清洗分离后，测得脂联素定标品的发光强度，根据所述脂联素定标品的发光强度和所述脂联素定标品的浓度构建横纵坐标分别为浓度和发光强度的脂联素的标准曲线；以及
将所述待测样本的发光信号带入所述脂联素的标准曲线中，计算得到所述待测样本中的脂联素的浓度。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年02月15日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年08月28日向复审请求人发出复审通知书，指出：1、权利要求1包含三个并列技术方案，按照撰写顺序分别命名为方案一、方案二、方案三，①方案一与对比文件4的区别在于：（1）检测对象为脂联素，采用的抗体为脂联素单克隆抗体；将试剂形成试剂盒；（2）脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg的甲苯磺酰基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用pH9.0～11.0的硼酸盐缓冲液重悬，加入2mg～4mg的脂联素单克隆抗体，加入0.5mL～2mL饱和硫酸铵溶液，37℃下旋转混合反应20h～30h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体过如下制备方法制备得到：取500μL、2.0mg/mL的脂联素单克隆标记抗体，加入500μL、pH5.0的MES酸性缓冲液，加入1mg碱性磷酸酶混匀，然后加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐交联剂或加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐及1mg的N-羟基琥珀酰亚胺混合交联剂，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，得到碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体。区别技术特征（1）为本领域公知常识，区别技术特征（2）部分被对比文件3公开并给出了技术启示、部分被对比文件2公开并给出了技术启示、部分为本领域公知常识。因此，方案一不具备专利法第22条第3款规定的创造性。②方案二与对比文件4的区别在于：（1）检测对象为脂联素，采用的抗体为脂联素单克隆抗体；将试剂形成试剂盒；（2）脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg的羧基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用0.02M、pH为5.5的MES缓冲液悬浮，加入0.5mL～2mL的10mg/mL的EDC水溶液，加入3mg～5mg的脂联素单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体，通过如下制备方法制备得到：取500μL、1.0mg/mL的脂联素单克隆标记抗体溶液，加入500μL、0.1～0.2M、pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液混匀，加入10μL～20μL、5mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1h～2h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体。区别技术特征（1）为本领域公知常识，区别技术特征（2）部分被对比文件3公开并给出了技术启示、部分被对比文件2公开并给出了技术启示、部分为本领域公知常识。因此，方案二不具备专利法第22条第3款规定的创造性。③方案三与对比文件4的区别在于：（1）检测对象为脂联素，采用的抗体为脂联素单克隆抗体；将试剂形成试剂盒；（2）脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg的羧基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用0.02M、pH为5.5的MES缓冲液悬浮，加入0.5mL～2mL的10mg/mL的EDC水溶液，加入3mg～5mg的脂联素单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体，化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，脂联素单克隆抗体上偶联有生物素，通过如下制备方法制备得到：取脂联素单克隆抗体溶液，加入500μL pH8.0的磷酸盐缓冲液，加入0.1mg生物素琥珀酰亚胺混合，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中的液体保存，得到生物素标记的脂联素单克隆抗体；取链霉亲和素溶液，加入0.1mol/L～0.2mol/L、pH 9.0～9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温下避光反应，1～2h后取出，用zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的吖啶酯标记的链霉亲和素；将生物素标记的脂联素单克隆抗体和吖啶酯标记的链霉亲和素混合，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体。区别技术特征（1）为本领域公知常识，区别技术特征（2）部分被对比文件3公开并给出了技术启示、部分被对比文件2公开并给出了技术启示、部分为本领域公知常识。因此，方案三不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、从属权利要求2-6的附加技术特征或被对比文件4公开、或被对比文件2公开、或被对比文件3公开、或为公知常识。因此，权利要求2-6不具备专利法第22条第3款规定的创造性。3、权利要求7请求保一种权利要求1～6中任一项所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其中，“权利要求1～6中任一项所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒”已经不具备创造性。其进一步限定的制备方法中的所有步骤均已经包含在其引用的权利要求1的技术方案中，这些步骤均已经在权利要求1评述部分进行了评述。权利要求7与对比文件4的区别还包括：权利要求7是试剂盒的制备方法。该区别技术特征为本领域的惯用技术手段。因此，权利要求7不具备专利法第22条第3款规定的创造性。4、从属权利要求8、9的附加技术特征部分被对比文件2公开、部分被对比文件3公开、部分为公知常识。因此，权利要求8、9不具备专利法第22条第3款规定的创造性。5、权利要求10请求保护一种非疾病诊断和治疗目的的脂联素的浓度的检测方法，其中，“权利要求1～6中任一项所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒”已经不具备创造性。权利要求10与对比文件4的区别还包括：该检测方法为非疾病诊断和治疗目的，标准曲线的横纵坐标分别为浓度和发光强度。该区别技术特征为本领域的惯用技术手段。因此，权利要求10不具备专利法第22条第3款规定的创造性。6、对复审请求人的意见陈述进行了针对性回应。
复审请求人于2019年10月12日提交了意见陈述书和权利要求书的全文修改替换页，修改涉及：在权利要求1、7的三个并列技术方案中增加特征“粒径为0.05μm~3μm”，删除权利要求3中的“羧基、甲苯磺酰基”，删除权利要求4，删除权利要求5和9中的“链霉亲和素”，并适应性地修改了权利要求的编号和引用关系，同时陈述了本申请具备创造性的理由：本申请权利要求1包含三个并列技术方案，通过标记抗体制备过程的工艺条件和参数、抗体包被固相载体制备过程的工艺条件和参数，能够提高试剂盒批内和批间精密性、抗干扰性和检测灵敏度，解决的技术问题是提供一种试剂盒的批内及批间精密性较好、抗干扰性较好且检测灵敏度较高的脂联素化学发光免疫检测试剂盒。1、对于标记物标记抗体的制备，（1）方案二采用未经处理的吖啶酯、碳酸盐缓冲液，标记反应pH为9.0~9.5，对比文件2采用预活化的吖啶酯、0.05M的MES缓冲液，标记反应pH为5.0~6.0，两者的吖啶酯类型、反应pH不同。（2）方案三的标记物为吖啶酯，通过生物素-链霉亲和素进行间接标记，抗体与生物素琥珀酰亚胺在pH8.0、室温下反应，链霉亲和素与吖啶酯在pH9.0~9.5下室温反应，提高连接稳定性，对比文件3采用未经修饰的生物素，和抗体在pH9.5、37℃下反应，两者的生物素类型、反应pH和温度等参数均不同。虽然对比文件2的标记物为吖啶酯，但是标记物和抗体的连接方式为直接连接，反应pH为5.0~6.0。本申请的试剂盒的精密性明显优于对比文件2，具有预料不到的技术效果，对比文件2~4均没有公开如何调节吖啶酯与抗体进行标记反应的pH能够提高检测试剂盒的精密度。2、对于抗体包被磁珠的制备，（1）方案二、三的采用羧基磁珠，直接连接方法为EDC法，对比文件3采用羟基磁珠，直接连接方法为CMC法，对比文件3与本申请的磁珠类型、抗体和磁珠连接方法、单抗与磁微粒的混合物比例、反应温度和反应时间均不同；对比文件2采用羧基磁珠，连接方法为间接连接，对比文件2和对比文件3的磁珠不同，连接方法完全相反，连接过程中的反应体系和反应条件均不同，没有动机将对比文件2和对比文件3结合。并且，对比文件2和3明确教导缓冲液为PBS缓冲液，而方案二、三中包被磁珠溶液包括包被磁珠、BSA、pH为8.0的Tris缓冲液，Tris中的氨基能够与羧基磁珠上的O酰脲中间体结合，对磁微粒包被物进行小分子封闭，避免发生特异性结合。（2）方案一的磁珠活性基团为甲苯磺酰基，将具有磁珠、抗体、饱和硫酸铵溶液在37℃、pH9.0~11.0的条件下反应，得到的抗体包被固相载体的稳定性高。对比文件2采用羧基磁珠，反应条件pH4.7~5.0、室温，对比文件3采用羟基磁珠，反应条件为pH3.6、37℃，对比文件2、3与方案一的磁珠活性基团、磁珠和抗体的反应条件均不同，对比文件4也没有公开铁氧微粒子带有何种活性基团，对比文件2~4均没有公开如何将具有甲苯磺酰基化的磁珠与抗体连接。3、对比文件4中所用的抗体为IH7单克隆抗体，仅能与高分子量脂联素中的三聚体C-末端球状结构域发生抗原抗体结合，对于低分子量脂联素无法形成抗体抗原反应，与本申请中的脂联素单克隆抗体本质上属于两种完全不同功能的物质。4、本申请的抗体包被磁珠和标记物标记抗体的制备过程中，缓冲液类型、混合比例的数值、反应温度和反应时间等都是经过反复试验，不断研究才能够取得的数据，这些条件组合在一起构成了优选方案，对试剂盒的抗干扰性、精密度和检测灵敏度有着重要的影响，不能将各组分分裂开来。本次修改提交的权利要求书如下：
“1. 一种脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体；
所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体中，所述化学发光标记物为吖啶酯或碱性磷酸酶；所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体或碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体；
其中，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg、粒径为0.05μm～3μm的甲苯磺酰基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用pH9.0～11.0的硼酸盐缓冲液重悬，加入2mg～4mg的脂联素单克隆抗体，加入0.5mL～2mL饱和硫酸铵溶液，37℃下旋转混合反应20h～30h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；所述碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体过如下制备方法制备得到：取500μL、2.0mg/mL的脂联素单克隆标记抗体，加入500μL、pH5.0的MES酸性缓冲液，加入1mg碱性磷酸酶混匀，然后加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐交联剂或加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐及1mg的N-羟基琥珀酰亚胺混合交联剂，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，得到碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体；
或者，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg、粒径为0.05μm～3μm的羧基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用0.02M、pH为5.5的MES缓冲液悬浮，加入0.5mL～2mL的10mg/mL的EDC水溶液，加入3mg～5mg的脂联素单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；所述吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体通过如下制备方法制备得到：取500μL、1.0mg/mL的脂联素单克隆标记抗体溶液，加入500μL、0.1～0.2M、pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液混匀，加入10μL～20μL、5mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1h～2h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体；
或者，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg、粒径为0.05μm～3μm的羧基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用0.02M、pH为5.5的MES缓冲液悬浮，加入0.5mL～2mL的10mg/mL的EDC水溶液，加入3mg～5mg的脂联素单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体中，所述化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素，所述吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体通过如下制备方法制备得到：取脂联素单克隆抗体溶液，加入500μL pH8.0的磷酸盐缓冲液，加入0.1mg生物素琥珀酰亚胺混合，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中的液体保存，得到生物素标记的脂联素单克隆抗体；取链霉亲和素溶液，加入0.1mol/L～0.2mol/L、pH 9.0～9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温下避光反应，1～2h后取出，用zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的吖啶酯标记的链霉亲和素；将生物素标记的脂联素单克隆抗体和吖啶酯标记的链霉亲和素混合，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体。
2. 根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体为表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒。
3. 根据权利要求2所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒为表面带有氨基或环氧乙烷基的磁微粒。
4. 根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体上偶联有亲和素或中性亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素。
5. 根据权利要求1所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括脂联素定标品。
6. 一种权利要求1～5中任一项所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备脂联素单克隆抗体包被的固相载体；以及
将化学发光标记物和脂联素单克隆抗体混合并充分反应，得到化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体；其中，所述化学发光标记物为吖啶酯或碱性磷酸酶；所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体或碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体；
其中，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg、粒径为0.05μm～3μm的甲苯磺酰基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用pH9.0～11.0的硼酸盐缓冲液重悬，加入2mg～4mg的脂联素单克隆抗体，加入0.5mL～2mL饱和硫酸铵溶液，37℃下旋转混合反应20h～30h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；所述碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体过如下制备方法制备得到：取500μL、2.0mg/mL的脂联素单克隆标记抗体，加入500μL、pH5.0的MES酸性缓冲液，加入1mg碱性磷酸酶混匀，然后加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐交联剂或加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐及1mg的N-羟基琥珀酰亚胺混合交联剂，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，得到碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体；
或者，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg、粒径为0.05μm～3μm的羧基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用0.02M、pH为5.5的MES缓冲液悬浮，加入0.5mL～2mL的10mg/mL的EDC水溶液，加入3mg～5mg的脂联素单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；所述吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体通过如下制备方法制备得到：取500μL、1.0mg/mL的脂联素单克隆标记抗体溶液，加入500μL、0.1～0.2M、pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液混匀，加入10μL～20μL、5mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1h～2h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱 盐处理，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体；
或者，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg、粒径为0.05μm～3μm的羧基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用0.02M、pH为5.5的MES缓冲液悬浮，加入0.5mL～2mL的10mg/mL的EDC水溶液，加入3mg～5mg的脂联素单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体中，所述化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素，所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体中，所述化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素，所述化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体，所述吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体通过如下制备方法制备得到：取脂联素单克隆抗体溶液，加入500μL pH8.0的磷酸盐缓冲液，加入0.1mg生物素琥珀酰亚胺混合，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中的液体保存，得到生物素标记的脂联素单克隆抗体；取链霉亲和素溶液，加入0.1mol/L～0.2mol/L、pH 9.0～9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温下避光反应，1～2h后取出，用zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的吖啶酯标记的链霉亲和素；将生物素标记的脂联素单克隆抗体和吖啶酯标记的链霉亲和素混合，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体。
7. 根据权利要求6所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体为表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒；
所述将脂联素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到脂联素单克隆抗体包被的固相载体的操作为：取表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用缓冲液重悬，接着活化剂活化所述表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒的表面连接基团，接着加入脂联素单克 隆抗体，室温下充分反应，磁分离去除上清后重悬，得到脂联素单克隆抗体包被的表面带有用于蛋白质化学反应连接基团的磁微粒。
8. 根据权利要求6所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素单克隆抗体包被的固相载体中，所述固相载体上偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素，所述脂联素单克隆抗体上偶联有生物素；
所述将脂联素单克隆抗体和固相载体混合并充分反应，得到脂联素单克隆抗体包被的固相载体的操作为：将偶联有亲和素或中性亲和素的固相载体和偶联有生物素的脂联素单克隆抗体在缓冲液中混合，充分反应后得到脂联素单克隆抗体包被的固相载体。
9. 一种非疾病诊断和治疗目的的脂联素的浓度的检测方法，采用如权利要求1～5中任一项所述脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述脂联素的浓度的检测方法包括如下步骤：
使用脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体对待测样本进行夹心免疫试验，所述待测样本中的脂联素与脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体反应，形成夹心复合物，经过清洗分离后，测得待测样本的发光强度；
使用脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体对脂联素定标品进行夹心免疫试验，所述脂联素定标品中的脂联素与脂联素单克隆抗体包被的固相载体和化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体反应，形成夹心复合物，经过清洗分离后，测得脂联素定标品的发光强度，根据所述脂联素定标品的发光强度和所述脂联素定标品的浓度构建横纵坐标分别为浓度和发光强度的脂联素的标准曲线；以及
将所述待测样本的发光信号带入所述脂联素的标准曲线中，计算得到所述待测样本中的脂联素的浓度。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
复审请求人于2019年10月12日答复复审通知书时提交了权利要求书的全文修改替换页，经审查，该修改符合专利法第33条的规定。本复审请求审查决定所针对的审查文本为：申请日2016年06月30日提交的说明书第1-19页、说明书附图第1页、说明书摘要、摘要附图，2019年10月12日提交的权利要求第1-9项。
（二）关于创造性
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果一项权利要求所请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征，该区别技术特征部分被其它对比文件公开且给出了技术启示，部分属于公知常识，在最接近的现有技术的基础上结合其它对比文件和公知常识获得该权利要求请求保护的技术方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，则该权利要求不具备创造性。
1、权利要求1请求保护一种脂联素化学发光免疫检测试剂盒，其中，第3至5段采用“……或者……或者……”的形式分别限定了三个并列技术方案，为了便于描述，以下按照撰写顺序分别将这三个并列技术方案命名为方案一、方案二、方案三。
对比文件4公开了采用化学发光免疫测定对高分子量脂联素进行分析评价的方法，并具体披露了（参见摘要、第2074页左栏第1-2段、第2.2.1小节）：使用IH7单克隆抗体作为固相和检测抗体，制备了基于化学发光免疫测定的测定试剂，IH7单克隆抗体能够与脂联素三聚体的C末端球状结构域发生特异性反应，从而对高分子量脂联素进行检测；试剂包括：IH7单克隆抗体包被的铁氧体颗粒（相当于磁微粒）作为固相载体（对应于脂联素单克隆抗体包被的固相载体）、碱性磷酸酶偶联的IH7单克隆抗体（对应于化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体）；检测时，将样品稀释后与IH7单克隆抗体包被的铁氧体颗粒一起孵育，洗涤后，与碱性磷酸酶偶联的IH7单克隆抗体一起孵育，洗涤后，加入底物溶液一起孵育，然后测定相对化学发光强度。
①方案一与对比文件4的区别在于：（1）检测对象为脂联素，采用的抗体为脂联素单克隆抗体；将试剂形成试剂盒；（2）脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg、粒径为0.05μm～3μm的甲苯磺酰基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用pH9.0～11.0的硼酸盐缓冲液重悬，加入2mg～4mg的脂联素单克隆抗体，加入0.5mL～2mL饱和硫酸铵溶液，37℃下旋转混合反应20h～30h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体过如下制备方法制备得到：取500μL、2.0mg/mL的脂联素单克隆标记抗体，加入500μL、pH5.0的MES酸性缓冲液，加入1mg碱性磷酸酶混匀，然后加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐交联剂或加入1mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐及1mg的N-羟基琥珀酰亚胺混合交联剂，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，得到碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体。基于上述区别技术特征可以确定本申请权利要求1中的方案一实际解决的技术问题是：提供一种对脂联素进行高精度、高灵敏度、高稳定性化学发光免疫检测的试剂盒以及试剂的具体制备方式。
对于区别技术特征（1），在对比文件4利用IH7单克隆抗体，即高分子量脂联素的单克隆抗体对高分子量脂联素进行化学发光免疫检测的基础上，当本领域技术人员面对脂联素的检测需求时，有动机采用能够特异性结合脂联素的脂联素单克隆抗体进行化学发光免疫检测，不需要付出创造性劳动。另外，为了方便试剂使用和实现商品化，将检测中所使用到的试剂制备形成试剂盒的形式属于本领域的惯用技术手段。
对于区别技术特征（2），首先，对比文件3公开了一种检测胃泌素-17的试剂盒，并具体披露了（参见说明书[0016]-[0019]、[0023]-[0024]、[0044]、[0064]-[0074]、[0097]-[0101]段）：采用双抗体夹心模式的化学发光免疫检测，试剂包括示踪标记物直接标记的第一抗胃泌素-17抗体、第一抗胃泌素-17抗体直接包被的磁球，其中，示踪标记物可以为吖啶酯、碱性磷酸酶、ABEI，磁球通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2，磁球粒径为0.1-5μm；具体实施方式中的制备1公开了包被第一抗胃泌素-17抗体的磁球悬浮液的制备方法，使用Merck公司生产的、含有羟基修饰的纳米磁球悬浮液，将磁球悬浮于醋酸缓冲液，加入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC)，加入纯化的第一抗胃泌素-17抗体，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时，磁分离，倒掉上清，采用PBS清洗液进行清洗，将清洗后的磁球加入包被体积的混合溶液，混合溶液主要成分：0.2g/ml的KH2PO4、2.9g/ml的NaHPO4、8g/ml的NaCl、2g/ml的NaN3、5g/ml的BSA，2ml/ml的吐温T-20，余量为纯化水，得到磁球悬浮液；制备4公开了标记有ABEI的第一抗胃泌素-17抗体溶液的制备方法，取胃泌素-17单抗进行透析，将透析好的溶液加入ABEI-半琥珀酰胺酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，37℃反应2小时，得到标记ABEI的第一抗胃泌素-17抗体溶液，采用G-25凝胶柱进行纯化，可见，对比文件3公开了在基于磁珠和双抗体夹心法的化学发光免疫检测中，抗体直接包被磁珠固相载体的具体制备方式，包括磁珠修饰、重悬、直接结合抗体、反应条件、分离清洗、BSA封闭等步骤，以及化学发光标记物对检测抗体直接标记的制备方式，因而给出了如何制备基于磁珠和双抗体夹心法的化学发光免疫检测试剂盒中相应试剂的技术启示。此外，对比文件2公开了一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法，并具体披露了（参见说明书[0007]-[0018]、[0027]-[0034]段）：以（链酶）亲和素偶联的超顺磁颗粒作为通用的固相载体，以不同生物素化抗原/抗体分子作为捕获试剂，以吖啶酯(或吖啶磺酰胺)标记的抗原/抗体分子作为检测试剂；不同吖啶酯或吖啶磺酰胺联通过不同偶联剂偶联不同检测抗原/抗体分子各种活性基团，偶联或标记技术是指利用常见的活性基团诸如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)、羟基(-OH)、巯基(-SH)借助不同偶联剂如二甲基亚胺(EDC)、戊二醛、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、SATA、SMCC等进行分子间连结的方法，即对比文件2给出了在基于磁珠和双抗体夹心法的化学发光免疫检测中，化学发光标记物和抗体之间可以借助EDC等偶联剂进行结合的技术启示。此外，对比文件2的实施例1公开了在试剂制备过程中可以采用MES缓冲液、硼酸缓冲液、PBS缓冲液。在上述内容的基础上，本领域技术人员在面临如何制备脂联素单克隆抗体包被的磁微粒和碱性磷酸酶标记的脂联素单克隆抗体时，有动机借鉴对比文件2和3中的制备方式，并根据具体需要进行常规调整，例如，选择具体的本领域常用的修饰基团、偶联剂、缓冲液、封闭剂、重悬方式、纯化方式、反应条件、试剂用量等，这不需要付出创造性劳动，其效果也是可以预期的。
因此，在对比文件4的基础上结合对比文件3、对比文件2以及本领域公知常识以获得方案一对于本领域技术人员来说是显而易见的，其不具有突出的实质性特点和显著的进步。
②方案二与对比文件4的区别在于：（1）检测对象为脂联素，采用的抗体为脂联素单克隆抗体；将试剂形成试剂盒；（2）脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg、粒径为0.05μm～3μm的羧基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用0.02M、pH为5.5的MES缓冲液悬浮，加入0.5mL～2mL的10mg/mL的EDC水溶液，加入3mg～5mg的脂联素单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体，通过如下制备方法制备得到：取500μL、1.0mg/mL的脂联素单克隆标记抗体溶液，加入500μL、0.1～0.2M、pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液混匀，加入10μL～20μL、5mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1h～2h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体。基于上述区别技术特征可以确定本申请权利要求1中的方案二实际解决的技术问题是：提供一种对脂联素进行高精度、高灵敏度、高稳定性化学发光免疫检测的试剂盒、发光标记物的具体选择以及试剂的具体制备方式。
对于区别技术特征（1），在对比文件4利用IH7单克隆抗体，即高分子量脂联素的单克隆抗体对高分子量脂联素进行化学发光免疫检测的基础上，当本领域技术人员面对脂联素的检测需求时，有动机采用能够特异性结合脂联素的脂联素单克隆抗体进行化学发光免疫检测，不需要付出创造性劳动。另外，为了方便试剂使用和实现商品化，将检测中所使用到的试剂制备形成试剂盒的形式属于本领域的惯用技术手段。
对于区别技术特征（2），首先，对比文件3公开了一种检测胃泌素-17的试剂盒，并具体披露了（参见说明书[0016]-[0019]、[0023]-[0024]、[0044]、[0064]-[0074]、[0097]-[0101]段）：采用双抗体夹心模式的化学发光免疫检测，试剂包括示踪标记物直接标记的第一抗胃泌素-17抗体、第一抗胃泌素-17抗体直接包被的磁球，其中，示踪标记物可以为吖啶酯、碱性磷酸酶、ABEI，磁球通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2，磁球粒径为0.1-5μm；具体实施方式中的制备1公开了包被第一抗胃泌素-17抗体的磁球悬浮液的制备方法，使用Merck公司生产的、含有羟基修饰的纳米磁球悬浮液，将磁球悬浮于醋酸缓冲液，加入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC)，加入纯化的第一抗胃泌素-17抗体，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时，磁分离，倒掉上清，采用PBS清洗液进行清洗，将清洗后的磁球加入包被体积的混合溶液，混合溶液主要成分：0.2g/ml的KH2PO4、2.9g/ml的NaHPO4、8g/ml的NaCl、2g/ml的NaN3、5g/ml的BSA，2ml/ml的吐温T-20，余量为纯化水，得到磁球悬浮液；制备4公开了标记有ABEI的第一抗胃泌素-17抗体溶液的制备方法，取胃泌素-17单抗进行透析，pH9.5的透析液采用Na2CO3、NaHCO3和水配制，即pH9.5的碳酸盐缓冲液，将透析好的溶液加入ABEI-半琥珀酰胺酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，37℃反应2小时，得到标记ABEI的第一抗胃泌素-17抗体溶液，采用G-25凝胶柱进行纯化，可见，对比文件3公开了在基于磁珠和双抗体夹心法的化学发光免疫检测中，化学发光标记物可以采用吖啶酯，抗体直接包被磁珠固相载体的具体制备方式，包括磁珠修饰、重悬、直接结合抗体、分离清洗、BSA封闭等步骤，以及化学发光标记物对检测抗体直接标记的制备方式，因而给出了如何制备基于磁珠和双抗体夹心法的化学发光免疫检测试剂盒中相应试剂的技术启示。此外，对比文件2公开了一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法，并具体披露了（参见说明书[0007]-[0018]、[0027]-[0034]段）：以（链酶）亲和素偶联的超顺磁颗粒作为通用的固相载体，以不同生物素化抗原/抗体分子作为捕获试剂，以吖啶酯(或吖啶磺酰胺)标记的抗原/抗体分子作为检测试剂；超顺磁颗粒是指以四氧化三铁为内核、表面包裹带有诸如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)、羟基(-OH)、巯基(-SH)或其他易于偶联的活性基团的聚合物，偶联或标记技术是指利用常见的活性基团诸如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)、羟基(-OH)、巯基(-SH)借助不同偶联剂如二甲基亚胺(EDC)、戊二醛、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、SATA、SMCC等进行分子间连结的方法，即对比文件2给出了在基于磁珠和双抗体夹心法的化学发光免疫检测中，磁珠表面活性基团可以采用羧基，偶联剂可以采用EDC的技术启示，本领域技术人员可以根据需要将其应用于磁微粒和抗体的偶联制备。此外，对比文件2的实施例1公开了在试剂制备过程中可以采用MES缓冲液、硼酸缓冲液、PBS缓冲液。在上述内容的基础上，本领域技术人员在面临如何制备脂联素单克隆抗体包被的磁微粒和吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体时，有动机借鉴对比文件2和3中的制备方式，并根据具体需要进行常规调整，例如，选择具体的本领域常用的缓冲液、封闭剂、重悬方式、纯化方式、反应条件、试剂用量等，这不需要付出创造性劳动，其效果也是可以预期的。
因此，在对比文件4的基础上结合对比文件3、对比文件2以及本领域公知常识以获得方案二对于本领域技术人员来说是显而易见的，其不具有突出的实质性特点和显著的进步。
③方案三与对比文件4的区别在于：（1）检测对象为脂联素，采用的抗体为脂联素单克隆抗体；将试剂形成试剂盒；（2）脂联素单克隆抗体包被的固相载体通过如下制备方法制备得到：取50mg、粒径为0.05μm～3μm的羧基化的磁微粒悬浮液，固液分离弃去上清，用0.02M、pH为5.5的MES缓冲液悬浮，加入0.5mL～2mL的10mg/mL的EDC水溶液，加入3mg～5mg的脂联素单克隆抗体，室温下混悬2h～10h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的0.1M、pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到脂联素单克隆抗体包被的磁颗粒；化学发光标记物标记的脂联素单克隆抗体为吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体，化学发光标记物上偶联有链霉亲和素，脂联素单克隆抗体上偶联有生物素，通过如下制备方法制备得到：取脂联素单克隆抗体溶液，加入500μL pH8.0的磷酸盐缓冲液，加入0.1mg生物素琥珀酰亚胺混合，室温下避光反应，1h～2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，收集脱盐管中的液体保存，得到生物素标记的脂联素单克隆抗体；取链霉亲和素溶液，加入0.1mol/L～0.2mol/L、pH 9.0～9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温下避光反应，1～2h后取出，用zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的吖啶酯标记的链霉亲和素；将生物素标记的脂联素单克隆抗体和吖啶酯标记的链霉亲和素混合，得到吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体。基于上述区别技术特征可以确定本申请权利要求1中的方案三实际解决的技术问题是：提供一种对脂联素进行高精度、高灵敏度、高稳定性化学发光免疫检测的试剂盒、发光标记物的具体选择以及试剂的具体制备方式。
对于区别技术特征（1），在对比文件4利用IH7单克隆抗体，即高分子量脂联素的单克隆抗体对高分子量脂联素进行化学发光免疫检测的基础上，当本领域技术人员面对脂联素的检测需求时，有动机采用能够特异性结合脂联素的脂联素单克隆抗体进行化学发光免疫检测，不需要付出创造性劳动。另外，为了方便试剂使用和实现商品化，将检测中所使用到的试剂制备形成试剂盒的形式属于本领域的惯用技术手段。
对于区别技术特征（2），首先，对比文件3公开了一种检测胃泌素-17的试剂盒，并具体披露了（参见说明书[0016]-[0019]、[0023]-[0024]、[0044]、[0064]-[0074]、[0103]-[0107]、[0132]-[0136]段）：采用双抗体夹心模式的化学发光免疫检测，试剂包括示踪标记物间接标记的第一抗胃泌素-17抗体、第一抗胃泌素-17抗体直接包被的磁球，其中，示踪标记物可以为吖啶酯、碱性磷酸酶、ABEI，示踪标记物通过链霉亲和素与生物素体系间接地标记第一抗胃泌素-17抗体，即采用生物素化的第一抗胃泌素-17抗体和标记链霉亲和素的示踪标记物，磁球通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2，磁球粒径为0.1-5μm；具体实施方式中的制备1公开了包被第一抗胃泌素-17抗体的磁球悬浮液的制备方法，使用Merck公司生产的、含有羟基修饰的纳米磁球悬浮液，将磁球悬浮于醋酸缓冲液，加入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC)，加入纯化的第一抗胃泌素-17抗体，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时，磁分离，倒掉上清，采用PBS清洗液进行清洗，将清洗后的磁球加入包被体积的混合溶液，混合溶液主要成分：0.2g/ml的KH2PO4、2.9g/ml的NaHPO4、8g/ml的NaCl、2g/ml的NaN3、5g/ml的BSA，2ml/ml的吐温T-20，余量为纯化水，得到磁球悬浮液；制备5公开了第一抗胃泌素-17抗体标记的生物素溶液的制备方法，取第一抗胃泌素-17抗体进行透析，将透析好的溶液加入生物素，37℃反应2小时，得到生物素化的第一抗胃泌素-17抗体溶液，采用G-25凝胶柱进行纯化，加入含BSA的保护液；制备10公开了标记链霉亲和素的ABEI溶液的制备方法，取链霉亲和素，用透析液进行溶解并透析，pH9.5的透析液采用Na2CO3、NaHCO3和水配制，即pH9.5的碳酸盐缓冲液，将透析好的溶液加入ABEI-半琥珀酰胺酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯，37℃反应2小时，得到标记链霉亲和素的ABEI溶液，采用G-25凝胶柱进行纯化，加入含BSA的保护液。可见，对比文件3公开了在基于磁珠和双抗体夹心法的化学发光免疫检测中，化学发光标记物可以采用吖啶酯，抗体直接包被磁珠固相载体的具体制备方式，包括磁珠修饰、重悬、直接结合抗体、分离清洗、BSA封闭等步骤，以及化学发光标记物标记的检测抗体可以通过生物素与链霉亲和素进行间接连接、生物素标记的检测抗体和化学发光标记物标记的链霉亲和素的具体制备方式，包括反应、纯化等步骤，因而给出了如何制备基于磁珠和双抗体夹心法的化学发光免疫检测试剂盒中相应试剂的技术启示。此外，对比文件2公开了一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法，并具体披露了（参见说明书[0007]-[0018]、[0027]-[0034]段）：以（链酶）亲和素偶联的超顺磁颗粒作为通用的固相载体，以不同生物素化抗原/抗体分子作为捕获试剂，以吖啶酯(或吖啶磺酰胺)标记的抗原/抗体分子作为检测试剂；超顺磁颗粒是指以四氧化三铁为内核、表面包裹带有诸如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)、羟基(-OH)、巯基(-SH)或其他易于偶联的活性基团的聚合物，偶联或标记技术是指利用常见的活性基团诸如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)、羟基(-OH)、巯基(-SH)借助不同偶联剂如二甲基亚胺(EDC)、戊二醛、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、SATA、SMCC等进行分子间连结的方法，即对比文件2给出了在基于磁珠和双抗体夹心法的化学发光免疫检测中，磁珠表面活性基团可以采用羧基，偶联剂可以采用EDC的技术启示，本领域技术人员可以根据需要将其应用于磁微粒和抗体的偶联制备。此外，对比文件2还公开了生物素可以是以偶联为目的进行修饰产生的生物素衍生物，实施例1还公开了在试剂制备过程中可以采用MES缓冲液、硼酸缓冲液、PBS缓冲液。在上述内容的基础上，本领域技术人员在面临如何制备脂联素单克隆抗体包被的磁微粒和吖啶酯标记的脂联素单克隆抗体时，有动机借鉴对比文件2和3中的制备方式，并根据具体需要进行一些常规调整，例如，选择具体的本领域常用的缓冲液、封闭剂、生物素、重悬方式、纯化方式、反应条件、试剂用量等，这不需要付出创造性劳动，其效果也是可以预期的。而在对比文件3制备获得了生物素标记的抗体与化学发光标记物标记的链霉亲和素的基础上，将两者直接混合以形成试剂盒中的化学发光标记物标记的单克隆抗体为本领域的惯用技术手段。
因此，在对比文件4的基础上结合对比文件3、对比文件2以及本领域公知常识以获得方案三对于本领域技术人员来说是显而易见的，其不具有突出的实质性特点和显著的进步。
综上，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2、对从属权利要求2-3，对比文件4公开了固相载体为IH7单克隆抗体包被的铁氧体颗粒（相当于磁微粒）；对比文件3公开了磁球通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2；对比文件2公开了超顺磁颗粒的表面包裹带有诸如氨基(NH2-)、羟基(-OH)、巯基(-SH)或其他易于偶联的活性基团。在此基础上，为了便于磁微粒与抗体之间偶联，磁微粒表面带有环氧乙烷基等用于蛋白质化学反应连接的基团也属于本领域的惯用技术手段。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求2-3也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、从属权利要求4对权利要求1作了进一步的限定，对比文件3公开了（参见说明书第[0024]、[0027]段）：第二抗胃泌素-17抗体通过链霉亲和素与生物素体系间接地包被磁球，磁球包被有链霉亲和素，第二抗胃泌素-17抗体偶联有生物素；对比文件2公开了（参见说明书[0007]-[0014]段）：以（链酶）亲和素偶联的超顺磁颗粒作为通用的固相载体，以不同生物素化抗原/抗体分子作为捕获试剂，（链酶）亲和素包括亲和素、链霉亲和素、中性亲和素。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
4、从属权利要求5对权利要求1作了进一步的限定，对比文件4公开了（参见第2074页左栏第2.2.1节）：使用5个浓度的标准品构建标准曲线。在此基础上，本领域技术人员容易想到在脂联素检测试剂盒中设置脂联素定标品。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求5也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
5、权利要求6请求保护一种权利要求1～5中任一项所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其中，参见对权利要求1-5的评述可知，“权利要求1～5中任一项所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒”已经不具备创造性。而权利要求6进一步限定的制备方法中的所有步骤均已经包含在其引用的权利要求1的技术方案中，这些步骤均已经在权利要求1评述部分进行了评述。权利要求6与对比文件4的区别还包括：权利要求6是试剂盒的制备方法。然而，将检测中所使用到的试剂制备形成试剂盒的形式属于本领域的惯用技术手段。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求6不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
6、权利要求7对权利要求6作了进一步的限定，参见对权利要求1方案二和三的评述（出处同上），对比文件3公开了：磁球通过表面改性而带有多种活性功能基团，具体实施方式中的制备1公开了包被第一抗胃泌素-17抗体的磁球悬浮液的制备方法，使用Merck公司生产的、含有羟基修饰的纳米磁球悬浮液，将磁球悬浮于醋酸缓冲液，加入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC)，加入纯化的第一抗胃泌素-17抗体，放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时，磁分离，倒掉上清，采用PBS清洗液进行清洗，将清洗后的磁球加入包被体积的混合溶液，得到磁球悬浮液。对比文件2公开了：超顺磁颗粒表面包裹带有易于偶联的活性基团的聚合物，偶联或标记技术是指利用常见的活性基团借助不同偶联剂进行分子间连结的方法。此外，反应前对磁微粒进行磁分离和重悬、反应温度为室温等均是本领域技术人员根据具体需要可以进行常规选取和调整的，不需要付出创造性劳动。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求7不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
7、权利要求8对权利要求6作了进一步的限定，对比文件3公开了（参见说明书第[0024]、[0027]段）：第二抗胃泌素-17抗体通过链霉亲和素与生物素体系间接地包被磁球，磁球包被有链霉亲和素，第二抗胃泌素-17抗体偶联有生物素；对比文件2公开了（参见说明书[0007]-[0014]段）：以（链酶）亲和素偶联的超顺磁颗粒作为通用的固相载体，以不同生物素化抗原/抗体分子作为捕获试剂，（链酶）亲和素包括亲和素、链霉亲和素、中性亲和素。而在对比文件3、2中制备获得了偶联有链霉亲和素、亲和素或中性亲和素的固相载体与偶联有生物素的抗体的基础上，将两者在缓冲液中混合反应以形成试剂盒中的单克隆抗体包被的固相载体为本领域的惯用技术手段。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求8也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
9、权利要求9请求保护一种非疾病诊断和治疗目的的脂联素的浓度的检测方法，其中，参见对权利要求1-5的评述可知，“权利要求1～5中任一项所述的脂联素化学发光免疫检测试剂盒”已经不具备创造性。对比文件4公开了采用化学发光免疫测定对高分子量脂联素进行分析评价的方法，并具体披露了（参见摘要、第2074页左栏第1-2段、第2.2.1小节）：采用筒式CLEIA试剂，将样品稀释后与IH7单克隆抗体包被的铁氧体颗粒在检测筒中一起孵育，洗涤后，与碱性磷酸酶偶联的IH7单克隆抗体一起孵育（本领域技术人员可以直接地、毫无疑义地确定形成夹心复合物，从而进行夹心免疫试验），洗涤后（相当于清洗分离后），加入底物溶液一起孵育，然后测定相对化学发光强度；高分子量脂联素的浓度是通过标准曲线来计算得到的，标准曲线是通过5个浓度的标准品来得到的（本领域技术人员可以直接地、毫无疑义地确定标准品也经历了样品同样的检测过程，并且，将待测样本的发光信号强度代入标准曲线中计算得到待测样本中的脂联素的浓度）。权利要求9与对比文件4的区别还包括：该检测方法为非疾病诊断和治疗目的，标准曲线的横纵坐标分别为浓度和发光强度。然而，对于本领域技术人员来说，将脂联素浓度的检测方法应用于非疾病诊断和治疗目的为本领域技术人员根据实际需求可以进行选择的，绘制标准曲线时以浓度为横坐标、发光强度为纵坐标为本领域的惯用技术手段。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求9不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）针对复审请求人的意见陈述
对于复审请求人在答复复审通知书时的意见陈述，合议组认为：
1、对于标记物标记抗体的制备，对于方案二，对比文件2公开了采用吖啶酯作为化学发光标记物对抗体进行标记，而在将标记物标记到抗体上时，标记物无论是否经历活化处理均是本领域的常规选择，各自特点为本领域技术人员所熟知，效果也是可以预期的，本领域技术人员可以根据具体需要选择未经处理的吖啶酯。对于方案三，对比文件3公开了标记物可以为吖啶酯，通过链霉亲和素与生物素体系间接地标记抗体，而在应用生物素-亲和素连接体系将生物素偶联到抗体时，采用生物素或是经修饰产生的生物素衍生物均是本领域的常规选择（例如，对比文件2中就公开了生物素可以是任何以偶联为目的进行修饰产生的生物素衍生物），各自特点为本领域技术人员所熟知，效果也是可以预期的，本领域技术人员可以根据具体需要选择采用生物素琥珀酰亚胺进行偶联。至于本申请所采用的缓冲液、反应pH、温度等参数，均是本领域常用的缓冲液类型和常见的pH、温度范围，本领域技术人员可以针对不同被检测物和检测具体需要进行选取和调整，这属于本领域技术人员应具备的基本实验技能，效果也是可以预期的。此外，对于本申请和对比文件2之间的精密性对比，首先，针对不同的吖啶酯类型、生物素类型、反应pH和温度等因素，本申请说明书中并没有给出任何实验对比数据来证明本申请的精密性是由于选择上述特定的参数所导致；其次，本申请和对比文件2实施例所针对的检测对象存在差异，检测体系也不完全相同，两者的结果精密性并没有直接可比性。
2、对于磁珠和抗体的连接方式，对比文件3公开了可以直接连接、也可以间接连接，并且磁球通过表面改性而带有包括羧基在内的多种活性功能基团，实施例中还采用了CMC进行活化，对比文件2公开了磁颗粒表面包裹带有易于偶联的活性基团，利用常见的活性基团借助不同偶联剂进行分子间连接，活性基团包括羧基，偶联剂包括EDC，在此基础上，本领域技术人员可以根据具体需要选择采用羧基修饰的磁珠并借助EDC进行偶联以获得方案二、三中的连接方式；方案一中的甲苯磺酰基也是常用的用于修饰磁珠的活性基团，可以根据需要选择使用。对于单抗与磁微粒的混合物比例、反应温度、时间、pH等条件参数，针对不同被检测物和检测具体需要，在本领域的常规范围内对具体试剂、用量、操作方式、反应条件进行选取和调整，属于本领域技术人员应具备的基本实验技能，效果也是可以预期的。对于方案二、三中采用的缓冲液，对比文件3公开了加入含BSA的溶液对包被有抗体的磁珠进行重悬，与本申请一样，均起到封闭作用，本领域中，当抗原或抗体结合到磁珠上后，采用BSA或Tris等含有氨基的试剂去封闭一些未结合等基团，以减少磁珠与无关物质的结合，这属于公知常识，本领域技术人员可以根据具体需要选择采用本领域中常见的含BSA的Tris缓冲液对制备得到的包被有抗体的磁珠进行封闭、重悬，其效果也是可以预期的。
3、对比文件4检测对象物为高分子脂联素，采用了能够特意结合高分子脂联素的IH7单克隆抗体，而当本领域技术人员需要对脂联素进行免疫检测时，自然也容易想到采用能够特异性结合脂联素的脂联素单克隆抗体，并且，脂联素单克隆抗体也是本领域技术人员可以常规获得的商业化试剂，不需要付出创造性劳动。
4、在进行创造性评述时，合议组并非是将试剂盒的各个成分及其制备步骤孤立地来看待，而是按照专利法的规定，从整体上进行判断。从整体上理解，本申请的发明构思为采用磁微粒为固相载体、吖啶酯/碱性磷酸酶为发光标记物的双抗体夹心化学发光免疫检测体系来测定脂联素，在这一点上，对比文件2、3、4同本申请一样，均涉及以磁微粒为固相载体、吖啶酯/碱性磷酸酶为标记物的双抗体夹心化学发光免疫检测体系，其中，对比文件4作为最接近的现有技术，公开了检测对象为高分子脂联素，在此基础上，当本领域技术人员面对脂联素的检测需求时，有动机采用能够特异性结合脂联素的脂联素单克隆抗体进行类似的双抗体夹心化学发光免疫检测。在此基础上，对于抗体包被磁珠和标记物标记抗体的具体制备方法步骤，参见对权利要求的评述可知，部分被对比文件2公开，部分被对比文件3公开，部分为本领域的常规选择，本领域技术人员可以根据不同被检测物的检测需要来选择使用并进行适应性调整。此外，对于复审请求人强调的技术效果，本申请说明书中仅给出了化学发光免疫检测和酶联免疫吸附检测之间的结果比较，获得的技术效果也是由于整体上采用了化学发光免疫检测而导致的，而针对化学发光免疫检测体系，并没有给出任何实验数据对上述不同参数条件下的检测结果进行比较，即本申请说明书中并没有记载上述特定参数条件的选择可以产生预料不到的技术效果，相反，如对权利要求1的评述可知，这些参数条件在本领域中均是常规的，本领域技术人员可以针对不同被检测物和检测具体需要进行选取和调整，这属于本领域技术人员应具备的实验技能，效果也是可以预期的。
综上，对于复审请求人的意见陈述，合议组不予支持。
基于以上事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年10月29日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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