发明创造名称：利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法
外观设计名称：
决定号：201405
决定日：2020-01-11
委内编号：1F272319
优先权日：
申请（专利）号：201610537375.0
申请日：2016-07-08
复审请求人：黑龙江东方学院
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：淡美俊
合议组组长：张礅
参审员：王咪娜
国际分类号：G01N30/02
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求与作为最接近的现有技术的对比文件相比存在区别特征，而另一份对比文件公开了一部分区别特征并给出与最接近现有技术相结合的技术启示，其余部分区别特征是本领域技术人员根据常规技术手段通过有限的试验就能确定的参数选择，则该项权利要求不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610537375.0、名称为“利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法”的发明专利申请（下称本申请），其申请日为2016年07月08日，公开日为2016年12月14日，申请人为黑龙江东方学院。
国家知识产权局专利实质审查部门以本申请权利要求1-5不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由于2018年11月21日驳回了本申请。驳回决定中引用了如下对比文件：
对比文件1：“高效液相色谱法测定乳粉中的核苷酸”，张秋梅 等，《中国乳品工业》，第37卷第4期，第51-54页，公开日为2009年12月31日；
对比文件2：“高效液相色谱法测定乳制品中核苷酸的含量”，田燕 等，《中国食品添加剂》，第4期，第138-143页，公开日为2014年12月31日。
驳回决定所针对的文本为：申请日2016年07月08日提交的说明书摘要、说明书第1-8页、说明书附图第1-6页；2018年05月02日提交的权利要求第1-5项。
驳回决定所针对的权利要求如下：
“1. 一种利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述方法步骤如下：
一、准确称取配方奶粉样品5.0 g，加入25ml、50~60℃水溶解转移至50 ml容量瓶中进行超声提取；所述超声提取时间为5~20 min；
二、向步骤一的容量瓶中加入5 ml质量浓度为13％的高氯酸，定容至刻度；滤纸过滤，取25 ml初滤液用氢氧化钠调节PH至6.75~6.85，定容至50 ml容量瓶，滤纸过滤，微孔滤膜过滤；
三、在254nm检测波长下，采用Welch NCOT-C18色谱柱，以四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲溶液和甲醇作为流动相，对步骤二的滤液进行洗脱；所述流动相中，四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲溶液和甲醇的体积比为95∶5；所述流动相的PH＝3.0~3.5。
2. 根据权利要求1所述的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述超声提取时间为10 min。
3. 根据权利要求1所述的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述微孔滤膜的孔径为0.22 μm。
4. 根据权利要求1所述的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述流动相的PH＝3.3。
5. 根据权利要求1所述的利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，其特征在于所述四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲溶液中，四丁基硫酸氢铵的浓度为1.4mmol/L。”
驳回决定的具体理由是：1、权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）称取的样品质量、加入的水的体积及温度，先转移至容量瓶再超声提取；（2）使用质量浓度为13％的高氯酸沉淀蛋白，并取25 ml初滤液用氢氧化钠调节PH至6.75～6.85后定容至50 ml容量瓶；（3）色谱柱的品牌，其中流动相的PH值。区别技术特征（1）是本领域的常规技术手段，区别技术特征（2）是本领域在对比文件1的基础上结合对比文件2的和本领域的常规技术手段可以得到的，区别技术特征（3）是本领域的常规技术手段，因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、从属权利要求2-5的附加技术特征部分被对比文件1公开，部分被对比文件2公开，部分是本领域的公知常识，因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求2-5不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2019年01月20日向国家知识产权局提出了复审请求，复审请求人仅陈述了权利要求具有创造性的理由，没有修改申请文件。复审请求人认为：(1)、权利要求1公开的色谱柱为WelchNCOT－C18色谱柱，对比文件1的是SUPEL COSIL LC-18-T C18色谱柱。对比文件2也采用该色谱柱。色谱柱的类型直接影响被测物质色谱峰与杂质峰的分离效果，对比文件1-2均证实SUPEL COSIL LC-18-T C18色谱柱能够使5种核苷酸得到较好的分离，因此本领域技术人员会选择SUPEL COSIL LC-18-T C18色谱柱而不会显而易见的想到WelchNCOT－C18色谱柱。本领域技术人员也不会想到采用WelchNCOT－C18色谱柱是否完全能够使5种核苷酸分离，杂质峰是否会影响5种核苷酸的分离效果等。(2)、本申请公开的流动相的PH为3-3.5，对比文件1研究发现PH值对5种核苷酸的分离有很大影响，对比文件1给出的启示只有PH为5才能保证5种核苷酸完全分开，本领域技术人员也不会想到选择PH值远小于5时是否会影响5种核苷酸存在的形式，是否会出现两个峰之间重叠的情况。本申请流动相PH为3-3.5，5种核苷酸得到了较好的分离，保留时间随流动相PH值降低而保留时间缩短，PH至为3.3时，检测时间可以控制在30min之内。(3)、本申请的总体添加回收率为96-105%之间，重复性条件下精密度为0.95-3.33%，线性相关性良好，检出限、定量限低，具有较高的准确性、精密性及可靠性且方法灵敏度较高。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年02月02日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年10月22日向复审请求人发出复审通知书，指出：1、权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）称取的样品质量、加入的水的体积及温度，先转移至容量瓶再超声提取；（2）使用质量浓度为13％的高氯酸沉淀蛋白，滤纸过滤，取25 ml初滤液用氢氧化钠调节PH至6.75～6.85后定容至50 ml容量瓶；（3）色谱柱的品牌为Welch NCOT-C18，流动相的PH值＝3.0-3.5。区别技术特征（1）是本领域的常规技术手段，区别技术特征（2）是本领域在对比文件1的基础上结合对比文件2的和本领域的常规技术手段可以得到的，区别技术特征（3）是本领域的常规技术手段，因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、从属权利要求2、5的附加技术特征被对比文件1公开了，从属权利要求3-4的附加技术特征属于本领域常用技术手段，因此，从属权利要求2-5不具备专利法第22条第3款规定的创造性。3、合议组针对复审请求人陈述的权利要求具备创造性的理由进行了回应。
复审请求人于2019年11月26日提交了意见陈述书，没有修改申请文件。复审请求人陈述了权利要求具备创造性的理由。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）、审查文本的认定
复审请求人在提出复审请求和答复复审通知书时均未对申请文件进行修改，因此，本复审请求审查决定所针对的文本为：申请日2016年07月08日提交的说明书摘要、说明书第1-8页、说明书附图第1-6页；2018年05月02日提交的权利要求第1-5项。
（二）、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果一项权利要求与作为最接近的现有技术的对比文件相比存在区别特征，而另一份对比文件公开了一部分区别特征并存在与对比文件1相结合的技术启示，其余部分区别特征是本领域技术人员根据常规技术手段通过有限的试验就能确定的参数选择，则该项权利要求不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
1、权利要求1请求保护一种利用HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，对比文件1（“高效液相色谱法测定乳粉中的核苷酸”，张秋梅 等，《中国乳品工业》，第37卷第4期，第51-54页，2009年12月31日）公开了一种HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸的方法，并公开了其具体检测步骤包括：准确称取样品10.0g，加入20ml温水溶解后放入超声波浴中震荡5min，取出后转移至50ml容量瓶中；采用3种样品处理方式沉淀蛋白，乙酸沉淀，调PH值，0.33mol/L的高氯酸沉淀，定容后混匀用滤纸过滤后，再通过0.45μm滤膜过滤，直接上机测定（参见第2.2节）；在254nm检测波长下，使用SUPELCOSIL LC-18-T C18柱，以四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲溶液和甲醇作为流动相，进行色谱分析，四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲溶液和甲醇中甲醇的最佳体积百分数为5%，选用流动相的PH为4.5-6之间，优选PH值为5（参见第2.1、3.1节）。
权利要求1要求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于：（1）称取的样品质量、加入的水的体积及温度，先转移至容量瓶再超声提取；（2）使用质量浓度为13％的高氯酸沉淀蛋白，滤纸过滤，取25 ml初滤液用氢氧化钠调节PH至6.75～6.85后定容至50 ml容量瓶；（3）色谱柱的品牌为Welch NCOT-C18，流动相的PH值＝3.0-3.5。基于上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题为：（1）如何优化水解参数和过程；（2）如何改进蛋白沉淀方法；（3）如何选择色谱柱品牌和流动相PH值。
对于区别技术特征（1），对本领域技术人员来说，根据具体的实验条件和需求对样品质量、提取溶剂水的体积及温度等进行选择是常规选择，而使用先转移再超声的方法提取是常规技术手段。
对于区别技术特征（2），对比文件2（“高效液相色谱法测定乳制品中核苷酸的含量”，田燕等，《中国食品添加剂》，第4期，第138-143页，2014年12月31日）公开了一种HPLC法测定乳制品中核苷酸含量的方法（参见第1.3节），将样品使用水超声10min溶解后，加入13%高氯酸水溶液沉淀蛋白，定容过滤后，取滤液用氢氧化钠溶液调节-PH至6.5-7.0之间，定容后，滤膜过滤，其在对比文件2中所起的作用与其在权利要求1中所起的作用相同，均是用于乳制品中蛋白杂质的沉淀，也就是说对比文件2给出了将该技术特征用于对比文件1中以解决其技术问题的启示，而对溶液的体积和PH值进行选择、采用滤纸过滤均属于本领域技术人员在此基础上容易做出的常规选择。
对于区别技术特征（3），对比文件1第3.1.1节公开了使用AichromBond-AQ C18柱、SUPELCOSIL LC-18-T C18柱和氨基柱waters三种柱子，结果表明SUPELCOSIL LC-18-T C18柱填料的硅表面经过特殊的处理，与普通的C18柱相比，它可以减少硅烷醇和核苷酸之间的相互作用，提高分析灵敏度，即对比文件1给出了对于乳粉中核苷酸的液相色谱检测来说，需要通过实验选择特殊的C18柱的技术启示，在此基础上，对市售的常见C18柱进行选择以获得实验所需的分离效果，属于本领域技术人员在现有技术的基础上仅仅通过有限的常规试验就能够确定。对比文件1第3.1.3节公开了考虑到核苷酸的水溶液在酸性环境中比较稳定，所以选择调整流动相的PH值为酸性，选用4.5-6.0之间，研究发现PH值对色谱峰的分离有很大影响，可见，对比文件1给出了流动相的PH值应该为酸性的技术启示，且公开了流动相的PH值会对色谱峰的分离有很大影响，在此基础上，本领域技术人员有动机在C18柱的常规使用酸性范围对流动相的PH值进行优化选择，这属于本领域技术人员在对比文件1的基础上根据实验所需的分离度和分离时间通过有限的常规试验就能够确定。因此，将色谱柱选择为Welch NCOT-C18，流动性的PH值选择为3.0-3.5均是本领域技术人员容易得到的。
由此可知，在对比文件1的基础上结合对比文件2和公知常识得到权利要求1请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款的规定。
2、权利要求2是权利要求1的从属权利要求，其附加技术特征为“所述超声提取时间为10 min”，其已被对比文件2公开（参见第1.3节）。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、权利要求3是权利要求1的从属权利要求，其附加技术特征为“所述微孔滤膜的孔径为0.22 μm”，属于本领域的常规手段。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求3也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
4、权利要求4是权利要求1的从属权利要求，其附加技术特征为“所述流动相的PH＝3.3”，由对权利要求1的评价可知，流动相PH值是本领域技术人员在对比文件1的基础上根据实验所需的分离度和分离时间通过有限的常规试验就能够确定。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
5、权利要求5是权利要求1的从属权利要求，其附加技术特征为“所述四丁基硫酸氢铵-磷酸盐缓冲溶液中，四丁基硫酸氢铵的浓度为1.4mmol/L”，其已被对比文件1公开了（参见对比文件1第3.1.4节）。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求5也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）、针对复审请求人提出的陈述意见的答复：
复审请求人认为：(1)、权利要求1要求保护的色谱柱为WelchNCOT－C18色谱柱，对比文件1公开的是SUPEL COSIL LC-18-T C18色谱柱。对比文件2也采用该色谱柱。对比文件1-2均证实SUPEL COSIL LC-18-T C18色谱柱能够使5种核苷酸得到较好的分离，不同的C18柱对5种核苷酸的分离效果不同，并非所有的C18柱都能使5种核苷酸得到较好的分离，对比文件1-2公开的其他C18柱都不能达到分离5种核苷酸的效果，因此本领域技术人员会选择SUPEL COSIL LC-18-T C18色谱柱而不会显而易见的想到WelchNCOT－C18色谱柱。本领域技术人员也不会想到采用WelchNCOT－C18色谱柱是否完全能够使5种核苷酸分离，杂质峰是否会影响5种核苷酸的分离效果等。
(2)、本申请公开的流动相的PH为3-3.5，对比文件1研究发现PH值对5种核苷酸的分离有很大影响，对比文件1给出的启示只有PH为5才能保证5种核苷酸完全分开，本领域技术人员在对比文件1-2的基础上，显而易见的想到选择调整流动相的PH值的范围在4.5-6.0之间，常规技术手段是本领域技术人员在申请日前已经熟知选择流动相的PH值范围，而并不会超过现有技术的记载，本申请的PH值均未在对比文件1-2的范围内，不属于常规技术手段。本领域技术人员不会预料到当选择PH值小于对比文件1时，是否会影响5种核苷酸存在的形式，是否会出现两个峰之间重叠的情况。本申请流动相PH为3-3.5，5种核苷酸得到了较好的分离，保留时间随流动相PH值降低而保留时间缩短，PH至为3.3时，检测时间可以控制在30min之内。
(3)、本申请的总体添加回收率为96-105%之间，重复性条件下精密度为0.95-3.33%，线性相关性良好，检出限、定量限低，具有较高的准确性、精密性及可靠性且方法灵敏度较高。合议组经查认为：
合议组经查认为：
（1）、专利审查指南第二部分第四章第2.2节规定，如果发明是所属技术领域的技术人员在现有技术的基础上仅仅通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验可以得到的，则该发明是显而易见的。具体到本案，对比文件1-2证实SUPEL COSIL LC-18-T C18色谱柱能够使5种核苷酸得到较好的分离，对比文件1-2中其他C18柱都不能达到分离5种核苷酸的效果，即对比文件1-2给出的技术启示是“需要通过实验选择特殊的C18柱”，而并非只能采用SUPEL COSIL LC-18-T C18这一种品牌的色谱柱，在对比文件1的技术启示下，本领域技术人员有动机对市售的各种C18柱通过实验进行选择，包括本申请所采用的WelchNCOT－C18色谱柱，而最终选择哪个色谱柱是可以根据实际所需的分离效果确定，这种选择可通过有限的试验确定。因此，本领域技术人员在对比文件1给出的启示下通过有限的试验容易将色谱柱选择为WelchNCOT－C18色谱柱，其自然能够得到相应的好的分离效果。
（2）、复审请求人认为现有技术没有给出选择流动相的PH值范围，但是对比文件1第3.1.3节公开了考虑到核苷酸的水溶液在酸性环境中比较稳定，所以选择调整流动相的PH值为酸性，而C18柱通常使用的酸性PH值范围为1-7之内，因此根据现有技术的教导，流动相的PH值存在一个可选的范围，在该范围内本领域技术人员根据实验所需的分离度和保留时间对流动相的PH值通过有限的实验进行选择以获得最佳分离分析效果属于常规手段，这种选择所取得的技术效果可通过有限的试验确定。。
（3）、本申请的回收率和精密度是液相色谱分析的基本要求，对比文件1回收率为93.2%-103.7%，精密度为1.4%-1.8%（参见对比文件1摘要），本申请与对比文件1回收率和精密度接近，并不属于预料不到的技术效果，且对比文件1在精密度、线性范围、检出限、定量限等方面均取得了较好的检测结果(参见对比文件1第2.5-2.6节，表1-3)，本申请与对比文件1相比，没有取得意料不到的技术效果。
综上所述，对于复审请求人提出的上述关于本申请具备创造性的理由，合议组不予支持。
基于以上事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年11月21日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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