发明创造名称：一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法及外泌体的应用
外观设计名称：
决定号：199384
决定日：2020-01-02
委内编号：1F282125
优先权日：
申请（专利）号：201711318656.8
申请日：2017-12-12
复审请求人：湖南师范大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：张弛
合议组组长：马振莲
参审员：王翔宇
国际分类号：C12N5/0775，A61K35/28，A61P9/14
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：如果要求保护的发明相对于最接近的现有技术存在区别特征，而现有技术整体上给出了将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的技术启示，则发明是显而易见的，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201711318656.8，名称为“一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法及外泌体的应用”的发明专利申请。申请人为湖南师范大学。本申请的申请日为2017年12月12日，公开日为2018年05月08日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2019年04月04日以权利要求1-8不具备创造性为由，驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为：申请日提交的说明书第1-11页（即第1-93段）、说明书附图第1-4页（即图1-图8）、说明书摘要、摘要附图，以及2019年02月19日提交的权利要求第1-9项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
1)当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，得到细胞培养物；
2)将所述步骤1)得到的细胞培养物进行第一离心分离，得到第一上清液和第一沉淀，所述第一离心分离的速度为200～400rpm；
3)将所述步骤2)得到的第一上清液进行第二离心分离，得到第二上清液和第二沉淀，所述第二离心分离的速度为2,000～3,000rpm；
4)将所述步骤3)得到的第二上清液进行第三离心分离，得到第三上清液和第三沉淀，所述第三离心分离的重力加速度为9,000～11,000g；
5)将所述步骤4)得到的第三上清液过滤除去大囊泡，得到滤液；
6)将所述步骤5)得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，得到第四上清液和第四沉淀，所述第四离心分离的重力加速度为90,000～110,000g；所述聚乙二醇的数均分子量为5000～7000；
7)将所述步骤6)得到的第四沉淀依次经生理盐水洗涤、第五离心分离，得到的沉淀物为外泌体；所述第五离心分离的重力加速度为90,000～110,000g。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)第一离心分离的温度为1～6℃，所述第一离心分离的时间为3～8min。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)第二离心分离的温度为1～6℃，所述第二离心分离的时间为20～40min。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)第三离心分离的温度为1～6℃，所述第三离心分离的时间为50～70min。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5)过滤使用的滤膜的孔径为0.2～0.25μm。
6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6)滤液与聚乙二醇溶液的体积比为(0.5～1.5)∶(0.5～1.5)；所述聚乙二醇溶液中聚乙二醇的质量百分含量为15～25％。
7. 根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6)第四离心分离的温度为1～6℃，所述第四离心分离的时间为50～70min。
8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤7)中第五离心分离的温度为1～6℃，所述第五离心分离的时间为60～80min。
9. 权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备得到的外泌体在制备促进人脑微血管上皮细胞增殖和/或提高人脑微血管上皮细胞迁移药物中的应用。”
驳回决定中引用了以下对比文件：
对比文件1：US20170296627 A1，公开日：2017年10月19日；
对比文件2：“间充质干细胞来源外泌体的研究进展”，刘德斌等，广东医学，第38卷第1期，第145-148页，公开日：2017年01月31日。
驳回决定认为：（1）权利要求1-8不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求1请求保护一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法。权利要求1与对比文件1相比的区别特征在于：限定了外泌体来源于人嗅黏膜间充质干细胞P4和/或P5代，且融合率为85-90%；离心速度和条件不同；聚乙二醇孵育时间不同；本申请第四次离心沉淀经生理盐水洗涤后，经第五次离心获得外泌体沉淀，而对比文件1将第四次离心沉淀溶于溶液后经第五次离心获得外泌体大部分存在于上清中。权利要求1实际解决的技术问题是：提供一种获得具体细胞的外泌体沉淀的方法。而首先，对比文件1公开了可以从间充质干细胞的培养液中分离外泌体；人嗅黏膜间充质干细胞属于常见细胞类型，可以常规选用；细胞生长阶段或传代数是常规实验可以确定的。其次，本领域技术人员可以通过简单实验确定用于去除杂质的各个离心步骤的转速。再次，对比文件1公开了有些外泌体的沉淀需要更长孵育时间，本领域技术人员可以常规调整确定。最后，对比文件1公开了可以使用0.9%的生理盐水洗涤外泌体，本领域技术人员可以根据需要常规选用；省略对比文件1的糖溶液洗涤也相应地失去了纯化效果；沉淀或溶液是本领域技术人员根据对比文件1可以常规调整的。因此，权利要求1不具备创造性。从属权利要求2-8的附加技术特征是在对比文件1公开的内容的基础上，通过常规实验可以调整确定的，权利要求2-8也不具备创造性。（2）对于申请人的意见陈述，驳回决定认为：对比文件2公开了多种间充质干细胞都可分泌外泌体，因而在对比文件2的基础上，本领域技术人员可以合理预期人嗅黏膜间充质干细胞也可以分泌外泌体，并通过对比文件1的方法制备；对比文件2并未表明不同来源外泌体仅有一种功能，本领域技术人员可以基于对比文件2公开的外泌体的不同功能对所研究的间充质干细胞进行相关验证。没有现有技术证据表明超速离心必然会损伤囊泡，使用更高离心速度从而使外泌体位于沉淀中是可以预料到的，且对比文件1也获得了外泌体沉淀。省略糖纯化步骤后，也失去了相应的纯化效果。因此，意见陈述不具有说服力。（3）驳回决定其他说明部分指出：对比文件1公开了外泌体可以促进细胞增殖，对比文件2公开了间充质干细胞可以促进细胞增殖和迁移，因此，权利要求9请求保护的用途不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人湖南师范大学（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2019年05月09日向国家知识产权局提交了复审请求和修改的权利要求书全文替换页（共2页7项），其中，将原权利要求7和8合并入权利要求1，将说明书中记载的嗅黏膜间充质干细胞的细胞培养物的制备步骤补充入权利要求1，并适应性地修改了其他权利要求的编号和引用关系。提出复审请求时新修改的权利要求1如下：
“1. 一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
1)a、将1块规格为2×3mm嗅黏膜经质量体积百分含量为1.0％的青霉素溶液清洗3次后，处理为1.0mm3的组织块；b、将步骤a得到的组织块与完全培养基按照体积比为4～6块:2ml混合后，在37℃、5％CO2的条件下培养14～16天，培养过程中的第7天观察培养的细胞，之后每3天更换一次完全培养基，得到P0代嗅黏膜间充质干细胞；c、将步骤b得到的P0代嗅黏膜间充质干细胞经pH值为7.2～7.4的PBS缓冲液冲洗，弃去PBS缓冲液后，与胰酶的质量体积百分含量为0.25％胰酶溶液混合，所述PBS缓冲液与胰酶溶液的体积比为2:1，当长梭形细胞变圆变亮时，与完全培养基混合，所述胰酶溶液与完全培养基的体积比为1:2终止胰酶溶液消化，得到含有完全培养基的培养物；d、将步骤c得到的含有完全培养基的培养物离心分离，离心分离的温度为24～26℃，速度为1,500rpm，时间为5min，将得到的沉淀与完全培养基混合，按照1:(2～3)、嗅黏膜间充质干细胞的密度为0.5～1.5×105个进行传代培养，得到P1代嗅黏膜间充质干细胞，传代培养在37℃、5％CO2的条件下培养14～16天；e、重复步骤b～d，直至得到P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为87～88％，得到细胞培养物；
2)将所述步骤1)得到的细胞培养物进行第一离心分离，得到第一上清液和第一沉淀，所述第一离心分离的速度为200～400rpm；
3)将所述步骤2)得到的第一上清液进行第二离心分离，得到第二上清液和第二沉淀，所述第二离心分离的速度为2,000～3,000rpm；
4)将所述步骤3)得到的第二上清液进行第三离心分离，得到第三上清液和第三沉淀，所述第三离心分离的重力加速度为9,000～11,000g；
5)将所述步骤4)得到的第三上清液过滤除去大囊泡，得到滤液；
6)将所述步骤5)得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，得到第四上清液和第四沉淀，所述第四离心分离的重力加速度为90,000～110,000g，温度为1～6℃，分离时间为50～70min；所述聚乙二醇的数均分子量为5000～7000；
7)将所述步骤6)得到的第四沉淀依次经生理盐水洗涤、第五离心分离，得到的沉淀物为外泌体；所述第五离心分离的重力加速度为90,000～110,000g，温度为1～6℃，离心分离的时间为60～80min。”
复审请求人认为：本申请实际解决的技术问题是：提供一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的不会损伤外泌体的囊泡且能够保证外泌体获取的量的制备方法。（1）对比文件1未公开间充质干细胞的来源，嗅黏膜间充质干细胞与骨髓或脐带间充质干细胞的生物学特性以及外泌体的成分和功能不同，因而提取方法也不同；超速离心法分离效果稳定性差，损伤囊泡，无法保证外泌体数量，而对比文件1未公开所获得的外泌体的囊泡完整性、纯度以及数量，也未记载如何调整参数以解决技术问题，在已知较高离心力会损伤囊泡的基础上，不会增加离心力，但本申请限定的嗅黏膜间充质干细胞及其外泌体的制备过程确保了能够解决技术问题。（2）超速离心法得到的外泌体纯度不高，混有大量微泡和凋亡小体等，仍需蔗糖梯度离心纯化，因而不会省略该步骤。而本申请图5证实了在未采用该步骤的情况下，获得了高纯度的外泌体。（3）本申请的制备方法能够制备得到人嗅黏膜间充质干细胞外泌体，且得到的外泌体稳定、纯度高、不会损伤囊泡、能够促进人脑微血管上皮细胞的增殖和迁移。因此，权利要求1-6具备创造性。（4）对比文件1和2均未公开人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的用途，因而，权利要求7具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年05月15日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：（1）为了获得外泌体，必然要对细胞进行培养以获得生长旺盛的细胞，而本申请限定的培养过程属于细胞领域的一般的分离和培养过程。（2）对比文件1公开的并非蔗糖溶液，而是利用海藻糖溶液减少外泌体聚集，省略该步骤后，其效果相应消失。（3）本申请与对比文件1均获得了外泌体沉淀，使用了更高离心速度也未获得更好的效果，且对比文件1公开了15000-150000g的离心速度，其也没有破坏外泌体的完整性。因而坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年11月14日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1-7不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（1）权利要求1请求保护一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法。权利要求1与对比文件1相比的区别特征在于：权利要求1限定了外泌体的来源为人嗅黏膜间充质干细胞培养物，并在步骤1中具体限定了所述培养物的制备步骤；步骤2-4的离心速度不同；步骤6的PEG孵育时间以及离心速度和离心时间不同；权利要求1中将第四沉淀使用生理盐水重悬后进行超速离心，对比文件1则是用海藻糖生理盐水溶液重悬后进行超速离心，且离心力不同。权利要求1实际解决的技术问题是：如何制备获得人嗅黏膜间充质干细胞外泌体。但是，本领域技术人员根据对比文件1公开的内容有理由相信人嗅黏膜间充质干细胞作为已知的间充质干细胞也能够分泌产生外泌体，且自人嗅粘膜组织块制备获得人嗅黏膜间充质干细胞的方法是现有技术已知的，也是本领域已知的常规的动物细胞培养物的制备方法，具体培养参数、传代参数、培养代数、以融合率表示的细胞培养状态是本领域可选择的常规实验条件，或者是本领域技术人员通过常规实验可以调整确定的。本领域技术人员根据对比文件1公开的通过三次不同离心力，逐步由大到小沉淀碎片杂质以及离心力与去除杂质的大小关系，可以常规选择每步使用的离心力。本领域技术人员在对比文件1的启示下，有动机探索并确定合适PEG孵育时间以利于外泌体沉淀，并能够预期采用更高离心力和更长离心时间，也能够有效沉淀外泌体。省略海藻糖后相应效果消失，且对比文件1给出了可以使用合适的生理溶液洗涤外泌体沉淀的技术启示。因此，在对比文件1的基础上，结合本领域常规实验手段获得权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备创造性。权利要求2-6的附加技术特征或者被对比文件1公开，或者是本领域常规技术手段，因此，权利要求2-6也不具备创造性。（2）权利要求7请求保护权利要求1-6任意一项所述的制备方法制备得到的外泌体在促进人脑微血管上皮细胞增殖和/或提高人脑微血管上皮细胞迁移药物中的应用。本领域技术人员在对比文件2公开的信息以及本领域已知的大量足以证明骨髓、脐血、脂肪等多种来源的间充质干细胞外泌体均能够促进内皮细胞增殖和迁移的现有技术文献的基础上，能够预期人嗅黏膜间充质干细胞外泌体具有促进人脑微血管上皮细胞增殖和迁移的活性，从而有动机获得权利要求7请求保护的制药用途。因此，权利要求7不具备创造性。（3）对于复审请求人的意见陈述，合议组认为：对比文件1公开的制备方法具有不会损伤外泌体的囊泡且能够保证外泌体获取的量的技术效果。本领域技术人员根据本申请记载的实验数据无法得出纯度相关的结论，也无法确认所获得的外泌体的具体的量，进而也无法根据外泌体的产量来判断是否会对外泌体的囊泡造成损伤，本申请也没有记载足以证明外泌体稳定性的实验数据，没有证据表明本申请的实验条件在保持囊膜完整方面能够具有预料不到的效果。PEG分离法是通过不同的离心速度和时间将具有不同尺寸大小的囊泡和碎片等分离开，该分离方法不依赖于外泌体的来源，也不依赖于外泌体的内容物及其功能，而是依赖于外泌体以直径表示的尺寸大小。能够制备得到人嗅黏膜间充质干细胞外泌体，且得到的外泌体稳定、纯度高、不会损伤囊泡、能够促进人脑微血管上皮细胞的增殖和迁移均是可以预料到的技术效果。
复审请求人于 2019年12月16日提交了意见陈述书，但未提交修改的申请文件。复审请求人认为：本申请实际解决的技术问题是提供一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，不会损伤外泌体的囊泡，保证外泌体获取的量。（1）嗅黏膜间充质干细胞外泌体与其他间充质干细胞外泌体的生物学特性有区别，本领域技术人员无法知晓对比文件1的技术方案适用于何种尺寸大小的外泌体分离，因而无法知晓在何种范围内调整离心的重力加速度和时间等参数。（2）在已知较高的离心力会损伤囊泡的基础上，90000-110000g的离心力不是常规选择。（3）对比文件1没有记载单独生理盐水洗涤外泌体沉淀的效果与糖溶液纯化处理的效果相当或更优，本领域技术人员知晓，超速离心法得到的外泌体纯度不高，需要通过蔗糖梯度离心纯化，本领域技术人员没有动机省略该步骤。（4）本申请能够制备得到人嗅黏膜间充质干细胞外泌体，且外泌体稳定、纯度较高、不会损伤外泌体的囊泡、能够促进人脑微血管上皮细胞的增殖和提高细胞的迁移率，具有显著的进步。因此，权利要求1-7具备创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
复审请求人在提出复审请求时提交了权利要求书全文替换页（共2页7项），经审查，所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定，因此，本复审请求审查决定所针对的审查文本为：2017年12月12日申请日提交的说明书第1-11页（即第1-93段）、说明书附图第1-4页（即图1-图8）、说明书摘要、摘要附图，以及2019年05月09日提交的权利要求第1-7项。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果要求保护的发明相对于最接近的现有技术存在区别特征，而现有技术整体上给出了将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的技术启示，则发明是显而易见的，不具备创造性。
1、权利要求1请求保护一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法。对比文件1（参见说明书第38-44段）公开了：从生物样品中分离外泌体的过程，包括第一步，以去除不希望的大的细胞碎片，例如，细胞、细胞成分、凋亡小体等尺寸大于大约7-10微米的。第一步通常采用例如4℃下1000-4000×g离心10-60分钟，优选1500-2500×g，例如2000×g，可选的时间段例如10-30分钟、12-28分钟、14-24分钟、15-20分钟或16、17、18或19分钟。在去除细胞碎片后，将第一步离心获得的上清液与含碎片的沉淀物分离，任选的实施第二离心步骤，包括4℃下12,000-15,000×g离心30-90分钟，以去除中等大小碎片，例如大于6微米的碎片，将上清液与含碎片的沉淀物分离。收集上清液并任选地进行第三步离心，包括在4℃下40,000-60,000×g离心30-90分钟，以进一步去除杂质，例如尺寸大于0.3微米的中等或小型微泡，例如0.3-6微米，将上清液与含碎片的沉淀物分离。任选地过滤上清液例如0.22微米过滤，以去除碎片，例如具有0.22微米或更大尺寸的细菌或更大微泡。过滤可采用通过一个或更多相同尺寸的过滤器，例如0.22微米过滤器。或者，采用2个或更多相同或不同尺寸的过滤器过滤，例如通过一个或多个40-50微米过滤器，通过一个或多个20-30微米过滤器，通过一个或多个10-20微米过滤器，通过一个或多个0.22-10微米过滤器等。然后可以将微滤上清液（滤液）与聚乙二醇PEG溶液混合，以使外泌体在滤液中沉淀。如本领域技术人员理解的，可以使用多种PEG制剂。优选的，制剂包括平均分子量为400到20,000道尔顿（例如，1000到10,000道尔顿，例如6000道尔顿）的PEG链长。类似的，外泌体-PEG溶液可以具有不同终浓度的PEG，例如，终浓度为大约5-15%的PEG（例如8%）。优选地，将滤液与等体积的PEG溶液合并，其强度在约10-20％的PEG范围内。将PEG-滤液缓慢混合并在适于外泌体沉淀的条件下孵育，例如，4℃孵育30分钟。某些样品可能需要更长地孵育时间才发生外泌体沉淀。孵育后，通过离心将外泌体沉淀，例如4℃，10,000×g离心10分钟。在合适的糖溶液，例如海藻糖溶液中溶解沉淀，以有效减少外泌体的聚集。所述糖优选溶解在生理缓冲液如盐水或PBS中。为去除非外泌体的细胞外颗粒（例如大于140nm的颗粒），进一步任选地离心或超速离心海藻糖外泌体溶液，例如，4℃下，15,000×g-150,000g离心1小时。如果进行超速离心，外泌体在所得沉淀和上清中均有存在，通常上清中会有大量外泌体。权利要求1与对比文件1相比的区别特征在于：（1）权利要求1限定了外泌体的来源为人嗅黏膜间充质干细胞培养物，并在步骤1中具体限定了所述培养物的制备步骤；（2）步骤2-4的离心速度不同；（3）步骤6的PEG孵育时间以及离心速度和离心时间不同；（4）权利要求1中将第四沉淀使用生理盐水重悬后进行超速离心，对比文件1则是用海藻糖生理盐水溶液重悬后进行超速离心，且离心力不同。权利要求1实际解决的技术问题是：如何制备获得人嗅黏膜间充质干细胞外泌体。
对于区别特征（1），首先，对比文件1（参见说明书第34段）还公开了：外泌体可以自哺乳动物的任何合适的生物样品中分离，包括但不限于间充质干细胞等。且本领域技术人员知晓，外泌体一种能被大多数细胞分泌的微小膜性囊泡，以及多种已知的不同来源的间充质干细胞，例如骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等均能够分泌产生外泌体。在此基础上，本领域技术人员有理由相信人嗅黏膜间充质干细胞作为已知的间充质干细胞也能够分泌产生外泌体。其次，获取人嗅粘膜组织块并自组织块培养获得人嗅黏膜间充质干细胞的方法是现有技术已知的，且获取组织块、使用完全培养基培养、培养过程中及时更换培养基、使用PBS缓冲液清洗和胰酶酶解等方式传代，以获得相应细胞培养物，也是本领域已知的常规的动物细胞培养物的制备方法。再次，步骤1中的具体培养参数和传代参数是本领域可选择的常规实验条件，或者是本领域技术人员通过常规实验可以调整确定的。最后，经过传代培养获得活性较高的间充质干细胞，以利于制备外泌体是本领域的常规实验手段，具体培养代数以及以融合率表示的细胞培养状态的选择是本领域技术人员通过常规实验可以确定的。
对于区别特征（2），首先，本领域技术人员知晓，离心半径不同时，以每分钟转速rpm表示的离心参数所代表的离心力不同。由于，本申请未公开所使用的离心半径，从而导致本领域技术人员无法知晓本申请权利要求1步骤2-3实际使用的离心力。而本领域技术人员在对比文件1公开的离心力的基础上，根据实际使用的离心机的离心半径，可以常规选择合适的转速。其次，本申请步骤3中使用的离心力介于对比文件1第一步离心所用离心力和第二步离心所用离心力之间，且较为接近第二步离心所用离心力。对比文件1已经公开了，第一步离心是用于去除大于7-10μm的细胞、细胞成分、凋亡小体等碎片，第二步离心用于去除大于6μm的碎片，以及本领域技术人员知晓，差速离心是通过采用不同的离心力使培养物中的颗粒，例如碎片或其他直径的囊泡等杂质与外泌体，沉淀或不沉淀，从而分开的方法，因而，本领域技术人员通过合乎逻辑的分析和推理能够知晓，经过权利要求1步骤2-4离心后，也能够去除大于6μm的碎片和凋亡小体等。再次，本申请未采用对比文件1公开的第三步离心的离心力进行离心，其相应的能够离心去除尺寸大于0.3微米的中等或小型微泡，例如0.3-6微米的技术效果也随之消失。最后，尽管，对比文件1公开的三步离心与权利要求1的三步离心的离心力不同，但对比文件1公开了通过三次不同离心力，逐步由大到小沉淀碎片杂质，本领域技术人员在此基础上，可以根据意图去除的碎片杂质的大小，常规选择每步使用的离心力。
对于区别特征（3），首先，对比文件1已经公开了某些样品可能需要更长地孵育时间才发生外泌体沉淀。在此基础上，本领域技术人员能够通过常规的梯度实验，探索并确定合适PEG孵育时间以利于外泌体沉淀。其次，在对比文件1已经公开了10,000×g离心10分钟能够使PEG中外泌体有效沉淀的基础上，本领域技术人员能够预期采用更高离心力和更长离心时间，也能够有效沉淀外泌体。
对于区别特征（4），首先，对比文件1公开了海藻糖可减少外泌体的聚集，因而，省去该成分后，其减少聚集的效果相应除去。其次，对比文件1（参见说明书第34、48、51段）还公开了：外泌体具有约40至140nm之间的直径。对外泌体溶液超速离心以沉淀外泌体和任何残留的污染微泡（100-220nm之间）。该超速离心步骤在4℃下110,000-170,000×g进行1-3小时，例如，170,000×g离心3小时。可以使用合适的生理溶液，例如无菌0.9%盐水洗涤外泌体沉淀。在此基础上，本领域技术人员能够常规选择生理盐水重悬，并采用合适的离心力，例如90,000-110,000g，进行洗涤，并预期可以获得外泌体沉淀。
综上，在对比文件1的基础上，结合本领域常规实验手段获得权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2、权利要求2-4分别是对第一、第二、第三离心分离的温度和时间的进一步限定。首先，如针对权利要求1的评述中所述，对比文件1公开了4℃下离心；其次，如针对权利要求1的评述中所述，对比文件1公开了使用12,000-15,000×g离心时，离心时间为30-90分钟。在此基础上，本领域技术人员可以常规选择离心时间为50-70min，并能够预期其可以去除大于6μm的碎片和凋亡小体等；最后，离心效果由离心力和离心时间共同决定，本领域技术人员可以根据离心效果常规调整确定第一、第二离心的离心时间。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2-4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、权利要求5-6分别是对步骤5、6的进一步限定。首先，如针对权利要求1的评述中所述，对比文件1公开了可以使用0.22μm的滤膜过滤；其次，如针对权利要求1的评述中所述，对比文件1公开了与等体积的PEG溶液合并（即1:1），其强度在约10-20％的PEG范围内；可见，权利要求5-6的附加技术特征已经被对比文件1公开，因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求5-6也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
4、权利要求7请求保护权利要求1-6任意一项所述的制备方法制备得到的外泌体在促进人脑微血管上皮细胞增殖和/或提高人脑微血管上皮细胞迁移药物中的应用。首先，对比文件2（参见第145页左栏第1段-第146页左栏第2段、第146页右栏第4段）公开了：间充质干细胞可来源于多种组织，如骨髓、脂肪、脐带等。MSCs及其上清液可促进损伤器官修复，因而将研究聚焦到旁分泌机制上，例如外泌体。目前认为外泌体可以促进组织血管新生、促进细胞增殖等，换言之，间充质干细胞来源的外泌体不仅具备了MSCs移植疗效，而且降低了移植风险。对于心血管系统，提出了MSCs通过旁分泌方式（如分泌外泌体）促进损伤组织修复的新设想，并提出了人脐带间充质干细胞外泌体具有明显的促进内皮细胞迁移、促进血管新生作用。在心血管领域及癌症研究领域中发现，MSCs来源外泌体对内皮细胞具有强大的促迁移、促血管新生作用。其次，本领域技术人员知晓，存在大量现有技术文献足以证明骨髓、脐血、脂肪等多种来源的间充质干细胞外泌体均能够促进内皮细胞增殖和迁移。最后，人脑微血管上皮细胞属于已知的血管内皮细胞。在此基础上，本领域技术人员能够预期人嗅黏膜间充质干细胞外泌体具有促进人脑微血管上皮细胞增殖和迁移的活性，从而有动机将其用于该制药用途。因此，结合针对权利要求1-6请求保护的外泌体不具备创造性的评述，在对比文件1的基础上，结合对比文件2和本领域常规实验手段获得权利要求7请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求7不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）关于复审请求人的意见陈述
对于复审请求人的意见陈述，合议组认为：（1）首先，对比文件1第34和52段公开了外泌体具有约40至140nm之间的直径，外泌体可以自间充质干细胞等分离，杂质具有小于20nm且或大于140nm的直径。尽管，本领域技术人员未能知晓嗅黏膜间充质干细胞外泌体的具体的粒径峰值，但本领域技术人员基于对比文件1公开的信息能够预期嗅黏膜间充质干细胞作为间充质干细胞的一种，其外泌体的直径也处于约40-140nm的区段范围内，从而能够被对比文件1的方法分离。实际上，本申请说明书实施例2的实验数据也表明了嗅黏膜间充质干细胞外泌体的直径大小与对比文件1公开的外泌体的直径大小范围是近似的，并未超出本领域技术人员预期的范围。即，对比文件1公开了其技术方案适用于何种尺寸大小的外泌体分离，且本领域技术人员也能够预期对比文件1公开的技术方案可以分离嗅黏膜间充质干细胞的外泌体。其次，本申请采用了对比文件1公开的依次沉淀不同大小的杂质的三步离心的技术方案，但调整了离心加速度，其达到的效果仅仅是分步去除了大于6μm的杂质碎片，但无法去除对比文件1公开的技术方案中可以去除的尺寸大于0.3微米的杂质，而上述效果是本领域技术人员根据对比文件1公开的离心加速度与去除杂质大小的关系可以预期的。且对比文件1和本申请在三步离心后都进行了过滤从而去除了0.22μm以上的杂质，没有证据表明过滤前离心参数的调整能够使得请求保护的技术方案能够具有预料不到的技术效果。最后，本申请步骤6的第四步离心（即PEG离心）时采用的重力加速度为90,000-110,000g，而对比文件1为10,000g，但增大重力加速度仍然能够沉淀40至140nm之间的直径的外泌体，其效果是可以预期的。（2）本申请仅记载了通过透射电镜、NTA、Western blot对外泌体进行鉴定，本领域技术人员根据上述实验数据无法确定所获得的外泌体中具有完整囊膜的外泌体的数量和/或占比，因而没有证据表明采用本申请的90,000-110,000×g的离心力，相对于对比文件1公开的10,000×g的离心力，在保持囊膜完整方面，能够具有改善或近似的效果。本领域技术人员有理由相信，相对于低离心力，本申请的高离心力在囊膜完整性方面造成了不良影响，在此情况下，本领域技术人员选择更高离心力仅仅是常规选择，其效果是可以预料到的。（3）首先，如针对权利要求1的评述中所述，对比文件1给出了可以使用生理盐水洗涤外泌体沉淀的技术启示。其次，对比文件1公开的PEG离心法是本申请的最接近的现有技术，而非超速离心法，PEG离心法中没有使用蔗糖梯度离心纯化，蔗糖梯度离心纯化不是本申请与对比文件1的区别特征，本申请相对于对比文件1省略了海藻糖，其减少聚集的效果也相应消失。（4）首先，对比文件1（参见说明书第34、52-54段）还公开了：外泌体具有约40至140nm之间的直径，包括在其他囊泡中不存在的特定表面标记，例如CD63和CD81等。该方法产生高纯度的外泌体。优选地，外泌体基本上不含具有直径小于20nm或大于140nm的细胞碎片、凋亡小体和微囊，且是生物学上完整，例如不结块或成团块，没有被剪切、渗漏或其他损坏。本发明方法分离的外泌体表现出一定程度的稳定性。此外，通过本分离方法可获得大量的外泌体，使用基于PEG的方法，1mL血清可产生约5-10mg的蛋白质。因此，由于本发明方法的高外泌体产量，可以容易地制备以至少5μg/μL，优选至少约10-25mg/μL的浓度包含外泌体的溶液。根据本文所述的方法分离的外泌体，有益地保持完整性，并显示出纯度（“基本上不含”直径小于20nm且或大于140nm的不期望的实体），稳定性和体内体外的生物学活性。由此可见，对比文件1公开的制备方法具有不会损伤外泌体的囊泡、能够保证外泌体获取的量、获得稳定的外泌体的技术效果。其次，本领域技术人员在存在大量现有技术文献足以证明多种不同来源的间充质干细胞均能够分泌产生外泌体，以及不同来源的间充质干细胞外泌体均能够诱导血管内皮细胞增殖和迁移的基础上，能够通过合乎逻辑的分析和推理能够预期人嗅黏膜来源的间充质干细胞也能够产生外泌体，且外泌体能够诱导人脑微血管内皮细胞增殖和迁移。最后，本申请仅记载了通过透射电镜、NTA、Western blot对外泌体进行鉴定，一方面，本领域技术人员知晓，许多蛋白聚集体、脂蛋白甚至乳糜颗粒等杂质粒径也集中在30-200nm区间，Nanosight设备通常需要比较散射光模式和荧光模式下粒径-浓度分布，从而鉴定外泌体的纯度。因而，本领域技术人员仅根据图5记载的曲线无法得出纯度相关的结论。另一方面，本领域技术人员根据本申请提供的实验数据无法确认所获得的外泌体的具体的量，进而也无法根据外泌体的产量来判断是否会对外泌体的囊泡造成损伤，电镜照片也仅仅反映了电镜视野下外泌体的囊膜状态，无法证明是否具有完整囊膜的外泌体的数量和/或占比。此外，本申请也没有记载足以证明外泌体稳定性的实验数据，例如ζ电势等。因此，能够制备得到人嗅黏膜间充质干细胞外泌体，且外泌体稳定、纯度较高、不会损伤外泌体的囊泡、能够促进人脑微血管上皮细胞的增殖和提高细胞的迁移率是可以预期的技术效果，没有证据表明本申请在上述方面具有预料不到的技术效果。因此，复审请求人意见陈述的理由不成立，权利要求1-7仍然不具备创造性。
根据上述事实和理由，本案合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2019年04月04日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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