发明创造名称：一种小反刍兽疫转基因植物疫苗高效表达载体的构建方法
外观设计名称：
决定号：200929
决定日：2020-01-08
委内编号：1F253927
优先权日：
申请（专利）号：201410669120.0
申请日：2014-11-20
复审请求人：青岛农业大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：张弛
合议组组长：马振莲
参审员：马岚
国际分类号：C12N15/82，C12N15/66
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：如果要求保护的发明相对于最接近的现有技术存在区别特征，而现有技术整体上给出了将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的技术启示，则发明是显而易见的，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410669120.0，名称为“一种小反刍兽疫转基因植物疫苗高效表达载体的构建方法”的发明专利申请。申请人为青岛农业大学。本申请的申请日为2014年11月20日，公开日为2015年04月08日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年11月06日发出驳回决定，以权利要求1-3不具备专利法第22条第3款的创造性为由，驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：2014年11月20日申请日提交的说明书第1-17页（即第1-260段）、说明书附图第1-4页（即图1-图21）、说明书摘要、摘要附图、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-19页，以及2016年12月15日提交的权利要求第1-3项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 植物表达载体pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34和pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)酶切：
用XbaI和EcoRI分别双酶切质粒pBI121-CsVMV-GFP-MAR12和pBI121-GFP-F-MAR34和pBI121-GFP-F-KDEL-MAR34
酶切体系：10μL质粒，2.5μL10×M buffer，两种酶各lμL，10.5μL ddH20，总反应体积为25μL，37℃酶切2.5h，
(2)琼脂糖凝胶电泳分别回收两片段pBI121-CsVMV-GFP-MAR12、pBI121-GFP-F-MAR34和pBI121-GFP-F-KDEL-MAR34分别记为片段A、B和C，
(3)连接：
连接体系：4μL片段A，4μL片段B或C，1μL 10×T4 DNA ligase buffer，1μL T4 DNA连接酶，总反应体系为10μL，16℃连接过夜。
(4)转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，提取质粒酶切验证。
2. 植物表达载体pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34和pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34构建，其特征在于，步骤如下：
(1)酶切：
用BamHI和EcoRI分别双酶切质粒pBI121-CsVMV-MAR12、pBI121-GFP-F-MAR34和pBI121-GFP-F-KDEL-MAR34
酶切体系：10μL质粒，2.5μLl×K buffer，两种酶各lμL，10.5μL ddH20，总反应体积为25μL，37℃酶切3h，
(2)琼脂糖凝胶电泳分别回收两片段pBI121-CsVMV-MAR12、pBI121-GFP-F-MAR34和pBI121-GFP-F-KDEL-MAR34分别记为片段A、B和C，
(3)连接：
连接体系：4μL片段A，4μL片段B或C，lμL l0×T4 DNA ligase buffer，lμL T4 DNA连接酶，总反应体系为10μL，16℃连接过夜，
(4)转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，提取质粒酶切验证。
3. 植物表达载体pBI121-F的构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)酶切：
酶SmaI和SacI双酶切pBI121质粒
酶切体系如下：10μL质粒，2.5μL10×T buffer，2.5μL 1％BSA，两种酶各lμL，8μL ddH20，总反应体积为25μL，30℃酶切3h，
酶PvuII和BstxI分步双酶切pF
酶切体系如下：10μL质粒，2.5μL10×M buffer，PvuII lμL，11.5μL ddH20，总反应体积为25μL，37℃酶切4h，酶切完成后进行乙醇回收沉淀DNA，进行下一步酶切，
酶切体系如下：10μL乙醇回收DNA，2.5μLl0×H buffer，BstxI lμL，11.5μL ddH20，总反应体积为25μL，45℃酶切4h，
(2)将pBI121和pF的酶切产物琼脂糖凝胶电泳，分别回收两DNA片段，标记为片段A、B，
(3)连接
连接体系：2.5μL片段A，5μL片段B，2.5μL l0×T4 DNA ligase buffer，1μL T4 DNA ligase，14μL ddH20，总反应体系为25μL，16℃连接过夜，
(4)转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落PCR正反向验证，引物分别为MAR12-PCR-IN的上游和F的下游，F的上游和MAR34-PCR-IN的下游，提取质粒酶切验证。”
驳回决定中引用以下对比文件：
对比文件1：“农杆菌介导小反刍兽疫病毒H、F基因转化苜蓿的初步研究”，刘霞，中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑 D050-118，公开日：2011年05月15日；
对比文件2：“转基因苜蓿植物疫苗的研究”，杨国峰等，中国草学会饲料生产委员会第15次饲草生产学术研究会论文集，第275-278页；公开日：2009年04月01日。
驳回决定认为：权利要求1-3分别请求保护植物表达载体pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34和pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34，pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34和pBI121-CsVMV-F-KDEL-MAR12-MAR34，pBI121-F的构建方法。对比文件1（参见摘要、第16页第2.2.1节至第24页第3.2.5节）公开了利用PPRV中的F基因以及表达载体pBI121构建在苜蓿中进行表达的载体pBI121-GFP-MAR-F。权利要求1与对比文件1相比的区别特征在于：本申请利用F基因与pBI121的连接方式以及表达元件的选择与对比文件1不完全相同，构建步骤存在不同。其实际解决的技术问题是：提供一种适于在苜蓿中进行表达的含PPRV-F基因的植物表达载体的构建方法。对比文件1（参见摘要、第37-38页第5.1.1-5.1.3节、第40-41页第5.5.1节）还公开了为了提高外源基因在苜蓿中的表达，可以对启动子进行选择和改造；针对PPRV-H基因构建植物表达载体时，可以选择添加KDEL序列；KDEL序列能够提高目的蛋白在转基因植物中的稳定性，MAR序列能够使外源基因在植物中高效表达。对比文件2（参见第276页第4段）公开了与其他启动子相比，CsVMV启动子在苜蓿中的活性最高，适于在苜蓿中使用。因而，本领域技术人员有动机利用CsVMV启动子、KDEL序列和MAR序列对pBI121-GFP-MAR-F进行改造并通过有限的实验和普通技术知识确定表达元件的种类、连接顺序和序列，MAR双侧插入也是本领域的常规选择，本领域技术人员也能够根据实际需要采用常规实验手段选择中间载体、选择酶切位点/酶切体系、连接体系和质粒验证条件等，且申请人在意见陈述中所称有益效果均是现有技术已知的或本领域技术人员可以合理预期的，没有证据表明请求保护的重组质粒在苜蓿中进行表达时取得了预料不到的技术效果。因此，在对比文件1的基础上，结合对比文件2和本领域的常规技术和常规选择获得权利要求1-3请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1-3不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人青岛农业大学（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年04月03日向国家知识产权局提出了复审请求，未提交修改的申请文件。复审请求人认为：权利要求1与对比文件1相比至少有以下区别特征：限定了F基因和pBI121的连接方式和表达元件的选择；启动子为CsVMV，MAR序列为双侧插入；构建过程使用中间载体过渡。其解决的技术问题是：通过基因重组的方法将F基因与植物表达载体pBI121连接，并且在其两侧加入调控使其能在植物中高效表达。（1）本申请使用CsVMV启动子替代pBI121上原CaMV35启动子可以提高外源基因的表达效率，对比文件1没有给出CaMV35启动子存在问题的解决方案，对比文件2仅公开CsVMV启动子在苜蓿中活性高，但未公开其在苜蓿中表达的具体实施方案和效率的高低；（2）对比文件1中公开的是H-KDEL，而非F-KDEL；本申请双侧插入MAR序列可以使外源基因能够高效表达；使用中间载体提高了载体构建成功率；构建添加KDEL序列的表达载体可以提高免疫蛋白的稳定性，提高免疫效果，具有更优的技术效果。对比文件2没有公开其他调控序列对基因表达的影响。综上，本申请与对比文件1在启动子、目的基因、MAR序列插入方式、载体构建过程等方面不同，本领域技术人员难以根据对比文件1-2获得本申请使用中间载体通过酶切、回收、连接、转化验证的步骤来构建载体的技术方案。因此，权利要求1-3具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年06月20日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中重申了驳回理由，坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年11月14日向复审请求人发出复审通知书，指出权利要求1-3不具备专利法第22条第3款规定的创造性，具体理由如下：（1）权利要求1请求保护植物表达载体pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34和pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34的构建方法。对比文件1（参见第16页第1段-第28页第1段）公开了植物表达载体pBI121-GFP-MAR-F及其构建方法。权利要求1与对比文件1相比的区别特征在于：权利要求1的载体中的启动子为CsVMV启动子，而对比文件1的启动子为载体pBI121本身的CaMV35S启动子；权利要求1的载体还包括MAR34元件，载体pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34还进一步包括KDEL元件，并限定了元件的连接顺序；载体构建步骤和参数条件不同。权利要求1实际解决的技术问题是：如何提高载体的稳定性和外源基因的表达。但是，首先，对比文件2（参见第276页第4段）公开了CsVMV启动子在苜蓿中活性最高，给出了使用CsVMV启动子替换pBI121本身的CaMV35S启动子以提高表达载体在苜蓿中外源基因启动强度和表达量的技术启示。其次，对比文件1（参见第16页第1段-第28页第1段、第37页第1段-第39页第2段）给出了在外源基因F后连接KDEL元件，以及在外源基因另一侧连接MAR元件以提高外源基因表达稳定性，增强其表达的技术启示，选择MAR元件中的MAR34以及MAR12/MAR34的放置位置均是本领域的常规选择。最后，载体构建步骤和参数条件是在对比文件1的基础上通过常规实验手段可以调整确定的。因此，在对比文件1的基础上，结合对比文件2和本领域的常规实验手段获得权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备创造性。（2）权利要求2与权利要求1相比，其区别在于，使用的酶切位点和中间质粒pBI121-CsVMV-MAR12不同，以及酶切体系和条件略有不同。本领域技术人员根据需要可以选择使载体不含GFP元件，去除后其功能相应消失；酶切位点、酶切体系和条件均是本领域的常规实验手段。因此，基于评述权利要求1相同或相似的理由，权利要求2不具备创造性。（3）权利要求3与对比文件1相比的区别特征在于：使用pF中间载体和pBI121载体构建获得了不含GFP元件和MAR元件的植物表达载体，并限定了所使用的酶切位点；限定了酶切体系、连接体系和正反向验证引物。其实际解决的技术问题是：构建一种结构更为简单的植物表达载体。结合针对权利要求1的评述，本领域技术人员在对比文件1的基础上可以常规调整确定所使用的表达载体、酶切位点、酶切体系、连接体系和验证操作，省略GFP元件和MAR元件后，其相应的功能也随之消失。因此，权利要求3不具备创造性。（4）对于复审请求人的意见陈述，合议组认为：本领域技术人员基于启动子活性与其调控的外源基因的表达效率之间的普遍认知，能够在对比文件2的启示下预期以CsVMV启动子替代pBI121原有的CaMV35启动子可提高外源基因的表达效率。本领域技术人员在对比文件1的基础上能够采用常规实验手段构建F-KDEL并预期其也可以实现提高稳定性从而提高免疫效果的技术效果，并有动机在双侧插入MAR序列。本领域技术人员根据本申请说明书的记载，无法确定本申请是否构建获得了权利要求1-3请求保护的载体，也无法证明复审请求人所主张的“使用中间载体提高了载体构建成功率”的技术效果是否能够实现。
复审请求人于2019年12月15日、2019年12月26日分别提交了意见陈述书，但未提交修改的申请文件。复审请求人在意见陈述书中重申了提出复审请求时主张的理由，认为权利要求1-3具备创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
复审请求人在复审程序中未提交修改的申请文件，因此，本复审请求审查决定所针对的审查文本同驳回决定所依据的文本，即：2014年11月20日申请日提交的说明书第1-17页（即第1-260段）、说明书附图第1-4页（即图1-图21）、说明书摘要、摘要附图、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-19页，以及2016年12月15日提交的权利要求第1-3项。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果要求保护的发明相对于最接近的现有技术存在区别特征，而现有技术整体上给出了将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的技术启示，则发明是显而易见的，不具备创造性。
1、权利要求1请求保护植物表达载体pBI121-CsVMV-GFP-F-MAR12-MAR34和pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34的构建方法。对比文件1（参见第16页第1段-第28页第1段）公开了：植物表达载体pBI121-GFP-MAR-F及其构建方法，包括：PCR扩增获得F、MAR12、GFP片段，与pMD-19-T载体连接获得pMD19-T-F、pMD19-T-MAR12、pMD19-T-GFP。利用质粒pBI121和pMD19-T-GFP进行BamHI和SmaI双酶切构建获得中间表达载体pBI121-GFP，利用质粒pBI121-GFP和pMD19-T-MAR12用HindIII酶切构建获得中间表达载体pBI121-GFP-MAR，利用pBI121-GFP-MAR12（即pBI121-GFP-MAR）和pMD19-T-F分别用SmaI和SacI双酶切或PvuII酶切，酶切体系为：15μL质粒，5μL 10×M buffer，1μL PvuII，24μL ddH2O，总反应体积为50μL。37℃酶切2h后，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，-20℃保冷30-60min，12000rpm离心5min后用70%乙醇洗沉淀后用BstXI酶切。1%琼脂糖凝胶电泳后pBI121-GFP-MAR12回收大片段，pMD19-T-F回收小片段，T4DNA连接酶16℃连接4h，转化大肠杆菌提取质粒，PCR、酶切鉴定，MAR序列用正反引物做PCR筛选正向连接，构建获得pBI121-GFP-MAR-F。权利要求1与对比文件1相比的区别特征在于：（1）权利要求1的载体中的启动子为CsVMV启动子，而对比文件1的启动子为载体pBI121本身的CaMV35S启动子；（2）权利要求1的载体还包括MAR34元件，载体pBI121-CsVMV-GFP-F-KDEL-MAR12-MAR34还进一步包括KDEL元件，并限定了元件的连接顺序；（3）载体构建步骤和参数条件不同。权利要求1实际解决的技术问题是：如何提高载体的稳定性和外源基因的表达。
对于区别特征（1），对比文件2（参见第276页第4段）公开了：使用GUS或几丁质酶作为报告基因比较了双35S启动子、玄参花叶病毒FMV启动子、木薯叶脉花叶病毒CsVMV启动子、甘蔗杆状病毒ScBV启动子以及苜蓿Rubisco小亚基基因启动子等五种不同启动子在苜蓿中的活性，结果表明CsVMV启动子活性最高，值得在转基因苜蓿中推广使用。在对比文件2的启示下，本领域技术人员出于提高表达载体中外源基因在苜蓿中的启动强度和表达量的目的，有动机选择在苜蓿中活性更高的CsVMV启动子替换pBI121本身的CaMV35S启动子。
对于区别特征（2），对比文件1还公开了植物表达载体pBI121-GFP-MAR-H-KDEL及其构建方法，包括：PCR扩增H-KDEL、MAR12、GFP片段，与pMD-19-T载体连接获得pMD19-T-H-KDEL、pMD19-T-MAR12、pMD19-T-GFP。利用质粒pBI121和pMD19-T-GFP构建进行BamHI和SmaI双酶切获得中间表达载体pBI121-GFP，利用质粒pBI121-GFP和质粒pMD19-T-MAR12用HindIII酶切构建获得中间表达载体pBI121-GFP-MAR，利用质粒pBI121-GFP-MAR12（即pBI121-GFP-MAR）和pMD19-T-H-KDEL分别用SmaI和SacI双酶切或SmaI酶切构建获得植物表达载体pBI121-GFP-MAR-H-KDEL。KDEL是将蛋白质滞留在内质网中的一种内质网驻留蛋白信号序列，其信号在高尔基体各部分的膜上都有相应受体。为了提高目的蛋白在转基因植株中的稳定性，在下游引物终止密码子前引入此序列，与目的蛋白融合，以使目的蛋白驻留内质网中。GFP基因在表达和定位等方面更具优越性，因而用GFP基因代替GUS基因。现有技术表明，将MAR序列构建到外源基因表达框两侧，构建成包含MAR-gene-MAR结构的植物表达载体，对转基因表达具有很强的增强作用，或者可以降低不同转基因个体间表达水平的差异，抑制转基因沉没，外源基因两侧连有MAR的载体提高表达水平的效果优于一端连有MAR的载体，外源基因与核基质的结合更稳定，更有利于转录。将MAR构建到表达载体外源基因的两侧，就有可能使目的基因在转基因植物的染色质中形成独立的区域，进而促进其表达（参见第16页第1段-第28页第1段、第37页第1段-第39页第2段）。因而，本领域技术人员出于提高外源基因表达稳定性、增强其表达的目的，有动机在对比文件1的启示下，在外源基因F后连接KDEL元件，以及在外源基因另一侧连接MAR元件，且MAR34是本领域常规使用的MAR元件，可以常规选用。而将MAR12/MAR34分别放置在F/F-KDEL两侧，或者分别放置在整个表达盒CsVMV-GFP-F/F-KDEL两侧，均是本领域的常规选择，其能够实现促进表达的技术效果是可以预料到的。
对于区别特征（3），首先，如前所述，选用合适的酶切位点，酶切中间质粒，琼脂糖凝胶电泳回收片段，连接，并转化大肠杆菌感受态细胞，PCR和酶切验证已经被对比文件1公开，具体酶切位点、酶切体系、连接体系、验证操作均是本领域技术人员在对比文件1的基础上可以通过常规实验手段调整确定的。其次，如前所述，本领域技术人员有动机构建植物表达载体pBI121-MAR12-CsVMV-GFP-F/F-KEDL-MAR34，在此基础上，构建含有所需元件的中间质粒，例如，pBI121-CsVMV-GFP-MAR12、pBI121-GFP-F-MAR34和pBI121-GFP-F-KEDL-MAR34是本领域的常规实验手段。
因此，在对比文件1的基础上，结合对比文件2和本领域的常规实验手段获得权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2、权利要求2请求保护一种植物表达载体pBI121-CsVMV-F-MAR12-MAR34和pBI121-CsVMV- F-KDEL-MAR12-MAR34的构建方法。该方法与权利要求1使用的酶切位点和中间质粒pBI121-CsVMV-MAR12不同，以及酶切体系和条件略有不同。首先，酶切位点和中间质粒不同是为了获得不含GFP元件的植物表达载体，而本领域技术人员根据需要可以常规地选择使植物表达载体不含GFP元件，其相应的功能也随之消失。在此基础上，如针对权利要求1的评述中所述，本领域技术人员在对比文件1的基础上，结合对比文件2和本领域的常规实验手段可以构建获得含有所需元件的中间质粒pBI121-CsVMV-MAR12，并根据需使用的片段常规选择合适的酶切位点。其次，如针对权利要求1的评述中所述，具体的酶切体系和反应条件是本领域技术人员在对比文件1的基础上可以常规调整确定的。因此，在对比文件1的基础上，结合对比文件2和本领域的常规实验手段获得权利要求2请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求2不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、权利要求3请求保护植物表达载体pBI121-F的构建方法。如针对权利要求1的评述中所述，对比文件1公开了植物表达载体pBI121-GFP-MAR-F及其构建方法。权利要求3与对比文件1相比的区别特征在于：（1）使用pF中间载体和pBI121载体构建获得了不含GFP元件和MAR元件的植物表达载体，并限定了所使用的酶切位点。（2）限定了酶切体系、连接体系和正反向验证引物。其实际解决的技术问题是：构建一种结构更为简单的植物表达载体。
对于区别特征（1），在对比文件1已经公开了中间载体pMD19-T-F以及植物表达载体的骨架载体为pBI121的基础上，本领域技术人员根据需要也可以选择构建植物表达载体pBI121-F，省略GFP元件和MAR元件后，其相应的功能也随之消失。在此基础上，选择常规的pUCM-T构建pF，并选择合适的酶切位点是本领域的常规实验手段。
对于区别特征（2），如针对权利要求1的评述中所述，酶切体系、连接体系、验证操作均是本领域技术人员在对比文件1的基础上可以常规调整确定的。
因此，在对比文件1的基础上，结合本领域的常规实验手段获得权利要求3请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求3不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）关于复审请求人的意见陈述
对于复审请求人的意见陈述，合议组认为：如复审通知书中所指出的，（1）对比文件2公开了包括双35S启动子和CsVMV启动子在内的五种启动子在苜蓿中CsVMV启动子活性最高，在此基础上，本领域技术人员基于启动子活性与其调控的外源基因的表达效率之间的普遍认知，能够预期CsVMV启动子替代pBI121原有的CaMV35启动子后，可提高外源基因的表达效率，而用已知的CsVMV启动子替换已知载体pBI121上的CaMV35启动子是本领域技术人员采用基因工程领域的常规实验手段可以实现的。（2）首先，如针对权利要求1的评述中所述，对比文件1已经公开了小反刍兽疫病毒的F和H均可用于构建植物表达载体，以及下游引物终止密码子前引入KDEL，使之与目的蛋白融合，可以提高目的蛋白在转基因植株中的稳定性，并实际构建了H-KDEL，在此基础上，本领域技术人员有动机采用常规实验手段构建F-KDEL，并能够预期其也可以实现提高稳定性从而提高免疫效果的技术效果。其次，如针对权利要求1的评述中所述，对比文件1公开了外源基因两侧连有MAR的载体提高表达水平的效果优于一端连有MAR的载体，外源基因与核基质的结合更稳定，更有利于转录，因而，本领域技术人员有动机在双侧插入MAR序列。（3）关于载体构建成功率：本申请说明书第15页倒数第2段-第17页最后一段记载了权利要求1-3请求保护的植物载体的构建方法，其中，记载了“挑取单菌落PCR验证，提取质粒酶切验证”以及相应实验结果图16-17、图18-19、图20-21。但是，① 根据图16、图18、图20的附图说明可知，其均为中间载体双酶切电泳图，本申请其他部分也未记载请求保护的植物载体的酶切验证的实验结果数据；② 图17为pBI121-C-G-F-12-34、pBI121-C--G-FKDEL-12-34 PCR验证结果，其中1-4为pBI121-C-G-F-12-34 PCR验证，2为pBI121-C--G-FKDEL-12-34 PCR验证，上述记载本身自相矛盾，即使将其理解为5-8为pBI121-C--G-FKDEL-12-34 PCR验证，本申请中也没有记载PCR使用的引物，根据图16和图17的对比，仅能知晓电泳片段大小相当，无法获知电泳片段的具体结构，本领域技术人员根据上述实验结果，不能确定是否构建获得了权利要求1请求保护的载体。同样的，本领域技术人员根据图19所示的实验结果，也不能确定是否构建获得了权利要求2请求保护的载体。③ 本申请说明书第17页最后一段记载了PCR引物分别为MAR12-PCR-IN的上游和F的下游，F的上游和MAR34-PCR-IN的下游。其中，MAR12-PCR-IN和MAR34-PCR-IN分别是用于扩增MAR12和MAR34片段的，但是pBI121-F载体是采用pBI121质粒和pF质粒构建而成的，根据本申请实施例2的记载可知，pF是将扩增获得的F基因连接到pUCM-T载体构建获得的，由此可知，pBI121-F载体上不含MAR12和MAR34片段，从而导致本领域技术人员根据图21的PCR结果，不能确定是否构建获得了权利要求3请求保护的载体。因此，本领域技术人员根据本申请的记载，无法确定是否构建获得了权利要求1-3请求保护的载体，也无法证明复审请求人所主张的“使用中间载体提高了载体构建成功率”的技术效果是否能够实现。综上，复审请求人意见陈述的理由不成立，权利要求1-3仍然不具备创造性。
基于上述事实和理由，本案合议组作出如下复审决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年11月06日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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