发明创造名称：植酸酶突变体及其应用
外观设计名称：
决定号：199819
决定日：2020-01-06
委内编号：1F253424
优先权日：
申请（专利）号：201410802673.9
申请日：2014-12-19
复审请求人：青岛蔚蓝生物集团有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：董桂灵
合议组组长：林峻凯
参审员：于婷
国际分类号：C12N9/16，C12N15/55，C12N15/81，C12N1/19，C12R1/84
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：判断一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中不存在这种启示，并且该发明取得了有益的技术效果，则该发明具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410802673.9，名称为“植酸酶突变体及其应用”的发明专利申请。申请人为青岛蔚蓝生物集团有限公司。本申请的申请日为2014年12月19日，公开日为2015年03月25日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年03月06日发出驳回决定，以权利要求1-5不符合专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为申请日2014年12月19日提交的说明书摘要、说明书第1-8页（即第1-85段）、摘要附图、说明书附图第1页（即图1-图2）、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-15页，以及2017年06月24日提交的权利要求第1-5项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种植酸酶突变体，其特征在于，所述的植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。
2. 编码权利要求1所述的植酸酶突变体的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQ ID NO:8。
3. 一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求2所述的基因。
4. 一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为转化/转染权利要求3所述的重组质粒的宿主细胞。
5. 如权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)。”
驳回决定认为：（1）权利要求1、2分别请求保护在本申请SEQ ID NO.1植酸酶基础上进行D35Y/F254Y/Q184E/Y289K/I405L突变获得的突变体（氨基酸序列为SEQ ID NO.7）及其编码基因序列，它们与对比文件1（CN102392002A，公开日为2012年03月08日）所公开的耐高温大肠杆菌植酸酶突变体（参见摘要、权利要求1-3，该突变体氨基酸如SEQ ID NO.2所示，第2-411位氨基酸与本申请SEQ ID NO.1植酸酶完全相同）的区别在于：本申请对耐高温植酸酶进行进一步突变，以提高植酸酶的耐高温性能，且本申请比对比文件1的SEQ ID NO：2少了N端的一个起始甲硫氨酸。基于此，权利要求1、2实际解决的技术问题是提供另外的耐高温植酸酶突变体及其编码基因。然而，获得具有耐高温活性的植酸酶或其突变体是本领域的普遍需求，且是现有技术的研究热点。通过对植酸酶氨基酸序列进行单位点或多位点组合突变，筛选耐高温活性得到提升的植酸酶变体，是本领域的常规做法。因此，在对比文件1公开了对大肠杆菌植酸酶进行突变后获得热稳定性提高的SEQ ID NO：2植酸酶变体的基础上，为了进一步提高其耐热性，本领域技术人员有动机在其基础上进行进一步的突变。且对比文件2（“A multi-factors rational design strategy for enhancing the thermostability of Escherichia coli AppA phytase”，Fei BJ 等，《J Ind Microbiol Biotechnol》，第40卷，第457-464页，公开日为2013年03月14日）同样公开了对大肠杆菌植酸酶进行突变，以提高其热稳定性，并具体公开了：80℃加热7.5min，Q206E、Y311K单位点突变的植酸酶突变体热稳定性比野生植酸酶分别提高了9.38％、7.82％，I427L突变植酸酶突变体比野生植酸酶提高了13.16％。多位点突变中，Y311K/I427L > Q206E/I427L > Q206E/Y311K/I427L > Q206E/Y311K≈野生型，80℃加热10min，残余酶活力分别为61.7%、49.48%、41.05%、32.48%、30.97 %（参见第460页左栏最后1段-第461页左栏最后1段）。其中对比文件2公开的Q206E、Y311K、I427L突变分别对应于本申请不含信号肽植酸酶的Q184E、Y289K、I405L突变。由此可见，对比文件2已经公开了热稳定性提高约30％的大肠杆菌植酸酶突变体。在对比文件1的基础上结合对比文件2及本领域常规技术手段，为了进一步提高植酸酶的热稳定性，本领域技术人员容易想到进一步对植酸酶进行单位点或多位点组合突变，并通过常规试验确定突变氨基酸的位置及类型。而在氨基酸序列的N端添加起始甲硫氨酸为本领域的常规操作，本领域技术人员可根据实际需要确定是否添加。综上，权利要求1、2请求保护的植酸酶突变体或其编码基因序列是本领域技术人员在现有技术基础上结合常规试验容易获得的。且相对于现有技术，由于对比文件2的Q206E/Y311K/I427L突变体80℃加热10min残余酶活力为41.05%，耐热性提升最高的突变体残余酶活力为61.7%。本发明D35Y/F254Y/Q184E/Y289K/I405L植酸酶突变体80℃加热5min残余酶活力47.06％的效果，由于加热时间较对比文件2有所缩短，本领域技术人员看不出本发明植酸酶突变体的耐热效果显著优于现有技术，这种效果并未超出本领域技术人员可以合理预期的范围，因此本申请并未取得任何预料不到的技术效果。权利要求1、2不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。（2）权利要求3-5分别请求保护重组质粒或重组宿主细胞，对比文件1同样公开了含有耐高温植酸酶编码基因的重组载体，以及被重组载体转化的宿主（参见权利要求5-6）。并公开了重组菌株优选毕赤酵母菌株GS115（参见说明书第15段）。因此，在其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求3-5同样不具备创造性。
申请人青岛蔚蓝生物集团有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年06月07日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。复审请求人认为：（1）首先，在酶蛋白技术领域中有动机和能够合理预期并不代表在现有技术基础上一定就能获得目的蛋白酶。在不充分了解三级结构的情况下，具体选择哪个位点或哪几个位点的氨基酸进行取代，以及用何种氨基酸来取代最初氨基酸的过程本身就属于创造性劳动的过程。其次，对某一特定突变位点或突变型的技术效果是难于预期的。本发明筛选大量突变体的过程中发现，有些突变对耐热性无影响，有些突变耐热性或酶活变差了，有些突变，虽然能提高酶对温度的耐受性，但突变后酶学性质发生了显著变化，这些均不符合要求。最终，得到既能显著提高酶耐热性，又不会影响酶活及原有酶学性质的突变位点组合：D35Y/F254Y/Q184E/Y289K/I405L。对比文件2中不同单位点突变的热稳定性提高程度不同，Y311K/I427L的耐热性效果好于Q206E/Y311K/ I427，但Q206E/Y311K的耐热性跟野生型区别不大。由此可知，单位点突变效果提高，但双位点的耐热性效果却降低，这充分说明了酶突变位点的随机性和难以预测性。（2）本发明的出发酶有410个氨基酸，选择哪个位点进行改造，以及该位点替换为何种氨基酸（每个位点还有19种选择），并不是简单的有限次实验能够完成。在对比文件没有给出在指定氨基酸序列位点或区域进行突变的情况下，实验次数多少不应该作为发明是否具有创造性的判断依据，在现有技术不存在相应技术启示的情况下，都不应当影响对发明创造性的评价。（3）本发明的突变酶，其酶活检测受到各种因素的影响，在检测条件明显不同的情况下，不能简单认为本发明所保护的突变体不如对比文件所公开的突变体的效果的。综上，认为本发明的突变体相比于对比文件具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年06月15日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中基于与驳回决定相同的理由，坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在提出复审请求时未修改申请文件。因此，本复审决定所依据的审查文本为驳回决定所针对的文本，即：申请日2014年12月19日提交的说明书摘要、说明书第1-8页（即第1-85段）、摘要附图、说明书附图第1页（即图1-图2）、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-15页，以及2017年06月24日提交的权利要求第1-5项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，判断一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中不存在这种启示，并且该发明取得了有益的技术效果，则该发明具备创造性。
就本案而言，权利要求1要求保护一种植酸酶突变体，其特征在于，所述的植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，其是在本申请SEQ ID NO.1植酸酶基础上进行D35Y/F254Y/Q184E/Y289K/I405L突变获得的突变体。对比文件1公开了一种耐高温大肠杆菌植酸酶突变体，通过对大肠杆菌植酸酶APPA氨基酸序列中的第47位用F替代A，第92位用E替代G，第136位用H替代T，第159位用V替代N，第164位用R替代D，第237位用R替代G；改良后的植酸酶HTP6M其热稳定性有明显提高，耐高温植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示（参见摘要、权利要求1-3）。经比对发现，对比文件1公开的SEQ ID NO：2所示耐高温大肠杆菌植酸酶突变体HTP6M的第2-411位氨基酸（该植酸酶突变体HTP6M全长411个氨基酸）与本申请的出发植酸酶HTP6M的SEQ ID NO.1植酸酶（全长410个氨基酸）完全相同。
权利要求1与对比文件1的区别特征为：权利要求1的植酸酶突变体在对比文件1的植酸酶突变体HTP6M的基础上，缺少了N端的一个起始甲硫氨酸，并且突变了五个位点，即D35Y、F254Y、Q184E、Y289K、I405L，得到五位点突变体HTP6M5。根据本申请说明书的记载，该五位点突变体HTP6M5，相对于亲本HTP6M的最适作用温度和最适作用pH没有发生改变，但耐热性得到显著提高，亲本HTP6M在80℃处理5min后残留酶活仅剩 17％，而突变体HTP6M5的残留酶活比亲本提高了30.06％（参见本申请说明书第[0076]-[0083]段和图2）。由此可知，权利要求1实际解决的技术问题是提供改善耐热性的植酸酶突变体。
对此，对比文件2公开了对大肠杆菌植酸酶进行突变以提高其热稳定性，并具体公开了：80℃加热7.5min，Q206E、Y311K单位点突变的植酸酶突变体热稳定性比野生植酸酶分别提高了9.38％、7.82％，I427L突变植酸酶突变体比野生植酸酶提高了13.16％。多位点突变中，Y311K/I427L > Q206E/I427L > Q206E/Y311K/I427L > Q206E/Y311K≈野生型，80℃加热10min，残余酶活力分别为61.7%、49.48%、41.05%、32.48%、30.97 %（参见第460页左栏最后1段-第461页左栏最后1段）。其中对比文件2公开的Q206E、Y311K、I427L突变分别对应于本申请不含信号肽植酸酶的Q184E、Y289K、I405L突变。但是对比文件2没有公开D35Y、F254Y突变。
驳回决定及前置审查意见认为：（1）获得具有耐高温活性的植酸酶或其突变体是本领域的普遍需求，也是研究热点。通过对植酸酶氨基酸序列进行单位点或多位点组合突变，筛选耐高温活性得到提升的植酸酶变体，是本领域的常规做法。对比文件1、2以及很多现有技术均是通过点突变或组合突变筛选获得了热稳定性提高的植酸酶突变体。尽管对某一特定突变位点或突变类型的技术效果可能难于预期，但基于现有技术发展状况，本领域技术人员能够合理预期，通过点突变能够获得热稳定性提高且酶活性质不发生显著改变的大肠杆菌植酸酶突变体，并有动机进一步尝试现有技术中尚未进行点突变的位点，以求获得技术效果更好的突变体。同时，突变位点和可用于突变的氨基酸都是有限的，因此，通过点突变得到热稳定性提高的植酸酶突变体是本领域技术人员在现有技术的基础上通过有限的试验可以得到的。（2）在本领域技术人员有动机对植酸酶进行突变、筛选性能改进突变体的前提下，通过重复更换不同位置氨基酸、对不同类型氨基酸进行替换来筛选活性改善突变体并不能给本发明带来创造性，本领域技术人员通过常规有限的实验容易获得。（3）对比文件2在80℃加热10min条件下耐热性提升最高的突变体残余酶活力为61.7%。本发明植酸酶突变体HTP6M5 80℃加热5min残余酶活力47.06％的效果，本申请未取得预料不到的技术效果。
对此，合议组认为：（1）本申请是以对比文件1的植酸酶变体作为发明起点，所采用的技术手段也是常见的定点突变技术，发明目的以及所希望解决的技术问题也跟该领域的普遍追求相一致，但仅仅使用这些特点再去基于现有技术进行改进以获得发明的可能性或可行性，可能会造成对发明高度的低估。虽然对比文件1和2均是针对大肠杆菌的APPA植酸酶进行点突变组合以期改善耐热性，但从对比文件2公开的不同位点突变组合来看，Y311K/I427L和Q206E/I427L的耐热性优于Q206E/Y311K/I427L，但Q206E/Y311K的耐热性与野生型类似。因此并不能通过对比文件2的公开内容预测APPA植酸酶的突变位点越多，耐热性改善效果越好；由于对比文件2公开的不同突变位点组合（2位点&3位点）之间的耐热性结果差异较大，所以本领域技术人员也无法预测不同点突变组合能否改善突变体的耐热性。基于对比文件2的教导，本领域技术人员难以想到将对比文件1的植酸酶变体的第35位和第254位氨基酸进行D35Y、F254Y突变并与对比文件2的“Q206E/Y311K/I427L”进行组合来获得五位点突变组合的启示。（2）大肠杆菌植酸酶APPA有410个氨基酸，每个位置可替换的氨基酸类型也有多种，理论上可选择的取代种类超过41019种可能性。虽然对比文件2公开了从结构生物信息学研究合作组织（RCSB，1DKQ）下载获得AppA的晶体结构，并根据先前研究，在整个论文中对残基进行了编号（参见对比文件2的第458页右栏第1段），对比文件2还根据晶体结构分析、通过合理策略设计了可选突变位点：N161R，Q182E，Q206E，Q307D，Y311K和Q380R，并预测Q307和Y311诱变后能与其他氨基酸位点形成新的盐桥，并具有更高的RMSF值（蛋白柔韧性指标）（参见第459页右栏第3段，图2和表1-2），但并没有通过分析指向本申请所述的突变位点D35和F254。对比文件2验证了不同的单位点突变体的突变结果差异就较大，如Y311K突变提高了7.82%，但其他突变体与野生型呈现相似的热稳定性，不在预测盐桥范围内的I427L突变的热稳定性提高程度最高；Q206E/Y311K/I427L这一三重突变体并没有达到想要的最高热稳定性；而Q206E/Y311K的热稳定性类似于野生型（参见对比文件2的第460页左栏最后1段-第460页右栏1段，图3）。由此可见，根据晶体结构和热稳定性相关结构（如盐桥）的预测结论存在很大不确定性，其中无规律可循，预测结果难以给出明确的技术教导。因此，即使是本领域技术人员能够根据酶的晶体结构和热稳定性相关结构进行突变设计，但面对410个氨基酸以及数十个热稳定性相关结构片段，也根本无从选择可能改善热稳定性的突变位点。在对比文件1和对比文件2并没有就如何确定改善热稳定性的突变位点以及具体引入何种突变给出方向性的充分教导的情况下，即使考虑本领域的一般性教导和对比文件2的突变策略，由于所属领域技术人员对试验结果缺乏合理的成功预期，因而通过试验将对比文件1的亲本AppA植酸酶改构为本申请所述变体也并不属于本领域技术人员应用有限试验即可获得的范畴。（3）至于80℃下残余酶活力的数据效果差异，一方面，如前所述，对比文件1和2未给出如何突变的相关教导，本申请技术方案具有非显而易见性，如本申请图2所示，经过突变组合改造的HTP6M5的残留酶活力（约46%）是出发酶HTP6M的残留酶活力（约17%）的约2.7倍，其耐热性得到显著提升，能产生有效改善大肠杆菌植酸酶AppA的热稳定性的有益的技术效果；另一方面，对比文件2在耐热性测试中使用的是纯化酶，本申请使用的是粗酶，酶存在的环境不同，并且酶活检测受到各种因素的影响，在不能确定检测条件和环境类似的情况下，不能简单认为本发明所保护的突变体不如对比文件所公开的突变体的效果，此外，即使退一步看，本申请的突变导致残留酶活提高约2.7倍（参见本申请的图2，HTP6M的17%与HTP6M5的46%），对比文件2的突变导致残留酶活提高约2倍（参见对比文件2的图4(A)，WT的30.97%与Y311/I427L的61.7%），本申请的突变改造相比于出发酶具有更好的技术效果。
综上所述，对比文件1和2均未公开本申请的权利要求1与对比文件1的区别技术特征，也未给出选择上述区别技术特征的技术启示；同时采用所述区别技术特征的变体取得了有效改善大肠杆菌植酸酶AppA的热稳定性的有益的技术效果，因此本申请权利要求1的技术方案相对于对比文件1和对比文件2的结合而言是非显而易见的，具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。同理，权利要求2-5相对于对比文件1和对比文件2的结合而言也具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
因此，驳回决定和前置审查意见认为权利要求1没有创造性的理由不成立。基于相同的理由，驳回决定和前置意见认为权利要求2-5没有创造性的理由也不成立。
基于上述事实和理由，本案合议组作出如下复审决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2018年03月06日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审决定针对的文本基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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