发明创造名称：一种新的CMV、PVY快速检测方法
外观设计名称：
决定号：200291
决定日：2019-12-17
委内编号：1F272181
优先权日：
申请（专利）号：201610437167.3
申请日：2016-06-20
复审请求人：贵州省烟草科学研究院
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：姚宇鹯
合议组组长：石艳丽
参审员：殷华宇
国际分类号：G01N33/569;G01N33/543
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求请求保护的技术方案与作为最接近的现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，而这些区别技术特征部分被其他对比文件公开，且该其他对比文件给出了将该部分区别技术特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，其余区别技术特征属于本领域的常用技术手段，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610437167.3、名称为“一种新的CMV、PVY快速检测方法”的发明专利申请（下称本申请），本申请的申请日为2016年06月20日，公开日为2016年11月16日，申请人为贵州省烟草科学研究院。
国家知识产权局专利实质审查部门以本申请权利要求1-4不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由，于2018年10月10日驳回了本申请。驳回决定中引用的对比文件如下：
对比文件1：郑世玲。贵州3种马铃薯病毒的DAS-ELISA检测及分子鉴定。《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》，公开日期为2007年10月15日；
对比文件2：青玲 等。重庆南瓜病毒病病原ELISA检测及CMV变异分析。《园艺学报》，第37卷第3期，第405-412页，公开日期为2010年03月25日；
对比文件3：贾蒙骜 等。基于环式等温扩增的烟草青枯病病原菌快速检测方法。《中国农业大学学报》，第19卷第1期，第93-98页，公开日期为2014年02月15日。
驳回决定所针对的文本为：2018年09月12日提交的权利要求第1-4项，申请日2016年06月20日提交的说明书第1-6页，说明书附图第1-4页，说明书摘要及摘要附图。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种新的CMV、PVY快速检测方法，其特征在于：包含以下步骤：
抗体包被：PCR管使用2%-5%戊二醛和HCl处理，之后分别使用ddH2O和碳酸包被缓冲液冲洗，使用包被缓冲液以1:200的比例稀释抗体，取稀释后的抗体加入处理好的PCR管，2-8℃孵育过夜，之后以PBST清洗备用；
CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增引物的设计；
免疫捕获-环式等温扩增检测，样品匀浆：取0.1-0.2g发病样品，以1:10的比例加入抽提缓冲液，然后研磨匀浆，离心取上清液；
免疫捕获-环式等温扩增反应过程：将烟草叶片匀浆液加入抗体包被的PCR管中，37℃孵育1-3h，孵育结束后倒掉匀浆液，然后用无菌水冲洗，在PCR管中加入无菌水，在80℃金属浴中变性5-10min，然后迅速转移至冰上，然后按照反转录酶产品说明书加入包括反转录酶的反转录试剂和CMV 和PVY特异反转录引物，定容体积至100μl，转录反应45min至1h，然后吸出5-20μl反转录产物作为等温扩增反应底物，补充等温扩增试剂和无菌水至25μl体系，个反应在60-65℃条件下进行60-90min；步骤（1）中所述的引物为：
引物名称
靶标
引物序列
F3 outer primer
CMV
TGATTCTACCGTGTGGGTG
B3 outer primer
CMV
CGGCGTACTTTCTCATGTC
FIP inner primer
CMV
GCGAACATAGCAGAGATGGCG_GACAGTCCGCAAAGTTCCTG
BIP inner primer
CMV
CAGTATGCAGCATCCGGAGTC_CCGCATCGCCGAAAGATCA
F3 outer primer
PVY
CGAAATCTGCGGGATGTGG
B3 outer primer
PVY
AGACATCCTCGGTGGTGT
FIP inner primer
PVY
TCCCTAGCCCTCACTGGTGTTC_TTAGCGCGTTATGCCTTTGA
BIP inner primer
PVY
GCAGCATTGAAATCAGCCCAA_GCCTCTCTGTGTTCTCCTCT
。
2. 根据权利要求1所述的一种新的CMV、PVY快速检测方法，其特征在于：所述的抽提缓冲液为2% polyvinylpyrrolidone、0.2% powdered egg albumin和phosphate -buffered saline，pH7.4。
3. 根据权利要求1所述的一种新的CMV、PVY快速检测方法，其特征在于：CMV反转录引物TGTGGGAATGCGTTGGTG；PVY反转录引物TTTATCTAAGACTTAATAATGCG。
4. 根据权利要求1所述的一种新的CMV、PVY快速检测方法，其特征在于：步骤（4）中所述的试剂，其终浓度分别为Tris-HCl 20mM，KCl 10 mM，(NH4)2SO4 10 mM，甜菜碱1.0 M，外侧正向引物和外侧反向引物各0.2μM，内侧正向引物和内侧反向引物各1.6μM，Mg2 8mM，dNTP mix0.6mM，Bst DNA聚合酶8U。”
驳回决定具体指出：1、独立权利要求1请求保护一种新的CMV、PVY快速检测方法，对比文件1公开了马铃薯Y病毒的免疫捕获反转录PCR IC-RT-PCR操作步骤，该权利要求与对比文件1相比，区别技术特征为：（1）还包括对CMV的检测，反转录扩增反应需加入CMV特异反转录引物；（2）将PCR管使用2%-5%戊二醛和HCl处理，分别使用ddH2O和碳酸包被缓冲液冲洗、变性条件为80℃金属浴，吸出反转录产物作为等温扩增反应底物，补充等温扩增试剂和无菌水至25μl体系，60-65℃反应60-90min的步骤；（3）具体限定了反应所使用的引物序列。基于上述区别可以确定该权利要求实际要解决的技术问题是如何采用免疫捕获-环式等温扩增同时检测CMV和PVY。对于区别技术特征（1），对比文件2公开了免疫捕获反转录PCR检测CMV病毒的方法，在此基础上，本领域技术人员能够想到采用IC-RT-PCR同时实现对CMV和PVY的检测；对于区别技术特征（2），在对比文件3公开的基于环式等温扩增的烟草青枯病病原菌快速检测方法的基础上，本领域技术人员有动机使用IC-RT-PCR反应获得DNA反转录产物作为等温扩增反应底物，采用对比文件3公开的LAMP反应体系，实现IC-RT-PCR后续的环式等温扩增程序，而其余区别技术特征是本领域技术人员的惯用技术手段；对于区别技术特征（3），该区别技术特征是本领域技术人员的惯用技术手段。因此，权利要求1相对于对比文件1与对比文件2-3和公知常识的结合不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。2、从属权利要求2-4的附加技术特征或被对比文件1、3公开，或是本领域的惯用技术手段，因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求2-4也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
申请人贵州省烟草科学研究院（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2019年01月25日向国家知识产权局提出了复审请求，仅陈述了意见并未对申请文件进行修改。
复审请求人在意见陈述中指出：（1）免疫捕获等温扩增，这种组合检测技术是全新的，核心在于如何避免在实现不依赖于复杂核酸操作（RNA提取和纯化）进行高灵敏度的等温扩增检测的同时，消除等温扩增易出现假阳性的弊端。其中，对PCR管以特定浓度的戊二醛处理（权利要求1-（1））以及在免疫捕获去除包被液后马上以特定温度热变性（权利要求1-（4））已在我们的研发过程中被证明是实现IC-RT-LAMP高灵敏零背景检测的关键，此步骤在参考文献中的IC-RT-PCR操作中均未提及。等温扩增引物的设计是以此技术为核心的检测技术的关键，并非本领域研究人员通过常规生物信息学软件分析就可以完成。其设计和筛选核心是使用不同引物组合检测阳性标准物后对特异性和灵敏度的综合比较。（2）关于等温扩增反应体系的质疑，本申请提及的反应体系皆是根据如何实现对免疫捕获产物实现零背景检测而优化的配比组合，与其他体系配比相比，检测存在背景有无的截然不同的差异，因此不应该被认为不具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年01月30日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局依法成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年09月23日向复审请求人发出复审通知书，指出：1、权利要求1要求保护一种新的CMV、PVY快速检测方法，对比文件1公开了一种PVY快速检测方法，权利要求1与对比文件1的区别技术特征为：（1）针对CMV进行检测，按照反转录酶产品说明书加入包括反转录酶的反转录试剂和CMV 和PVY特异反转录引物，定容体积至100μl；（2）PCR管使用2%-5%戊二醛和HCl处理，之后分别使用ddH2O和碳酸包被缓冲液冲洗，取稀释后的抗体加入处理好的PCR管；（3）CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增引物的设计；免疫捕获-环式等温扩增检测，取0.1-0.2g发病样品，烟草叶片匀浆液；80℃金属浴，反转录产物作为等温扩增反应底物，补充等温扩增试剂和无菌水至25μl体系，反应在60-65℃条件下进行60-90min；步骤（1）中具体采用的引物为：
。
针对区别技术特征（1），在对比文件2公开的IC-RT-PCR 扩增方法检测CMV，在反转录扩增反应中增加CMV特异反转录引物基础上，采用对比文件1的 IC-RT-PCR扩增同时检测CMV、PVY病毒是本领域技术人员容易想到的，具体按照反转录酶产品说明书加入包括反转录酶的反转录试剂和CMV 和PVY特异反转录引物，定容体积至100μl是本领域技术人员在反转录试剂、引物加入时的常规参照方法；
区别技术特征（2）是本领域技术人员为了提高包被效率进而提高检测灵敏度的惯用技术手段；
针对区别技术特征（3），在对比文件3公开的采用LAMP反应体系进行扩增以提高病毒检测特异性和灵敏度的基础上，本领域技术人员有动机将对比文件3公开的LAMP反应体系应用到对比文件1中替换其中的扩增技术，从而形成免疫捕获-环式等温扩增技术检测病毒，具体对CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增引物的设计和参数的调整是本领域技术人员的惯用技术手段。由此可见，在对比文件1的基础上结合对比文件2-3和本领域技术人员的惯用技术手段得到该权利要求请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，该权利要求不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2、从属权利要求2-4对其引用的权利要求进行了进一步的限定，附加技术特征或被对比文件1、3公开，或是本领域的惯用技术手段，因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求2-4也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。3、针对复审请求人的意见进行了答复。
针对上述复审通知书，复审请求人于2019年11月07日仅提交了意见陈述书，未对申请文件进行修改。
复审请求人在意见陈述书中陈述了本申请权利要求具备创造性的理由。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）、审查文本的认定
复审请求人在复审阶段均未对申请文件进行修改。本复审请求审查决定所依据的审查文本与驳回文本相同，为：2018年09月12日提交的权利要求第1-4项，申请日2016年06月20日提交的说明书第1-6页，说明书附图第1-4页，说明书摘要及摘要附图。
（二）、专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果权利要求请求保护的技术方案与作为最接近的现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，而这些区别技术特征部分被其他对比文件公开，且该其他对比文件给出了将该部分区别技术特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，其余区别技术特征属于本领域的常用技术手段，则该权利要求不具备创造性。
具体到本案：
1.权利要求1要求保护一种新的CMV、PVY快速检测方法，对比文件1公开了一种PVY快速检测方法，并公开了以下技术特征（参见第20-26页）：
抗体包被：使用包被缓冲液以1:200的比例稀释抗体，4℃孵育过夜，之后以PBST清洗备用（参见第21页）；
取得样品，以1:10的比例在提取缓冲液中研磨样品，离心取上清液（参见第21页）；
（参见第25页）：将病叶汁液上清加入抗体包被的PCR管中，37℃孵育2h，移去病叶汁液上清（相当于孵育结束后倒掉匀浆液），用PBST和DEPC冲洗（相当于然后用无菌水冲洗），在PCR管中加入无菌水DEPC，在70℃变性5min，然后迅速转移至冰上，加入包括反转录酶的反转录试剂，转录反应，然后吸出10μl反转录产物，进行PCR反应检测。
权利要求1与对比文件1的区别技术特征为：（1）针对CMV进行检测，按照反转录酶产品说明书加入包括反转录酶的反转录试剂和CMV 和PVY特异反转录引物，定容体积至100μl；
（2）PCR管使用2%-5%戊二醛和HCl处理，之后分别使用ddH2O和碳酸包被缓冲液冲洗，取稀释后的抗体加入处理好的PCR管；
（3）CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增引物的设计；免疫捕获-环式等温扩增检测，取0.1-0.2g发病样品，烟草叶片匀浆液；80℃金属浴，反转录产物作为等温扩增反应底物，补充等温扩增试剂和无菌水至25μl体系，反应在60-65℃条件下进行60-90min；步骤（1）中具体采用的引物：
。
基于上述区别技术特征，权利要求1的技术方案实际解决的技术问题是：如何在不依赖于核酸提取的步骤和复杂实验设备情况下提高CMV、PVY检测灵敏度和检测特异性。
针对区别技术特征（1），对比文件2公开了重庆南瓜病毒病病原ELISA检测及CMV变异分析（参见第406-407页）：IC-RT-PCR 扩增方法检测CMV，在反转录扩增反应中增加CMV特异反转录引物，并且作用相同：都是针对CMV进行检测，因此，在对比文件2的启示下本领域技术人员有动机采用对比文件1的 IC-RT-PCR扩增同时检测CMV、PVY病毒，而具体按照反转录酶产品说明书加入包括反转录酶的反转录试剂和CMV 和PVY特异反转录引物，定容体积至100μl是本领域技术人员在反转录试剂、引物加入时的常规参照方法；
针对区别技术特征（2），为了提高包被效率进而提高检测灵敏度，选择PCR管使用2%-5%戊二醛和HCl处理，之后分别使用ddH2O和碳酸包被缓冲液冲洗，取稀释后的抗体加入处理好的PCR管，是本领域技术人员的惯用技术手段；
针对区别技术特征（3），对比文件3公开了基于环式等温扩增的烟草青枯病病原菌快速检测方法（参见第94、96页）：对等温扩增引物进行设计，分别对引物：F3、B3、FIP、BIP进行引物序列的选择，以确定环式扩增的引物序列，取0.1g烟草叶片，以液氮研磨至粉末，然后按照天根基因组ＤＮＡ 提取试剂盒说明书完成，建立LAMP反应体系，反应体系设定为25μl，加入等温扩增试剂，最后整个反应体系61℃孵育45min。对比文件3公开了采用LAMP反应体系进行扩增以提高病毒检测的特异性和灵敏度。为了提高病毒检测的特异性和灵敏度，本领域技术人员有动机将对比文件3公开的LAMP反应体系应用到对比文件1中替换其中的扩增技术，从而形成免疫捕获-环式等温扩增技术检测病毒，具体对CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增引物的设计，80℃金属浴，反转录产物作为等温扩增反应底物和无菌水至25μl体系，反应进行60-90min是本领域技术人员在利用免疫捕获-环式等温扩增技术检测CMV和PVY时对于检测方法中的参数的灵活调整，对比文件3中公开了对引物：F3、B3、FIP、BIP进行引物序列的选择，而在对CMV和PVY进行检测时，本领域技术人员有动机针对CMV和PVY的病毒特性，选择对应的引物序，这是本领域技术人员的惯用技术手段。
由此可见，在对比文件1的基础上结合对比文件2-3和本领域技术人员的惯用技术手段得到该权利要求请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，该权利要求不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2.从属权利要求2对其引用的权利要求进行了进一步的限定，对比文件1公开了（参见第19页）：提取缓冲液为20.0g聚乙烯毗咯烷酮(PVP)溶于1000mlPBST中,调pH至7.4（相当于2% polyvinylpyrrolidone），而选择0.2% powdered egg albumin和phosphate -buffered saline是本领域技术人员在提取缓冲液成分选择时的惯用技术手段，由此可见，当其引用的权利要求不具备创造性时，该从属权利要求请求保护的技术方案不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3.从属权利要求3对其引用的权利要求进行了进一步的限定，CMV反转录引物TGTGGGAATGCGTTGGTG；PVY反转录引物TTTATCTAAGACTTAATAATGCG是本领域技术人员在反转录引物选择时的惯用技术手段，由此可见，当其引用的权利要求不具备创造性时，该从属权利要求请求保护的技术方案不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
4.从属权利要求4对其引用的权利要求进行了进一步的限定，对比文件3公开了（参见第94页第2栏）：其中浓度分别为Tris-HCl 20mM，KCl 10 mM，(NH4)2SO4 10 mM，甜菜碱1.0 M，外侧正向引物和外侧反向引物各0.2μM，内侧正向引物和内侧反向引物各1.6μM，Mg2 6mM，dNTP 0.4mM，Bst DNA聚合酶8U，而选择Mg2 8mM、dNTP mix0.6mM是本领域技术人员在等温扩增试剂选择时的惯用技术手段，由此可见，当其引用的权利要求不具备创造性时，该从属权利要求请求保护的技术方案不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）、对于复审请求人的意见陈述：
复审申请人认为：（1）本申请免疫捕获等温扩增，这种组合检测技术是全新的，核心在于如何避免在实现不依赖于复杂核酸操作（RNA提取和纯化）进行高灵敏度的等温扩增检测的同时，消除等温扩增易出现假阳性的弊端。其中，对PCR管以特定浓度的戊二醛处理以及在免疫捕获去除包被液后马上以特定温度热变性已在我们的研发过程中被证明是实现IC-RT-LAMP高灵敏零背景检测的关键，此步骤在参考文献中的IC-RT-PCR操作中均未提及。等温扩增引物的设计是以此技术为核心的检测技术的关键，并非本领域研究人员通过常规生物信息学软件分析就可以完成。其设计和筛选核心是使用不同引物组合检测阳性标准物后对特异性和灵敏度的综合比较。（2）关于等温扩增反应体系的质疑，虽然等温扩增条件确实是可根据实验需要进行调节涉及的，但是本申请提及的反应体系皆是为了实现对免疫捕获产物零背景检测而优化的配比组合，与其他体系配比相比，检测存在背景有无的截然不同的差异，因此不应该被认为不具备创造性。（3）IC-RT-LAMP的组合是有新颖性的，并不是仅靠公知就能解决。因为目前国内外没有看到第二篇这样报道的文献，在此文件中的体系和已报道的差距不大只是巧合，而选择别的靶标变化就可能非常大，甚至做不出来。因此，不能因为本申请实施案例这个个例，就把IC-RT-LAMP这种新颖的组合认为成仅靠推定就可得出，实际上IC-RT-PCR中的PCR不是随便都可以被LAMP取代的。
合议组认为：
（1）首先，虽然对比文件1-3都没有公开免疫捕获等温扩增这种组合技术，但是，对比文件3中使用的基于环式等温扩增方法对烟草的病原菌进行检测，其所要解决的技术问题是为了提高灵敏度和高特异性，由对比文件3公开的内容可知，LAMP相对于PCR可以起到提高灵敏度和特异性的作用。而提高检测灵敏度和特异性是本领域人员普遍的技术追求，为了提高检测灵敏度和特异性，本领域技术人员有动机采用对比文件3公开的LAMP代替对比文件1中的PCR形成IC-RT-LAMP检测体系对病毒进行检测，其所要达到的技术效果是本领域技术人员可以预见的；其次，戊二醛处理是本领域为了高效包被时的常用试剂，而抗体的包被效果对于检测体系的灵敏度的影响是本领域技术人员容易意识到的，因此，增加戊二醛处理以提高包被效果进而提高检测体系的灵敏度是本领域技术人员容易想到的；再次，对比文件3公开了对于环式等温扩增检测技术，引物设计是核心，同时，针对病菌的特殊性，对F3、B3、FIP、BIP进行引物序列的选择，在此启示下，本领域技术人员在对CMV和PVY检测时，针对CMV和PVY的特殊性，分别对F3、B3、FIP、BIP进行对应的引物序列的选择这是本领域技术人员容易想到的，在对比文件给出的对特异性和灵敏度的要求下，本领域技术人员在现有的引物序列中进行选择，并不需要付出创造性劳动，同时，本申请中并没有针对其他不同引物组合进行对比实施例的阐述；
（2）本申请说明书中记载：通过将免疫学技术和分子生物学技术相结合，发挥单克隆抗体高特异性和LAMP技术高灵敏性的优点，开发的免疫捕获-环式等温扩增技术不仅可以在不依赖于核酸提取的步骤和复杂实验设备情况下对病原微生物进行高灵敏检测，还可以大大增加检测的特异性，可见，其所要解决的技术问题是如何利用免疫捕获-环式等温扩增技术对病原微生物进行高灵敏、高特异性检测，并未记载“如何实现对免疫捕获产物实现零背景检测而优化的配比组合”，同时，本申请中也没有针对与其他体系配比进行对比实施例的记载。免疫捕获和环式等温扩增技术分别被对比文件1和3公开，两者的组合后的效果是本领域技术人员可以意识到的，并没有带来预料不到的技术效果；
（3）在具体评述中，合议组否定了CMV、PVY快速检测方法的创造性，并未否定IC-RT-LAMP组合的新颖性，针对创造性，参照前两点针对意见陈述的答复内容，得到IC-RT-LAMP组合对于本领域技术人员来说是显而易见的，并不需要付出创造性劳动。
因此，合议组对复审请求人的上述意见陈述不予支持。
基于以上事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年10月10日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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