发明创造名称：用于苯乙烯合成的酶和方法
外观设计名称：
决定号：199675
决定日：2020-01-08
委内编号：1F249634
优先权日：2012-06-22
申请（专利）号：201380033044.8
申请日：2013-06-21
复审请求人：菲特吉恩公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：林峻凯
合议组组长：徐益君
参审员：于婷
国际分类号：C12N9/88,C12N9/00,C12N1/26,C12P7/40,C12P7/22,C12P5/00
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在发明请求保护的技术方案与最接近的现有技术存在区别技术特征的情况下，如果现有技术整体上没有给出将该区别技术特征应用于该最接近的现有技术以解决发明实际解决的技术问题的启示，也没有证据显示该区别技术特征属于公知常识时，不能认定该发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380033044.8，名称为“用于苯乙烯合成的酶和方法”的发明专利申请。申请人为菲特吉恩公司。本申请的申请日为2013年06月21日，优先权日为2012年06月22日，公开日为2015年04月01日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年01月05日发出驳回决定，以权利要求1-15不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为：2014年12月22日本申请进入中国国家阶段时提交的原始国际申请文件的中文译文的说明书第1-419段（即第1-47页）、说明书附图图1A-图21B（即第1-20页）、说明书摘要、摘要附图、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-59页；以及2017年01月17日提交的权利要求第1-15项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种包含一种重组表达的融合蛋白的宿主细胞，所述融合蛋白包括包含苯丙氨酸解氨酶的第一域和包含肉桂酸脱羧酶的第二域。
2. 一种生产苯乙烯的方法，所述方法包括：
使权利要求1的宿主细胞与可发酵碳底物接触；以及
(b)在培养基中培养所述宿主细胞足够时间以产生苯乙烯。
3. 一种宿主细胞，其包含：(a)一种重组表达的融合蛋白，所述融合蛋白具有包含苯丙氨酸解氨酶的第一域和包含肉桂酸脱羧酶的第二域；以及(b)一种重组表达的膜结合转运体。
4. 根据权利要求3所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶具有对应于SEQ ID No.8的序列。
5. 根据权利要求4所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶进一步包含一个功能性片段或其变体。
6. 根据权利要求3所述的宿主细胞，其中，所述膜转运体为一种细菌ABC转运体。
7. 一种生产苯乙烯的方法，所述方法包括：
使根据权利要求3所述的宿主细胞与可发酵碳底物接触；以及
(b)在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。
8. 根据权利要求4所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶进一步包含与SEQ ID NO:8有至少85％一致性的氨基酸序列。
9. 一种生产苯乙烯的方法，所述方法包括：
(a)使宿主细胞与一种可发酵碳底物接触，所述宿主细胞包含重组表达的融合蛋白，所述融合蛋白具有包含苯丙氨酸解氨酶的第一域和包含肉桂酸脱羧酶的第二域；以及
(b)在培养基中培养所述宿主细胞足够时间以产生苯乙烯，其中，通过吸收材料吸收所述苯乙烯产物的蒸汽。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中，所述吸收材料选自下组：聚合物树脂、活性炭、纤维素材料、以及它们的组合。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述聚合物树脂是一种疏水树脂。
12. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述聚合物树脂选自下组：C18、C8、苯基、SDB-L吸附剂树脂、以及它们的组合。
13. 根据权利要求1所述的宿主细胞，其中，所述融合蛋白进一步包括共价连接所述第一域和所述第二域的连接体。
14. 根据权利要求13所述的宿主细胞，其中，所述连接体是一种包含2-15个氨基酸的肽连接体。
15. 根据权利要求1所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶具有与SEQ ID NO:16所示的序列有至少85％一致性的氨基酸序列。 ”
驳回决定认为：对比文件1（“Styrene biosynthesis from glucose by engineered E. coli”，Rebekah Mckenna等，Metabolic Engineering，第13卷，第5期，第544-554页，公开日为2011年09月30日）公开了具体的苯丙氨酸解氨酶，包括来源于拟南芥的PAL1；公开了编码具体的反式肉桂酸脱羧酶的基因如来源于植物乳杆菌的基因pdc。且公开了可通过在过量产生L-苯丙氨酸的大肠杆菌宿主细胞中共表达苯丙氨酸解氨酶和反式肉桂酸脱羧酶可以从葡萄糖合成苯乙烯，其图1公开了将前体L-苯丙氨酸通过中间产物反式肉桂酸转化为产物苯乙烯，所述起始于L-苯丙氨酸的双步骤途径通过共表达一个或多个编码苯丙氨酸解氨酶的基因和一个或多个编码反式肉桂酸脱羧酶的基因而实现（参见第545页左栏第2段至右栏第2段，图1，表1）。权利要求1与对比文件1的区别在于：对比文件1没有明确公开包含重组表达包含苯丙氨酸解氨酶的第一域和包含肉桂酸脱羧酶的第二域组成的融合蛋白的宿主细胞，基于所述区别可知本申请实际解决的技术问题在于提高酶催化效率。对于所述区别，对比文件5（“融合酶的设计和应用研究进展”，黄子亮等，生物工程学报，第28卷，第4期，第393-409页，公开日为2012年04月25日）公开了通过构建融合酶，拉近合成途径中的两个 (或多个) 酶的空间距离，减少中间产物的流失，可以有效提高产物的产量、产率和底物转化率（参见图 1B，第395页左栏第1段至右栏第1段，第3.3节），因此根据对比文件5所公开的内容给出的启示，为了提高产物的产量、产率和底物转化率，本领域技术人员有动机重组表达包含苯丙氨酸解氨酶（第一域）和肉桂酸脱羧酶（第二域）的融合蛋白，获得权利要求1所述宿主细胞，且可预见到重组表达融合蛋白会导致产物苯乙烯产量的提高。因此，权利要求1请求保护的技术方案对本领域技术人员而言是显而易见的，因而不具备创造性。由于权利要求1请求保护的宿主细胞不具备创造性，基于对比文件1第2.10节所公开的发酵培养大肠杆菌宿主细胞由葡萄糖底物生产苯乙烯的方法（参见第548页左栏第3段），从而权利要求2请求保护的技术方案对本领域技术人员而言也是显而易见的，也不具备创造性。对于权利要求3，基于对比文件1公开的苯乙烯生产过程中的生理限制包括产物毒性（参见第548页右栏倒数第1段），本领域技术人员根据本领域的常规基础知识有动机在权利要求1所请求保护的宿主细胞中额外表达一种重组表达膜结合转运体，从而权利要求3请求保护的技术方案对本领域技术人员而言也是显而易见的，也不具备创造性。权利要求4、5、8直接或间接地引用权利要求3，其附加技术特征已为对比文件6（“Fdc1p [Saccharomyces cerevisiae S288c]”，Jacq,C.等，GenBank Accession NP_010828，公开日为2011年04月26日）所公开（参见全文，尤其是CDS、ORIGIN部分）或基于该公开内容通过本领域常规技术手段而容易获得，因此权利要求4、5、8也不具备创造性。权利要求6引用权利要求3，其附加技术特征属于本领域的常规技术手段，因此权利要求6也不具备创造性。由于权利要求3请求保护的宿主细胞不具备创造性，基于上述对比文件1第2.10节所公开内容（参见第548页左栏第3段），从而权利要求7请求保护的技术方案对本领域技术人员而言也是显而易见的，也不具备创造性。在权利要求2请求保护的技术方案不具备创造性的基础上，为了收集宿主细胞所生产的苯乙烯，也为了降低苯乙烯积累所导致的细胞毒性，本领域技术人员容易想到依据苯乙烯的性质采用本领域的常规技术手段制备蒸汽，选择适宜的吸收材料进行苯乙烯蒸汽收集，因此权利要求9也不具备创造性。权利要求10-12直接或间接地引用权利要求9，其所进一步限定的吸收材料均是本领域技术人员依据苯乙烯的理化性质所容易选用的本领域常规吸附材料，因此权利要求10-12也不具备创造性。对比文件5公开了在两个酶之间引入连接肽是一种有效的手段，最为典型的柔性连接肽是(GGGGS)n (一般 n≤6)（参见第2.2节），根据对比文件5公开内容所给出的启示，本领域技术人员容易想到选择(GGGGS)n ( n≤3)作为连接肽，从而权利要求13-14也不具备创造性。由于对比文件6所公开的肉桂酸脱羧酶Fdc1p的氨基酸序列与权利要求15所述SEQ ID NO:16所示的序列具有99%一致性，因此权利要求15也不具备创造性。
申请人菲特吉恩公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年04月20日向国家知识产权局提出了复审请求，没有对申请文件进行修改。复审请求人认为：基于对比文件1，本发明要解决的技术问题是提供另外一种产生苯乙烯的系统。对比文件5尽管公开了融合蛋白所具有的诸多优势，提供了诸多成功的例子，但是，对比文件5中还指出融合蛋白构建过程中所面临的问题，例如第396页第2.1节教导了：通过直接连接两种酶通常导致不具有酶活性或不能表达的融合酶；第397页的第2.2.1节教导了使用柔性接头（例如（GGGGS）n）连接两种酶会易于被蛋白酶消化，导致在某些系统中表达失败；第2.2.2节的描述内容指出融合酶的设计仍属于个案研究；第2.3节第399页描述了插入融合制备融合酶所面临的插入位点选择的挑战；第2.4节描述了蛋白水平融合所具有的缺点；第401页左栏指出了木聚糖酶（xyn）和纤维素酶（Cel）融合顺序不同而导致的活性变化；第401页右栏第一段指出了融合过程中会出现蛋白不能表达，蛋白不能正确折叠，蛋白不稳定以及酶原来的活性受到损失甚至丧失等问题。因此，基于对比文件5的教导，融合蛋白制备没有适用于所有蛋白质的一般规则。即使技术人员可能有动机来制备包含苯丙氨酸解氨酶和反式肉桂酸脱羧酶的融合酶，他也无法预见融合酶可保持单个酶的活性。此外，本发明的融合蛋白因利用了“底物通道”现象从而具有降低细胞内生产毒性，同时显著增加酶反应速率的不可预见的技术效果。综上认为本发明具有创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年05月07日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，基于对比文件5公开的融合酶构建带来一系列好处的内容所给出的启示，本领域技术人员有动机重组表达包含对比文件1公开的苯丙氨酸解氨酶（第一域）和肉桂酸脱羧酶（第二域）的融合蛋白，从而容易地获得权利要求1所述宿主细胞，且权利要求1的保护范围涵盖了本领域所有类型的苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸脱羧酶以任意方式融合所得到的融合蛋白，实质上只是提供了一种构建表达融合蛋白的思路，不能认为取得了预料不到的技术效果。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年04月01日向复审请求人发出复审通知书，指出：对比文件1是最接近的现有技术，其公开了：通过从头设计开发了一种新的代谢途径，可从葡萄糖合成苯乙烯，通过共表达苯丙氨酸解氨酶和反式肉桂酸脱羧酶，将内源性合成的L-苯丙氨酸转化为苯乙烯。最终，在L-苯丙氨酸过量产生的大肠杆菌宿主中过表达来自拟南芥的PAL2（苯丙氨酸解氨酶）和来自酿酒酵母FDC1(阿魏酸脱羧酶，即肉桂酸脱羧酶)，导致在摇瓶培养基中积聚高达260 mg/L的苯乙烯。如图1所示，该苯乙烯生物合成途径利用内源合成的L-苯丙氨酸作为中间前体，通过两步酶催化步骤转化为苯乙烯，即第一步通过PAL催化将L-苯丙氨酸脱氨基转化为反式肉桂酸（tCA），第二步是通过具有反式肉桂酸脱羧酶活性的PADC（包括FDC1）将tCA脱羧转化为苯乙烯(参见摘要、第545页左栏第2段至右栏第2段、第545页图1、第547页左栏第2段、第550页右栏第1段)。权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1中苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸脱羧酶在宿主细胞中是以融合蛋白形式存在，而对比文件1中两者是分别表达而独立存在。基于该区别特征，权利要求1实际解决的技术问题为如何进一步提高酶催化效率。根据上述对比文件1公开的内容，本领域技术人员可以知晓在大肠杆菌宿主中由碳源经前体L-苯丙氨酸催化制备苯乙烯需要两个相邻的步骤，这两个步骤分别涉及苯丙氨酸解氨酶如PAL2和肉桂酸脱羧酶如FDC1。进一步根据对比文件5上述公开内容（参见第395页左栏第1段至右栏第1段，图1B，第3.3节）所给出的启示，为了提高产物的产量、产率和底物转化率，本领域技术人员有动机在大肠杆菌宿主中重组表达包含苯丙氨酸解氨酶如PAL2（第一域）和肉桂酸脱羧酶如FDC1（第二域）的融合酶（PAL2-FDC1），从而能容易地获得权利要求1所要求保护的宿主细胞，且较分别表达导致苯乙烯产量提高的技术效果也是可以合理预见的，因此，权利要求1不具备创造性。对于权利要求2，与对比文件1公开内容（参见摘要、第545页左栏第2段至右栏第2段、第545页图1、第547页左栏第2段、第548页第2.10节以及第550页右栏第1段）相比，区别特征仅在于：权利要求2中苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸脱羧酶在宿主细胞中是以融合蛋白形式存在，而对比文件1中两者是分别表达而独立存在。基于该区别特征，权利要求2实际解决的技术问题为如何进一步提高酶催化效率。基于与权利要求1创造性评述相同的理由，权利要求2也不具备创造性。权利要求3与对比文件1的区别在于对比文件1未公开宿主细胞中包含重组表达的膜结合转运体，基于该区别特征，权利要求3所进一步实际解决的技术问题为如何降低产物积累导致的宿主细胞毒性。基于对比文件1所进一步公开的讨论苯乙烯生产过程中产物苯乙烯固有毒性及如何克服苯乙烯毒性或溶剂耐受的相关内容（参见第3.1节，第552页右栏第2段至第553页左栏第2段），本领域技术人员有动机寻找本领域中用于通过外排产物从而克服产有机产物宿主细胞中产物毒性的常规技术手段，包括在宿主细胞中重组表达能够转运产物至细胞外的膜结合转运体如细菌ABC转运体，以降低产物积累导致的细胞毒性（参见“《Pseudomonas, Volume 2: Virulence and Gene Regulation》”，Juan-Luis Ramos主编，Springer Science Business Media New York，2004年第1版，第479-508页），因此，权利要求3不具备创造性。同理，权利要求6也不具备创造性。权利要求4、5、8直接或间接地引用了权利要求3，其附加技术特征已为对比文件6所公开（参见全文，尤其是CDS、ORIGIN部分）或基于该公开内容通过本领域常规技术手段而容易获得，因此权利要求4、5、8也不具备创造性。于与评述权利要求2相似的理由，并考虑到权利要求3要求保护的宿主细胞不具备创造性，权利要求7也不具备创造性。在权利要求2请求保护的技术方案不具备创造性的基础上，并基于对比文件1所讨论的如何克服苯乙烯毒性或溶剂耐受的一些策略，包括吸附（参见第552页右栏第2段至第553页左栏第2段），本领域技术人员有动机选择适宜的吸收材料进行苯乙烯蒸汽收集，因此权利要求9也不具备创造性。权利要求10-12直接或间接地引用权利要求9，其所进一步限定的吸收材料均是本领域技术人员依据苯乙烯的理化性质所容易选用的本领域常规吸附材料，因此权利要求10-12也不具备创造性。根据对比文件5所公开的在两个酶之间引入连接肽是一种有效的手段，最为典型的柔性连接肽是(GGGGS)n (一般 n≤6)的内容（参见第2.2节）所给出的启示，本领域技术人员容易想到选择(GGGGS)n ( n≤3) 以及本领域公知的甘氨酸和丝氨酸组成的柔性连接肽如本申请表1中所列的各种GS、GSG连接肽等等作为连接肽，从而权利要求13-14也不具备创造性。由于对比文件6所公开的肉桂酸脱羧酶Fdc1p的氨基酸序列与权利要求15所述SEQ ID NO:16所示的序列具有99%一致性，因此权利要求15也不具备创造性。针对复审请求人提出复审请求时的意见陈述，合议组认为：相对于对比文件1，本发明实际解决的技术问题是基于融合酶这一区别特征所能达到的技术效果而确定的，即“如何进一步提高酶催化效率”。尽管，对比文件5存在如复审请求人所述的融合酶的一些不利之处，但这些不利之处并不影响或阻碍本领域技术人员构建包含苯丙氨酸解氨酶和反式肉桂酸脱羧酶的融合酶的动机，至于柔性接头尽管有失败可能，但不影响本领域技术人员去尝试使用，此外对比文件5的个案结论（包括融合顺序）也无法以偏概全地否定对比文件5所给出的融合酶有利的一般教导。此外，融合酶利用“底物通道”现象而获得的技术效果实际上也已在对比文件5中有相应描述（参见第395页左栏第1段至右栏第1段），这样的技术效果是本领域技术人员可以合理预期的，并非不可预见的技术效果。
复审请求人于2019年07月16日提交了意见陈述书，同时提交了权利要求书全文替换页（共1页12项），相对于驳回决定针对的文本，所作修改在于：依据本申请进入中国国家阶段时提交的原始国际申请文件的中文译文的权利要求13-18、说明书第21页第23-36行、说明书第41-43页实施例II以及说明书附图图14记载的内容，将原权利要求1请求保护的主题修改为“一种包含重组表达的肉桂酸脱羧酶的宿主细胞”，并进一步限定了其中重组表达的肉桂酸脱羧酶的具体突变位点及突变的氨基酸残基的具体选择；将原独立权利要求3修改为引用权利要求1的从属权利要求；将原权利要求6的编号修改为权利要求4；删除了原权利要求4-5和8-9；依据本申请进入中国国家阶段时提交的原始国际申请文件的中文译文的说明书第35页第10-14、20-22行和第36页第1-6行，增加了权利要求5，进一步限定权利要求2方法中“还包括通过吸收材料吸收所述苯乙烯产物的蒸汽”；将原权利要求7的编号修改为权利要求6；将原权利要求10-12的编号分别修改为权利要求7-9，将原权利要求10的引用关系由引用原权利要求9修改为引用权利要求5，将原权利要求11-12的引用关系由引用原权利要求10修改为引用权利要求7；将原权利要求13-14的编号分别修改为权利要求10-11，将原权利要求13的引用关系由引用原权利要求1修改为引用权利要求3，将原权利要求14的引用关系由引用原权利要求13修改为引用权利要求10；以及依据本申请进入中国国家阶段时提交的原始国际申请文件的中文译文的第21页倒数第2行至第22页第2行，将原权利要求15中的肉桂酸脱羧酶序列修改为具体的氨基酸序列，并同时将原权利要求15的编号修改为权利要求12。复审请求人认为：根据说明书实施例2，本发明鉴定了一些潜在的单突变体（例如K190E、K190C、K190D、K190V、K190N、K190L、K190H和R175I），相比于野生型，它们生产出明显更高量的苯乙烯（图14）。相比于野生型，突变体K190E、K190C、K190V生产了3倍以上的苯乙烯，突变体R175I生产了1.5倍以上的苯乙烯。这样，相比于野生型，FDC1突变体生产了明显更高量的苯乙烯。在不同位点的诱变显示出对甲基转移酶的蛋白质进化的累加或协同效应（Bhuiya等，2010, Journal of Biological Chemistry, 285: 277-285）。在FDC1的K190和R175位点的诱变可以进一步提高苯乙烯的生产。根据图14，本发明人已经表明，这些特定的突变导致产生显著更高量的苯乙烯，这是对比文件1和对比文件5 /对比文件6的组合教导无法预测的。仅仅根据上述出人意料的技术效果，本权利要求具备创造性。
修改后的权利要求书如下：
“1. 一种包含重组表达的肉桂酸脱羧酶的宿主细胞，其中重组表达的肉桂酸脱羧酶是包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的FDC酶的突变体，所述突变体包含对应于SEQ ID NO：8第175、190和193位的氨基酸残基突变，以及它们的组合，其中对应于SEQ ID NO：8的第175位的氨基酸残基位置的突变是异亮氨酸，对应于第193位的氨基酸残基位置的突变是脯氨酸，对应于第190位的氨基酸残基位置的突变选自：谷氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，天冬酰胺，亮氨酸，组氨酸，脯氨酸和丝氨酸。
2.一种生产苯乙烯的方法，所述方法包括：
（a）使权利要求1的宿主细胞与可发酵碳底物接触；以及
（b）在培养基中培养所述宿主细胞足够时间以产生苯乙烯。
3.权利要求1的宿主细胞，其中重组表达的肉桂酸脱羧酶是重组表达的融合蛋白的部分，所述重组表达的融合蛋白包含含有苯丙氨酸解氨酶的第一域和含有所述肉桂酸脱羧酶的第二域，所述宿主细胞进一步包含膜结合转运蛋白。
4.权利要求3的宿主细胞，其中膜结合转运体为一种细菌ABC转运体。
5.根据权利要求2所述的方法，还包括通过吸收材料吸收所述苯乙烯产物的蒸汽。
6.一种生产苯乙烯的方法，所述方法包括：
（a）使根据权利要求3所述的宿主细胞与可发酵碳底物接触；以及
（b）在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述吸收材料选自下组：聚合物树脂、活性炭、纤维素材料、以及它们的组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述聚合物树脂是一种疏水树脂。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述聚合物树脂选自下组：C18、C8、苯基、SDB-L吸附剂树脂、以及它们的组合。
10.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中，所述融合蛋白进一步包括共价连接所述第一域和所述第二域的连接体。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中，所述连接体是一种包含2-15个氨基酸的肽连接体。
12.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶具有SEQ ID NO:16，SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 38所示的序列。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审程序中，复审请求人于2019年07月16日提交了权利要求书全文替换页（共1页12项）。经审查，所作修改符合专利法第33条及专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审请求审查决定所依据的审查文本为：2014年12月22日本申请进入中国国家阶段时提交的原始国际申请文件的中文译文的说明书第1-47页（即第1-419段）、说明书附图第1-20页（即图1A-图21B）、说明书摘要、摘要附图、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-59页；以及2019年07月16日提交的权利要求第1-12项。
专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，在发明请求保护的技术方案与最接近的现有技术存在区别技术特征的情况下，如果现有技术整体上没有给出将该区别技术特征应用于该最接近的现有技术以解决发明实际解决的技术问题的启示，也没有证据显示该区别技术特征属于公知常识时，不能认定该发明不具备创造性。
本案中，修改后的权利要求1要求保护一种包含重组表达的肉桂酸脱羧酶的宿主细胞，其中重组表达的肉桂酸脱羧酶是包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的FDC酶的突变体，所述突变体包含对应于SEQ ID NO：8第175、190和193位的氨基酸残基突变，以及它们的组合，其中对应于SEQ ID NO：8的第175位的氨基酸残基位置的突变是异亮氨酸，对应于第193位的氨基酸残基位置的突变是脯氨酸，对应于第190位的氨基酸残基位置的突变选自：谷氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，天冬酰胺，亮氨酸，组氨酸，脯氨酸和丝氨酸。对比文件1公开了：通过从头设计开发了一种新的代谢途径，可从葡萄糖合成苯乙烯，通过共表达苯丙氨酸解氨酶和反式肉桂酸脱羧酶，将内源性合成的L-苯丙氨酸转化为苯乙烯。最终，在L-苯丙氨酸过量产生的大肠杆菌宿主中过表达来自拟南芥的PAL2（苯丙氨酸解氨酶）和来自酿酒酵母W303菌株的FDC1(阿魏酸脱羧酶，即肉桂酸脱羧酶)，导致在摇瓶培养基中积聚高达260 mg/L的苯乙烯。如图1所示，该苯乙烯生物合成途径利用内源合成的L-苯丙氨酸作为中间前体，通过两步酶催化步骤转化为苯乙烯，即第一步通过PAL催化将L-苯丙氨酸脱氨基转化为反式肉桂酸（tCA），第二步是通过具有反式肉桂酸脱羧酶活性的PADC（包括FDC1）将tCA脱羧转化为苯乙烯(参见摘要、第545页左栏第2段至右栏第2段、第545页图1、第546页表1、第547页左栏第2段、第550页右栏第1段)。由此可见，权利要求1的技术方案与上述对比文件1公开的内容相比，区别特征仅在于：对比文件1中没有公开权利要求1中所具体限定的包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的FDC酶中对应于SEQ ID NO：8第175、190和193位氨基酸残基分别单突变及组合突变的突变体。基于该区别特征，权利要求1实际解决的技术问题为如何进一步提高肉桂酸脱羧酶催化生成苯乙烯的效率。
然而，对比文件1仅提及使用来自酿酒酵母W303菌株的FDC1(阿魏酸脱羧酶，即肉桂酸脱羧酶)（参见第546页表1和第547页左栏第2.5节），对比文件6尽管公开了与本申请SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列完全一致的肉桂酸脱羧酶Fdc1p的氨基酸序列（参见全文，尤其是CDS、ORIGIN部分）；但是，无论是对比文件1还是对比文件6均没有公开含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的肉桂酸脱羧酶(FDC酶)中对应于SEQ ID NO：8第175、190和193位的氨基酸残基被单突变（其中对应于SEQ ID NO：8的第175位的氨基酸残基位置的突变是异亮氨酸，对应于第193位的氨基酸残基位置的突变是脯氨酸，对应于第190位的氨基酸残基位置的突变选自：谷氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，天冬酰胺，亮氨酸，组氨酸，脯氨酸和丝氨酸）及所述单突变的组合的相关内容，并且在对比文件1和对比文件6中也没有讨论、教导和暗示对含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的肉桂酸脱羧酶(FDC酶)中对应于SEQ ID NO：8第175、190和193位的氨基酸残基进行单突变或组合突变能够改善该FDC亲本酶催化生成苯乙烯的效率的任何相关内容。至于对比文件5，则根本不涉及上述含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的肉桂酸脱羧酶(FDC酶)。进一步地，基于目前的证据，也无法认为对含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的肉桂酸脱羧酶(FDC酶)中对应于SEQ ID NO：8第175、190和193位的氨基酸残基进行单位点或组合突变能够改善该FDC亲本酶催化生成苯乙烯的效率属于本领域的公知常识。换言之，无论是对比文件1、5和6，还是本领域的公知常识，均没有给出对含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的肉桂酸脱羧酶(FDC酶)中对应于SEQ ID NO：8第175、190和193位的氨基酸残基进行单突变或组合突变能够改善该FDC亲本酶催化生成苯乙烯的效率的技术启示。因此，基于驳回决定、前置审查意见和复审通知书中对比文件1和对比文件5/6以及本领域的公知常识的证据组合，不能认定修改后的权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。基于同样的理由，也不能认定修改后的权利要求2-12不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
此外，驳回决定和复审通知书中还指出：经比对，对比文件6公开的氨基酸序列与权利要求4中SEQ ID NO.8所示的序列完全一致。在本领域，已知蛋白的氨基酸序列和蛋白的功能，获得该蛋白的功能性片段或其不丧失活性的变体包括氨基酸序列与已知蛋白的氨基酸序列具有至少85%一致性的蛋白变体的方法属于本领域的常规技术手段，因此，基于对比文件6所公开的肉桂酸脱羧酶Fdc1p自身所具备的肉桂酸脱羧酶的性质，本领域技术人员容易想到将其或其功能性片段、具有一定序列一致性的变体选作肉桂酸脱羧酶用于构建融合蛋白。
对此，合议组认为：尽管对比文件6已公开了本申请用于突变的FDC亲本酶（氨基酸序列为SEQ ID NO:8），但是，考虑到该FDC亲本酶具有503个氨基酸残基，理论上503个位点都可以分别单突变，或进行多个位点的组合突变，这样突变数量近乎天文数字。因此在对比文件1、5和6以及本领域的公知常识中均没有公开过该FDC亲本酶的晶体结构，也没有提供该FDC亲本酶决定其苯乙烯催化活性的相关结构域组成的具体信息的情况下，考虑到本领域所公知的事实：作为多肽一级结构的氨基酸序列是多肽空间结构的基础，而空间结构又直接决定其功能，氨基酸序列的微小变化可能会导致空间结构的巨变，进而导致功能发生改变。显然，基于现有技术证据，本领域技术人员对该FDC亲本酶进行突变试验获得具有改善的苯乙烯催化效率的结果缺乏合理的成功预期，因此，本领域技术人员并不能通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验就可以获得该FDC亲本酶特定位点（175、190和193位）的单突变变体及组合突变变体，换言之，本领域技术人员并不能基于对比文件6所公开的肉桂酸脱羧酶Fdc1p自身所具备的肉桂酸脱羧酶的性质且考虑到本领域的公知常识而容易地获得该FDC亲本酶特定位点（175、190和193位）的单突变变体及组合突变变体。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2018年01月05日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审决定所依据文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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