发明创造名称：一种猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒
外观设计名称：
决定号：200465
决定日：2020-01-11
委内编号：1F268822
优先权日：
申请（专利）号：201710821996.6
申请日：2017-09-13
复审请求人：河南农业大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：淡美俊
合议组组长：张礅
参审员：范伟
国际分类号：G01N33/558,G01N33/569
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求与最接近的现有技术相比存在区别特征，部分区别特征被其他对比文件公开且给出技术启示，其余部分区别特征属于本领域的公知常识，则该权利要求不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201710821996.6，名称为“一种猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒”的发明专利申请（下称本申请），本申请的申请日为2017年09月13日，公开日为2018年01月12日，申请人为“河南农业大学”。
经实质审查，国家知识产权局专利实质审查部门以本申请权利要求1-4不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由，于2018年09月18日驳回了本申请。驳回决定中引用了如下对比文件：
对比文件1：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay to Detect Lawsonia intracellularis in Rabbits with Proliferative Enteropathy. Masahisa WATARAI, et al，《J.Vet.Med.Sci.》，第66卷第6期 第735-737页，公开日为2004年06月30日；
对比文件2：surface antigen LsaA [Lawsonia intracellularis]，GenBank登录号：AAM46848.1， McCluskey J ，et al，《GenBank数据库》，公开日为2002年06月02日；
对比文件3：Lawsonia intracellularis surface antigen LsaA (lsaA) gene, complete cds，GenBank登录号：AF498259.1 ， McCluskey J ,et al，《GenBank数据库》，公开日为2002年06月02日；
对比文件4：CN103698514A，公开日为2014年04月02日。
驳回决定所针对的文本为：申请日2017年09月13日提交的说明书摘要、说明书第1-15页、说明书附图第1-2页、说明书核苷酸和氨基酸序列表；2018年08月25日提交的权利要求第1-4项。
驳回决定所针对的权利要求如下：
“1. 一种猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的抗原，所述抗原为LsaA重组蛋白，所述LsaA重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；LsaA重组蛋白融合有六聚组氨酸标签；
所述LsaA重组蛋白的制备方法为：合成opt-LsaA基因，将opt-LsaA基因克隆至pET-32a载体得到重组表达载体pET-32a-opt-LsaA；将重组表达载体pET-32a- opt-LsaA转化入宿主菌中，挑选出含有重组表达载体pET-32a-opt-LsaA的阳性克隆菌，对阳性克隆菌进行IPTG诱导表达；将表达产物通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化后，获得纯化的LsaA重组蛋白；其中，所述opt-LsaA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述重组表达载体pET-32a-opt-LsaA构建的具体过程为：合成opt-LsaA基因，并且在opt-LsaA基因序列的 5’端加上NdeI限制性核酸内切酶识别位点，在其 3’端加上 XhoI 限制性核酸内切酶识别位点；将opt-LsaA基因与pET-32a载体分别用NdeI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切，将酶切后的opt-LsaA基因与pET-32a载体连接，即得到重组表达载体pET-32a-opt-LsaA。
2.根据权利要求1所述的猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板，酶标板每孔包被LsaA重组蛋白0.2μg。
3.根据权利要求1所述的猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒还包括酶标抗体、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液。
4.根据权利要求3所述的猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。”
驳回决定的具体理由是：1、独立权利要求1请求保护一种猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒，其与对比文件1的区别技术特征在于：（1）LsaA重组蛋白抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述，且融合有六聚组氨酸标签；（2）前者请求保护一种试剂盒；（3）具体限定了LsaA重组蛋白和重组表达载体的制备方法。实际解决的技术问题提供另一种包被抗原用于胞内劳森菌的ELISA检测。区别技术特征（1）是本领域技术人员在对比文件1的基础上结合对比文件2和本领域的常用技术手段就能得到的，区别技术特征（2）是本领域的常规技术手段，区别技术特征（3）是本领域技术人员在对比文件1的基础上结合对比文件4、对比文件3和本领域的常用技术手段就能得到的。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、从属权利要求2-4的附加技术特征部分被对比文件1公开，其余部分是本领域的公知常识，因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求2-4不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年12月17日向国家知识产权局提出了复审请求，复审请求人仅陈述了权利要求第1-4项具有创造性的理由，没有修改申请文件。复审请求人认为：(1)、本申请利用pET32载体中位于硫氧还原蛋白标签前面的Nde I限制性内切酶位点和多克隆位点的最后一个Xho I位点，将LsaA基因直接克隆在核糖体结合位点下游，实现在目的蛋白C-末端引入了很小的多聚组氨酸纯化标签，N-端无任何蛋白标签，并非是本领域技术人员的常规技术手段。保证了LsaA蛋白的高效表达以及后续抗体检测的灵敏度、最大限度地避免了载体中存在的融合标签蛋白对LsaA蛋白包被的干扰，以及去除大分子标签的高昂费用和繁琐步骤。(2)、本申请使用全长LsaA蛋白，包含了该蛋白的全部抗原位点，比对比文件1的LsaA蛋白的氨基酸片段，检测结果更客观和更全面。(3)、胞内劳森菌的抗血清在1:800时的OD450nm值都大于临界值，判定为阳性。本申请检测试剂盒批内变异系数在0.352%～2.752%，均小于5%，批间变异系数在0.877%～3.000%，均小于5%。因此，权利要求具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年01月11日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年08月25日向复审请求人发出复审通知书，指出独立权利要求1请求保护一种猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒，其与对比文件1的区别技术特征在于：（1）抗原为LsaA重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述，且融合有六聚组氨酸标签；LsaA重组蛋白的制备方法为“合成opt-LsaA基因，将opt-LsaA基因克隆至pET-32a载体得到重组表达载体pET-32a-opt-LsaA；将重组表达载体pET-32a- opt-LsaA转化入宿主菌中，挑选出含有重组表达载体pET-32a-opt-LsaA的阳性克隆菌，对阳性克隆菌进行IPTG诱导表达；将表达产物通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化后，获得纯化的LsaA重组蛋白；其中，所述opt-LsaA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示”；重组表达载体pET-32a-opt-LsaA构建的具体过程为：“合成opt-LsaA基因，并且在opt-LsaA基因序列的 5’端加上NdeI限制性核酸内切酶识别位点，在其 3’端加上 XhoI 限制性核酸内切酶识别位点；将opt-LsaA基因与pET-32a载体分别用NdeI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切，将酶切后的opt-LsaA基因与pET-32a载体连接，即得到重组表达载体pET-32a-opt-LsaA”；（2）本申请请求保护一种试剂盒。区别技术特征（1）是本领域技术人员在对比文件1的基础上结合对比文件3和对比文件4以及本领域的常规技术手段就能得到的；区别技术特征（2）是本领域的常规技术手段，因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、从属权利要求2-4的附加技术特征部分被对比文件1公开，其余部分是本领域的公知常识，因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求2-4不具备专利法第22条第3款规定的创造性。3、合议组针对复审请求人陈述的权利要求具备创造性的理由进行了回应。
复审请求人于2019年09月24日提交了意见陈述书，同时提交了权利要求书的全文修改替换页。具体修改涉及：将权利要求2的附加技术特征“所述固相载体为酶标板，酶标板每孔包被LsaA重组蛋白0.2μg”补充到权利要求1中，形成新的权利要求1，同时删除权利要求2，相应的修改了其他权利要求的序号和引用关系。复审请求人陈述了权利要求具备创造性的理由。
本次提交的权利要求书如下：
“1. 一种猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒包括固相载体和包被在固相载体上的抗原，所述抗原为LsaA重组蛋白，所述LsaA重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；LsaA重组蛋白融合有六聚组氨酸标签；所述固相载体为酶标板，酶标板每孔包被LsaA重组蛋白0.2μg；
所述LsaA重组蛋白的制备方法为：合成opt-LsaA基因，将opt-LsaA基因克隆至pET-32a载体得到重组表达载体pET-32a-opt-LsaA；将重组表达载体pET-32a- opt-LsaA转化入宿主菌中，挑选出含有重组表达载体pET-32a-opt-LsaA的阳性克隆菌，对阳性克隆菌进行IPTG诱导表达；将表达产物通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化后，获得纯化的LsaA重组蛋白；其中，所述opt-LsaA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述重组表达载体pET-32a-opt-LsaA构建的具体过程为：合成opt-LsaA基因，并且在opt-LsaA基因序列的 5’端加上NdeI限制性核酸内切酶识别位点，在其 3’端加上 XhoI 限制性核酸内切酶识别位点；将opt-LsaA基因与pET-32a载体分别用NdeI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切，将酶切后的opt-LsaA基因与pET-32a载体连接，即得到重组表达载体pET-32a-opt-LsaA。
2.根据权利要求1所述的猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒还包括酶标抗体、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液。
3.根据权利要求2所述的猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）、审查文本的认定
复审请求人于2019年09月24日提交了权利要求书的全文修改替换页，经核实，复审请求人对权利要求书的修改符合专利法第33条的规定，本复审请求审查决定所依据的审查文本为：申请日2017年09月13日提交的说明书摘要、说明书第1-15页、说明书附图第1-2页、说明书核苷酸和氨基酸序列表；2019年09月24日提交的权利要求第1-3项。
（二）、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果一项权利要求与最接近的现有技术相比存在区别特征，部分区别特征被其他对比文件公开且给出技术启示，其余部分区别特征属于本领域的公知常识，则该权利要求不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
具体到本案：
1.权利要求1请求保护一种猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒。对比文件1公开了兔胞内劳森菌ELSIA检测方法，具体披露了以下技术内容（参见摘要，第735页左栏第1段、右栏第2段-第736页左栏第1段）：胞内劳森菌寄生在兔、猪、绵羊、仓鼠等动物的肠细胞中；使用合成的LsaA肽作为抗原，将其包被在96孔酶标板(固相载体)上，每孔包被0.5μg，所述合成的LsaA肽为LsaA蛋白的第41-56个氨基酸。
权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征为：（1）抗原为LsaA重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述，且融合有六聚组氨酸标签；每孔包被LsaA重组蛋白0.2μg；LsaA重组蛋白的制备方法为“合成opt-LsaA基因，将opt-LsaA基因克隆至pET-32a载体得到重组表达载体pET-32a-opt-LsaA；将重组表达载体pET-32a- opt-LsaA转化入宿主菌中，挑选出含有重组表达载体pET-32a-opt-LsaA的阳性克隆菌，对阳性克隆菌进行IPTG诱导表达；将表达产物通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化后，获得纯化的LsaA重组蛋白；其中，所述opt-LsaA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示”；重组表达载体pET-32a-opt-LsaA构建的具体过程为：“合成opt-LsaA基因，并且在opt-LsaA基因序列的 5’端加上NdeI限制性核酸内切酶识别位点，在其 3’端加上 XhoI 限制性核酸内切酶识别位点；将opt-LsaA基因与pET-32a载体分别用NdeI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切，将酶切后的opt-LsaA基因与pET-32a载体连接，即得到重组表达载体pET-32a-opt-LsaA”；（2）本申请请求保护一种试剂盒。基于上述区别技术特征可以确定，本申请相对于对比文件1实际解决的技术问题是：（1）如何优化LsaA蛋白以提高LsaA蛋白的表达量：（2）如何便于检测。
对于上述区别技术特征（1）中的LsaA重组蛋白，对比文件1已经公开了使用LsaA蛋白的氨基酸片段作为包被抗原用于血清中胞内劳森菌抗体的检测，即教导了胞内劳森菌表面抗原LsaA具有良好的反应原性用于免疫检测中，将LsaA重组蛋白代替对比文件1的LsaA蛋白作为包被抗原属于本领域技术人员容易想到的常规替换。对比文件1已经公开了将合成的LsaA肽包被在96孔酶标板上，每孔包被50μl（10μg/ml）（参见第735页右栏第2段-第736页左栏第1段），包被量可以根据需求灵活选择，属于本领域的常规调整。对于上述区别技术特征（1）中氨基酸序列和核苷酸序列，对比文件3公开了本申请的opt-LsaA基因的核苷酸序列SEQ ID NO.2（参见序列全文），根据该核苷酸序列，本领域技术人员可以根据密码子编码原则获得其编码的蛋白，即本申请的蛋白序列SEQ ID NO.1，这属于本领域中的惯用技术手段。对于上述区别技术特征（1）中的LsaA重组蛋白和重组表达载体的制备方法，对比文件4公开了检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，同时公开了1024b蛋白的制备方法：经BamH I和HindⅢ双酶切以及测序鉴定正确后再将1024b 基因亚克隆到原核表达载体pET-32a( )中，经BamH I和HindⅢ双酶切以及测序鉴定正确得到原核表达质粒pET32a-1024b（图3），IPTG诱导表达将原核表达质粒pET32a-1024b转入到宿主表达菌BL21(DE3)中，将阳性菌株接种于LB培养基中，加入 IPTG诱导表达，因重组蛋白1024b融合有多聚组氨酸（6×His）标签，故采用Ni2 亲和层析的方法纯化重组蛋白1024b。经鉴定重组蛋白1024b以包涵体的形式得到表达，故取包涵体溶解液过Ni-NTA，通过改变缓冲液的pH值来洗去杂蛋白，纯化目的蛋白。纯化后得到大小为 57kDa，条带单一的目的蛋白，对纯化后的重组蛋白1024b复性后进行Western-blot分析其抗原性，结果表明纯化复性后的重组蛋白1024b具有良好的抗原性（图6，序列表 SEQ.ID.No.1）（参见说明书第0018-0043段），可见，对比文件4已经公开了重组蛋白1024b的制备及纯化方法，且该重组蛋白融合有六聚组氨酸标签，且其在对比文件4中所起的作用与其在本申请中所起的作用相同，均是用于重组蛋白表达载体的构建和重组蛋白的制备，融合有六聚组氨酸标签均是便于重组蛋白的纯化，也就是说对比文件4给出了与对比文件1结合的技术启示。重组蛋白载体的构建方法中的细节例如合成目的基因、在其上添加限制性内切酶位点等属于本领域的常规方法，5’端Nde I和3’端Xho I都是本领域常用的限制性内切酶，本领域技术人员完全可以依据载体图谱，根据实际需要进行选择并获得相应LsaA的制备方法。亲和层析柱选用NI-NTA琼脂糖亲和层析柱也是本领域的惯用技术手段。
对于上述区别特征（2），为便于检测，将检测过程中使用到的试剂、耗材等打包成试剂盒属于本领域的惯用技术手段。
因此，在对比文件1的基础上，结合对比文件3、4和本领域的公知常识，得到权利要求1请求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的；权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备创造性,不符合专利法第22条第3款的规定。
2．权利要求2是权利要求1的从属权利要求，权利要求3是权利要求2的从属权利要求，对比文件1已经公开了检测过程中使用到辣根过氧化物酶标记的蛋白G、阴性对照血清、底物显色液，还包括洗涤、样品稀释的步骤（本领域技术人员可以确定其中使用了洗涤液和样品稀释液，参见第735页右栏第2段-第736页左栏第1段），而ELISA检测中使用酶标抗体、阳性对照血清、终止液均属于常规试剂组分，具体选择HRP标记的兔抗猪IgG二抗属于本领域的常规之选。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求2-3不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）、针对复审请求人提出的意见陈述的答复：
复审请求人认为：(1)、国内外至今未见成功表达全长LsaA蛋白的现实，可以看出全长LsaA重组蛋白的真正表达对于本领域内的专业人员来说也不是轻而易举和显而易见的。申请人需要说明的是，本申请采用全长的LsaA蛋白作为抗原，达到了检测灵敏度高且全面的效果，且特异性反应良好，由此可知，本申请并未出现本领域技术人员所预料的非特异性反应。这并不是通过对比文件就可以容易想到的。
(2)、对比文件1每孔包被50μl（10μg/ml），即包被量为每孔0.5μg。本申请修改后权利要求1限定了所述固相载体为酶标板，酶标板每孔包被LsaA重组蛋白0.2μg，包被量是对比文件的40%，即可作为本申请猪胞内劳森菌ELISA检测试剂盒的最佳包被量，达到该试剂盒的反应需求。这是从对比文件1中无法预料到的。虽然包被量是可以用常规手段确定，但是本领域技术人员在获得本申请方案之前，并不能预料到本申请使用0.2μg的包被量即可达到反应需求，该包被量减少了原料成本。
合议组经查认为：
（1）、对比文件1已经公开了使用LsaA蛋白的氨基酸片段作为包被抗原用于血清中胞内劳森菌抗体的检测，即教导了胞内劳森菌表面抗原LsaA具有良好的反应原性用于免疫检测中，将LsaA重组蛋白代替对比文件1的LsaA蛋白作为包被抗原属于本领域技术人员容易想到的常规替换。多肽片段、全长重组抗原均是本领域很常用的检测抗原。而对于全长重组抗原的表达方法，本申请LsaA重组蛋白的表达方法基本上已被对比文件4公开，因此成功表达全长LsaA蛋白的方法相对于现有技术不具备创造性。复审请求人认为全长重组抗原含工程菌成分杂质等可能带来非特异反应，因此本申请采用全长的LsaA蛋白作为抗原特异性好取得了预料不到的技术效果，事实上，生物领域中使用的抗原一般也都是经过纯化的蛋白，这是本领域的常识，这种纯化的蛋白去除了杂质，因此其特异性更好也是本领域技术人员容易预期的技术效果，复审请求人提到的“采用全长的LsaA蛋白作为抗原，达到了检测灵敏度高且全面的效果，且特异性反应良好” 是本领域技术人员容易想到的效果。
（2）、生物领域普通技术人员都知晓，包被量会对P/N值产生影响，需要通过实验确定最优化条件，因此为了减少了原料成本，本领域普通技术人员通过有限的试验容易将包被量选择为每孔0.2μg，在试验中自然能够验证该包被量能够达到反应需求。
因此，复审请求人的上述关于本申请具备创造性的理由合议组不予支持。
基于以上事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年09月18日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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