发明创造名称：一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒及其用途
外观设计名称：
决定号：198227
决定日：2019-12-23
委内编号：1F231025
优先权日：
申请（专利）号：201510292164.0
申请日：2015-06-01
复审请求人：上海凯创生物技术有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：孙雪婷
合议组组长：尉小霞
参审员：张小丽
国际分类号：G01N33/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：如果一项权利要求请求保护的技术方案与作为最接近现有技术的对比文件所公开的技术方案相比存在区别技术特征，但是该区别技术特征属于本领域的公知常识，那么，本领域技术人员在作为最接近的现有技术的对比文件的基础上结合本领域的公知常识得到该权利要求请求保护的技术方案是显而易见的，该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及名称为“一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒及其用途”的发明专利申请（下称本申请），其申请号为201510292164.0，申请日为2015年06月01日，公开日为2015年08月26日，申请人为“上海凯创生物技术有限公司”。
经实质审查，国家知识产权局专利实质审查部门于2017年03月15日发出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：权利要求1-11不具备专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定所针对的审查文本是：申请日2015年06月01日提交的说明书第1-7页、说明书摘要；2016年12月14日提交的权利要求第1-11项。
驳回决定中引用的对比文件如下：
对比文件1：CN 102023211A，公开日为2011年04月20日。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗C反应蛋白单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫荧光探针为抗C反应蛋白单克隆抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒，
所述C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合；
2)将含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6中的一种或多种的组合；
3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒；
所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体可以为相同的抗C反应蛋白单克隆抗体，也可以为不同的抗C反应蛋白单克隆抗体。
3. 如权利要求1-2任一权利要求所述的C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合；
2)将含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合；
3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、 样品垫、吸水纸及背板组装制备成C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，步骤1制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml。
5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述步骤1中，缓冲液为PBS缓冲液。
6. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述步骤1中，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1。
7. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述封闭液为乙醇胺。
8. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；
9. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml；
10. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为0.9-1.1ul/cm；
11. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。”
驳回决定的具体理由是：1、权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1的区别技术特征为：（1）权利要求1中使用的乳胶微球颗粒为近红外荧光，直径为140-160nm，而对比文件1没有具体限定用于标记的胶乳微粒荧光类型及其直径；（2）权利要求1中在试剂盒的制备过程中使用含有冠醚的探针溶液对玻璃纤维薄膜进行处理，使用含有冠醚的抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液对硝酸纤维素膜进行处理；（3）权利要求1中还包括了封闭液的使用以及将所制备的试纸制备成试剂盒。对于区别技术特征（1），本领域技术人员可根据检测需要选择适宜的荧光类型使其适于近红外检测，使用近红外荧光分子作为标记也是常规技术手段，至于微球颗粒的直径也是可以根据实验需要进行选择的；对于区别技术特征（2），使用冠醚应用于荧光分子探针用于金属离子络合是本领域的公知常识（参见《大学化学实验：化学创新实验》，张四方主编，第104页，北京：中国石化出版社, 2012年5月第一版），本领域技术人员可以依据具体所得溶液的离子状况，添加一种或多种冠醚，以提高检测准确性；对于区别技术特征（3），在抗体向固相载体上偶联时加入适当的封闭剂，以及将试纸条打包制备成试剂盒以提供检测的便利性，是常规技术手段。因此，权利要求1相比于对比文件1和本领域公知常识的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、从属权利要求2的附加技术特征或被对比文件1公开、或属于本领域的公知常识，所以，当引用的权利要求不具备创造性时，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。3、权利要求3请求保护的技术方案与对比文件1相比，区别技术特征还在于：封闭液和冠醚的使用，并将制备的试纸条制成试剂盒，由于权利要求1、2所述的试剂盒不具备创造性，而且对于制备过程中封闭液和冠醚的使用，以及将试纸条包装制成试剂盒，均属于本领域的常规技术手段，因此，权利要求3相比于对比文件1和本领域公知常识的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。4、从属权利要求4-11的附加技术特征属于本领域的公知常识，所以，当引用的权利要求不具备创造性时，权利要求4-11也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人（下称复审请求人）对该驳回决定不服，于2017年06月23日向国家知识产权局提出了复审请求，并提交了权利要求书的全文修改替换页，所作修改为：向独立权利要求1、3中加入了从属权利要求4-9、11的附加技术特征，删除了从属权利要求4-9、11，并适应性修改了权利要求的编号。
提复审请求时修改的权利要求书如下：
“1. 一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗C反应蛋白单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫荧光探针为抗C反应蛋白单克隆抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒，
所述C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合；
2)将含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6中的一种或多种的组合；
3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒；
所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm；
所述步骤1)中，步骤1)制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；
所述步骤1)中，缓冲液为PBS缓冲液；
所述步骤1)中，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1；
所述步骤1)中，所述封闭液为乙醇胺；
所述步骤1)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；
所述步骤1)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml；
所述步骤2)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体可以为相同的抗C反应蛋白单克隆抗体，也可以为不同的抗C反应蛋白单克隆抗体。
3. 如权利要求1-2任一权利要求所述的C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括 如下步骤：
1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合；
2)将含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合；
3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒；
所述步骤1)中，步骤1)制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；
所述步骤1)中，缓冲液为PBS缓冲液；
所述步骤1)中，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1；
所述步骤1)中，所述封闭液为乙醇胺；
所述步骤1)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；
所述步骤1)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml；
所述步骤2)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为0.9-1.1ul/cm。”
复审请求人提出的表明本申请具备创造性的理由为：与对比文件1相比，权利要求1的主要区别技术特征在于：在试剂盒的制备过程中，使用含有冠醚的探针溶液对玻璃纤维薄膜进行处理，使用含有冠醚的抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液对硝酸纤维素膜进行处理。对比文件1全文中并没有任何关于冠醚的内容，更没有关于使用冠醚对玻璃纤维薄膜和硝酸纤维素膜进行处理，从而使得试剂盒的灵敏度和显色效果获得显著提升的相关记载和启示。虽然《大学化学实验：化学创新实验》的现有技术中提及了冠醚，但是这些文献中普遍是将冠醚作为金属离子络合剂使用，从而消除检测中的干扰。而本申请所提供的试剂盒体系中使用冠醚的原理与现有技术并不相同。本申请使用包括冠醚的缓冲液对玻璃纤维薄膜和硝酸纤维素膜进行处理，从而使得C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的灵敏度大幅提高，最低检出限≤1.0pg/ml，相对于现有技术中普通试剂盒的0.1mg/L的最低检测限提升了数个数量级，具备预料不到的技术效果，并且在2-1000pg/ml的范围具有良好的线性，且具有良好的特异性、重复性和稳定性，具有显著的进步。
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年09月04日依法受理了上述复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年06月11日向复审请求人发出复审通知书，指出：1、权利要求1中记载了：“所述步骤1)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；所述步骤1)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml”，然而，上述特征既未明确地记载在原说明书和权利要求书中，也不能由原说明书和权利要求书所记载的内容直接地、毫无疑义地确定，即修改超出了原说明书和权利要求书记载的范围，不符合专利法第33条的规定。2、基于与权利要求1同样的理由，权利要求3的修改也超出了原说明书和权利要求书记载的范围，不符合专利法第33条的规定。3、假设复审请求人将权利要求1、3中的特征“所述步骤1)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；所述步骤1)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml”修改为“所述步骤2)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；所述步骤2)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml”，构成新的权利要求1’、3’以及它们的从属权利要求2’、从属权利要求4’，它们也不符合专利法第22条第3款规定的创造性，理由如下：（1）权利要求1’请求保护的技术方案与对比文件1的区别技术特征为：①荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm，步骤1）中在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体，加入EDCA使抗体与颗粒偶联，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，封闭液为乙醇胺；步骤1）、2）中缓冲溶液均为PBS缓冲液；步骤4）组装制备成试剂盒；②步骤1）中制备探针溶液时加入冠醚，选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合，制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；步骤2）中含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，选自二环已基-18-冠-6中的一种或多种的组合，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml。对于区别技术特征①，本领域技术人员能够根据实际需要对荧光乳胶微球颗粒的直径进行选择与优化；先进行离心清洗并分散，然后在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA属于常规操作顺序，EDCA为常用的偶联剂；本领域技术人员通过有限的试验可以获得乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的合适的重量比；加入乙醇胺封闭乳胶颗粒上多余的基团，避免抗体与非特异性抗原结合，为常用技术手段；PBS缓冲液为缓冲液的常规选择；将试纸条打包制备成试剂盒以提供检测的便利性，属于常用技术手段；对于区别技术特征②，冠醚是本领域的公知的金属络合剂（参见《大学化学实验：化学创新实验》，张四方主编，第104页，北京：中国石化出版社, 2012年5月第一版），将其应用于荧光分子探针的制备，减少金属离子对检测的干扰，是常用技术手段，二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6均为常见的冠醚，选择它们之中的一种或多种加入到探针溶液、选择二环已基-18-冠-6加入到含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液均属于常规选择，使得制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml、含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度是通过有限的试验对冠醚的浓度进行优化就能够获得的，其技术效果也是可以预期的。所以，权利要求1’相比于对比文件1和本领域公知常识的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（2）从属权利要求2’的附加技术特征或被对比文件1公开，或属于公知常识，所以，当引用的权利要求1’不具备创造性时，权利要求2’不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（3）权利要求3’请求保护的技术方案与对比文件1的区别技术特征包括：(i)步骤1）中，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体，加入EDCA使抗体与颗粒偶联，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，封闭液为乙醇胺；步骤1）、2）中缓冲溶液均为PBS缓冲液；步骤4）组装制备成试剂盒；(ii)步骤1）中制备探针溶液时加入冠醚，选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合，制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；步骤2）中含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml。对于区别技术特征(i)，先进行离心清洗并分散，然后在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA属于常规的操作顺序，EDCA属于常用的偶联剂；本领域技术人员通过有限的试验可以获得乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的合适的重量比；加入乙醇胺封闭乳胶颗粒上多余的基团，避免抗体与非特异性抗原结合，属于常用技术手段；PBS缓冲液为缓冲液的常规选择；将试纸条打包制备成试剂盒以提供检测的便利性，属于本领域的常用技术手段；对于区别技术特征(ii)，冠醚是本领域的公知的金属络合剂，将其应用于荧光分子探针的制备，减少金属离子对检测的干扰，是常用技术手段，二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6均为常见的冠醚，选择它们之中的一种或多种加入到探针溶液、或加入到含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液均属于常规选择，使得制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml、含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml，是本领域技术人员通过有限的试验对冠醚的浓度进行优化就能够获得的，其技术效果也是可以预期的。所以，当引用的权利要求1’、2’不具备创造性时，权利要求3’相比于对比文件1和本领域公知常识的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（4）从属权利要求4’的附加技术特征属于常规选择，所以，当引用的权利要求3’不具备创造性时，权利要求4’也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。4、针对复审请求人的意见陈述进行了回应。
针对上述复审通知书，复审请求人于2019年07月26日提交了意见陈述书以及权利要求书的全文修改替换页，所作修改为：将权利要求1、3中的特征“所述步骤1)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；所述步骤1)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml”修改为“所述步骤2)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；所述步骤2)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml”，将权利要求2中的并列的附加技术特征之一“所述硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体为不同的抗C反应蛋白单克隆抗体”添加到权利要求1中，删除了权利要求2，并适应性修改了权利要求的编号和引用关系。
修改后的权利要求书如下：
“1. 一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗C反应蛋白单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸，所述免疫荧光探针为抗C反应蛋白单克隆抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒，
所述C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合；
2)将含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6中的一种或多种的组合；
3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒；
所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm；
所述步骤1)中，步骤1)制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；
所述步骤1)中，缓冲液为PBS缓冲液；
所述步骤1)中，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1；
所述步骤1)中，所述封闭液为乙醇胺；
所述步骤2)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；
所述步骤2)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml；
所述步骤2)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液；
所述硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体为不同的抗C反应蛋白单克隆抗体。
2. 如权利要求1所述的C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中 加入抗C反应蛋白单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合；
2)将含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合；
3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；
4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒；
所述步骤1)中，步骤1)制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；
所述步骤1)中，缓冲液为PBS缓冲液；
所述步骤1)中，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1；
所述步骤1)中，所述封闭液为乙醇胺；
所述步骤2)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；
所述步骤2)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml；
所述步骤2)中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。
3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为0.9-1.1ul/cm。”
复审请求人提出的表明本申请具备创造性的理由为：虽然对比文件1所公开的检测试剂盒声称其检测灵敏度可达pg/ml级别，但是其主要是关注了试剂盒的灵敏度、重复性、准确性的性能，对比文件1没有公开试剂盒在长期保存以后是否依然还能具有良好的性能。而且，本领域技术人员公知的是，乳胶微球荧光试剂盒中乳胶微球往往会存在稳定性的问题，在长期保存或者运输以后，荧光乳胶微球试剂盒的性能会明显变差。然而，本申请使用包括冠醚的缓冲液对玻璃纤维薄膜和硝酸纤维素膜进行处理，从而使得C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的灵敏度大幅提高，最低检出限≤1.0pg/ml，并在2-1000pg/ml的范围具有良好的线性，且具有良好的特异性、重复性和稳定性，在可保存的期限内，试剂盒可达到1.0pg/ml的检测灵敏度，这一技术效果是本申请的发明人在经过大量实验后意外发现的，本领域技术人员在现有技术的基础上，根本不可能预见到在C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒反应体系中加入冠醚以实现上述效果，该技术效果是预料不到的；虽然例如《大学化学实验：化学创新实验》的现有技术中提及了冠醚，但是这些文献中仅公开了冠醚作为金属离子络合剂的作用，主要是用于消除检测中的干扰，排除检测中的假阳性，并不可能简单地认为一个可以提升试剂盒抗干扰性能的物质还可以用于提升试剂盒的灵敏、稳定性等其他性能。本申请中冠醚所起的技术效果在对比文件1或其他现有技术中完全没有被揭示，关于冠醚在C反应担保试剂盒中的作用是本申请发明人根据实验数据推测的。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以依法作出复审决定。
二、决定的理由
1．审查文本
复审请求人于2019年07月26日答复复审通知书时提交了权利要求书的全文修改替换页。将复审通知书所指出的权利要求1、3中超范围的技术特征“所述步骤1)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；所述步骤1)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml”修改为“所述步骤2)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；所述步骤2)中，所述含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml”，修改后的上述特征记载于原权利要求6以及说明书的发明内容部分（见说明书第4页第9-12行）；复审请求人还将权利要求2的并列的附加技术特征之一“所述硝酸纤维素膜上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗C反应蛋白单克隆抗体为不同的抗C反应蛋白单克隆抗体”添加到权利要求1中，修改后的该特征记载于原权利要求2以及说明书的发明内容部分（见说明书第2页最后一行-第3页第1行）。所以，修改后权利要求1、3的技术方案明确地记载在原说明书和权利要求书中，所作修改符合专利法第33条的规定。因此，本复审请求审查决定所针对的审查文本为：申请日2015年06月01日提交的说明书第1-7页、说明书摘要；2019年07月26日提交的权利要求第1-3项。
2．关于专利法第22 条第3 款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果一项权利要求请求保护的技术方案与作为最接近现有技术的对比文件所公开的技术方案相比存在区别技术特征，但是该区别技术特征属于本领域的公知常识，那么，本领域技术人员在作为最接近的现有技术的对比文件的基础上结合本领域的公知常识得到该权利要求请求保护的技术方案是显而易见的，该权利要求不具备创造性。
具体到本案：
（1）权利要求1请求保护一种C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒。对比文件1（参见说明书第[0009]-[0062]段）公开了一全程定量检测C反应蛋白的免疫层析试纸条，由样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成；所述标记垫材质为玻璃纤维素膜，其上包含有荧光胶乳微粒标记的CRP单克隆抗体，荧光乳胶微粒受激发后发射的波长为180nm～800nm（800nm为近红外，故为近红外荧光乳胶微球颗粒）；包被膜材质为硝酸纤维素膜，其上包被有CRP单克隆抗体；
试纸条的制备包括如下步骤：
1）荧光胶乳的共价活化：超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1.0×1012～1.0×1013/ml，10000～15000xg离心10分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水或者50～200mM pH6.0～7.0磷酸钠溶液溶解，并超声波200W处理30秒；先加入10～100μl的20～100mg/ml碳二亚胺，混匀，再加入10～100μl的20～100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀（碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺也用于使抗体和颗粒偶联）；室温孵育20-40分钟后10000～15000xg、离心5～15分钟，沉淀用20～100mM、pH5.0～6.0的柠檬酸缓冲液溶解，放置于2～8℃条件下备用；
2)荧光胶乳微粒标记蛋白的制备：将上述活化后的荧光胶乳超声波200W处理30秒后，按照1～125μg蛋白/100μl荧光胶乳的比例加入CRP抗体和兔IgG，Votex混匀后室温搅拌反应1.5-3小时，离心洗涤2-4次（即用柠檬酸缓冲溶液离心清洗），每次10000～15000xg、离心5～15分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波100W处理30秒（即分散），用PBS-TBN恢复离心前体积调节至浓度为0.5～2mg/ml（即制备获得探针溶液），按0.4～1.0μg/cm2的用量涂覆在标记垫上（即浸润玻璃纤维薄膜）；
3)CRP抗体包被到包被膜：将另一种CRP单克隆抗体和抗兔IgG用包被缓冲液调节至浓度为0.5～2mg/ml（与含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度范围1.8-2.2mg/ml重叠），将CRP单克隆抗体喷到包被膜上的检测区，将抗兔IgG和抗人IgG喷到包被膜上的质控区，CRP单克隆抗体、抗兔IgG和抗人IgG的用量按膜包被液量均为20μl/27-35cm，检测区和质控区间隔3-8mm，在湿度＜30％的室温下凉干12-24小时，封袋，备用；
4)在底板上依次相互搭接地粘贴样品垫1、标记垫2、包被膜3和吸水纸4得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条；
其中，荧光乳胶微粒的直径为0.1μm～1μm；
标记垫上与包被膜上包被的是处于不同表位的CRP单克隆抗体（参见说明书第[0014]段）。
权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1的区别技术特征为：①荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm，步骤1）中在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体，加入EDCA使抗体与颗粒偶联，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，封闭液为乙醇胺；步骤1）、2）中缓冲溶液均为PBS缓冲液；步骤4）组装制备成试剂盒；②步骤1）中制备探针溶液时加入冠醚，选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合，制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；步骤2）中含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，选自二环已基-18-冠-6中的一种或多种的组合，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml。
对于区别技术特征①，本领域技术人员能够根据实际需要对荧光乳胶微球颗粒的直径进行选择与优化，140-160nm属于本领域的常规选择；先进行离心清洗并分散，然后在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA属于常规的操作顺序，EDCA属于常用的偶联剂；本领域技术人员通过有限的试验可以获得乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的合适的重量比，9-11：0.9-1.1：0.9-1.1属于常规选择；加入乙醇胺封闭乳胶颗粒上多余的基团，避免抗体与非特异性抗原结合，属于常用技术手段；PBS缓冲液为缓冲液的常规选择；将试纸条打包制备成试剂盒以提供检测的便利性，属于本领域的常用技术手段。
对于区别技术特征②，冠醚是本领域的公知的金属络合剂（参见《大学化学实验：化学创新实验》，张四方主编，第104页，北京：中国石化出版社, 2012年5月第一版），将其应用于荧光分子探针的制备，从而减少金属离子对检测的干扰，是本领域的常用技术手段，二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6均为常见的冠醚，选择它们之中的一种或多种加入到探针溶液、选择二环已基-18-冠-6加入到含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液均属于常规选择，使得制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml、含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml，是本领域技术人员通过有限的试验对冠醚的浓度进行优化就能够获得的，其技术效果也是可以预期的。
所以，在对比文件1的基础上结合本领域的公知常识得到权利要求1请求保护的技术方案对于本领域技术人员是显而易见的，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
（2）权利要求2请求保护如权利要求1所述的C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的制备方法。如上所述，权利要求1所述的C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒均不具备专利法第22条第3款规定的创造性，对比文件1还公开了试纸条的制备包括如下步骤（参见说明书第[0009]-[0062]段）：
1）荧光胶乳的共价活化：超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1.0×1012～1.0×1013/ml，10000～15000xg离心10分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水或者50～200mM pH6.0～7.0磷酸钠溶液溶解，并超声波200W处理30秒；先加入10～100μl的20～100mg/ml碳二亚胺，混匀，再加入10～100μl的20～100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀（碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺也用于使抗体和颗粒偶联）；室温孵育20-40分钟后10000～15000xg、离心5～15分钟，沉淀用20～100mM、pH5.0～6.0的柠檬酸缓冲液溶解，放置于2～8℃条件下备用；
2)荧光胶乳微粒标记蛋白的制备：将上述活化后的荧光胶乳超声波200W处理30秒后，按照1～125μg蛋白/100μl荧光胶乳的比例加入CRP抗体和兔IgG，Votex混匀后室温搅拌反应1.5-3小时，离心洗涤2-4次（即用柠檬酸缓冲溶液离心清洗），每次10000～15000xg、离心5～15分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波100W处理30秒（即分散），用PBS-TBN恢复离心前体积调节至浓度为0.5～2mg/ml（即制备获得探针溶液），按0.4～1.0μg/cm2的用量涂覆在标记垫上（即浸润玻璃纤维薄膜）；
3)CRP抗体包被到包被膜：将另一种CRP单克隆抗体和抗兔IgG用包被缓冲液调节至浓度为0.5～2mg/ml（与含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中抗C反应蛋白单克隆抗体的浓度范围1.8-2.2mg/ml重叠），将CRP单克隆抗体喷到包被膜上的检测区，将抗兔IgG和抗人IgG喷到包被膜上的质控区，CRP单克隆抗体、抗兔IgG和抗人IgG的用量按膜包被液量均为20μl/27-35cm，检测区和质控区间隔3-8mm，在湿度＜30％的室温下凉干12-24小时，封袋，备用；
4)在底板上依次相互搭接地粘贴样品垫1、标记垫2、包被膜3和吸水纸4得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。
权利要求2请求保护的技术方案与对比文件1的区别技术特征还包括：(i)步骤1）中，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体，加入EDCA使抗体与颗粒偶联，乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，封闭液为乙醇胺；步骤1）、2）中缓冲溶液均为PBS缓冲液；步骤4）组装制备成试剂盒；(ⅱ)步骤1）中制备探针溶液时加入冠醚，选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合，制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml；步骤2）中含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合，含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml。
对于区别技术特征(i)，先进行离心清洗并分散，然后在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA属于常规的操作顺序，EDCA属于常用的偶联剂；本领域技术人员通过有限的试验可以获得乳胶颗粒、抗C反应蛋白单克隆抗体、EDCA的合适的重量比，9-11：0.9-1.1：0.9-1.1属于常规选择；加入乙醇胺封闭乳胶颗粒上多余的基团，避免抗体与非特异性抗原结合，属于常用技术手段；PBS缓冲液为缓冲液的常规选择；将试纸条打包制备成试剂盒以提供检测的便利性，属于本领域的常用技术手段。
对于区别技术特征(ⅱ)，冠醚是本领域的公知的金属络合剂（参见《大学化学实验：化学创新实验》，张四方主编，第104页，北京：中国石化出版社, 2012年5月第一版），将其应用于荧光分子探针的制备，从而减少金属离子对检测的干扰，是本领域的常用技术手段，二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6均为常见的冠醚，选择它们之中的一种或多种加入到探针溶液、或加入到含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液均属于常规选择，使得制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml、含有抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml，是本领域技术人员通过有限的试验对冠醚的浓度进行优化就能够获得的，其技术效果也是可以预期的。
所以，在对比文件1的基础上结合本领域的公知常识得到权利要求2请求保护的技术方案对于本领域技术人员是显而易见的，权利要求2不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
（3）权利要求3引用了权利要求2。然而，本领域技术人员能够根据抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液的浓度通过有限的试验对喷加量进行优化，0.9-1.1ul/cm的喷加量属于常规选择。所以，当引用的权利要求2不具备创造性时，权利要求3也不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
4、针对复审请求人的陈述意见的答复
针对复审请求人提出的表明本申请具备创造性的理由，合议组认为：复审请求人声称本申请通过使用包括冠醚的缓冲液对玻璃纤维薄膜和硝酸纤维素膜进行处理，能够获得使C反应蛋白近红外荧光检测试剂盒的灵敏度大幅提高，最低检出限≤1.0pg/ml，在2-1000pg/ml的范围具有良好的线性，且具有良好的特异性、重复性和稳定性，在可保存的期限内，试剂盒可达到1.0pg/ml的检测灵敏度的技术效果，然而原说明书中并未记载上述技术效果是由于使用了包括冠醚的缓冲液对玻璃纤维薄膜和硝酸纤维素膜进行处理所获得的，也未记载使用冠醚的原理，并且原说明书中缺少证明由于冠醚的加入能够带来上述技术效果的对比实验及实验数据。对比文件1（参见说明书第[0031]段）中所公开的C反应蛋白免疫层析试纸条的检测灵敏度可达到与本申请相同的皮克级别，且有全面的线性范围，而使试纸条具有良好的特异性、重复性、并在保存期限内依然具有良好的性能是本领域的普遍追求，本领域技术人员有动机通过有限的试验进行优化从而使试纸条还具备上述性能，所获得的技术效果是可以预期的。由于冠醚是公知的金属络合剂，本领域技术人员容易想到使用含有冠醚的探针溶液对玻璃纤维薄膜进行处理，使用含有冠醚的抗C反应蛋白单克隆抗体的缓冲溶液对硝酸纤维素膜进行处理，从而减少金属离子对检测的干扰，属于常用技术手段。
因此，合议组对复审请求人的上述理由不予支持。
根据上述事实和理由，本案合议组依法作出以下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年03月15日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41 条第2 款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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