发明创造名称：一种猴头菇多糖提取液的脱蛋白方法
外观设计名称：
决定号：197831
决定日：2019-12-12
委内编号：1F256975
优先权日：
申请（专利）号：201610275002.0
申请日：2016-04-28
复审请求人：广东太阳神集团有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：杨志培
合议组组长：姚云
参审员：南艳
国际分类号：C08B37/00
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：在判断一项权利要求的创造性时，如果该权利要求的技术方案和最接近的现有技术相比存在区别特征，而现有技术中给出了将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其实际解决的技术问题的启示，则该权利要求的技术方案不具备创造性。
全文：
本复审请求审查决定涉及申请号为201610275002.0、名称为“一种猴头菇多糖提取液的脱蛋白方法”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请人为广东太阳神集团有限公司，申请日为2016年04月28日，公开日为2016年06月22日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年05月03日以权利要求1-3不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：申请人于2018年02月08日提交的权利要求第1-3项，于申请日2016年04月28日提交的说明书摘要、说明书第1-37段（下称驳回文本）。
驳回文本的权利要求书如下：
“1. 一种猴头菇多糖提取液的脱蛋白方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一，配制壳聚糖-醋酸溶液：将壳聚糖溶解于醋酸溶液中，搅拌均匀，即制得壳聚糖-醋酸溶液；
步骤二，猴头菇多糖提取液与壳聚糖-醋酸溶液的混合：将猴头菇多糖提取液与步骤一制得的壳聚糖-醋酸溶液混合均匀，得到第一混合物；
步骤三，第一次离心处理：将步骤二得到的第一混合物进行第一次离心处理，得到第一上清液，然后将第一上清液处于一定温度下静置一定时间；
步骤四，第二次离心处理：将步骤三中静置后的第一上清液进行第二次离心处理，得到第二上清液，然后将第二上清液处于一定温度下放置一定时间，即制得脱蛋白后的猴头菇多糖提取液；
所述步骤一配制壳聚糖-醋酸溶液步骤，所述醋酸溶液中醋酸的体积百分比浓度为0.5％～3％，所述壳聚糖-醋酸溶液中的壳聚糖的质量百分比浓度为1％～3％；
所述步骤二猴头菇多糖提取液与壳聚糖-醋酸溶液的混合步骤中，所述猴头菇多糖提取液与所述壳聚糖-醋酸溶液的体积比为40～60:1；
所述步骤三第一次离心处理步骤中，将所述第一上清液处于2℃～6℃下放置2h～3h；
所述步骤三第一次离心处理步骤中，所述第一次离心处理的离心速度为2500r/min～3500r/min，离心时间为10min～15min；
所述步骤四第二次离心处理步骤中，将第二上清液处于2℃～6℃下放置2h～3h；
所述步骤四第二次离心处理步骤中，所述第二次离心处理的离心速度为2500r/min～3500r/min，离心时间为10min～15min。
2. 根据权利要求1所述的一种猴头菇多糖提取液的脱蛋白方法，其特征在于：所述步骤二猴头菇多糖提取液与壳聚糖-醋酸溶液的混合步骤中，所述猴头菇多糖提取液是以猴头菇子实体粉末为原料，然后进行热水浸提，并离心处理后得到的猴头菇多糖提取液。
3. 根据权利要求1所述的一种猴头菇多糖提取液的脱蛋白方法，其特征在于：所述步骤二猴头菇多糖提取液与壳聚糖-醋酸溶液的混合步骤中，猴头菇多糖提取液与步骤一制得的壳聚糖-醋酸溶液的混合是采用旋涡混合器进行混合均匀。”
驳回决定指出：（1）权利要求1与对比文件1（“金针菇多糖的壳聚糖絮凝工艺优化”，罗文锋等，《食用菌学报》，第22卷第2期，第68-71页，2015年6月30日）的区别特征在于：权利要求1限定的是猴头菇多糖提取液，对比文件1公开的是金针菇多糖提取液，其它工艺细节有所不同。基于上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题是如何提供一种猴头菇多糖提取液的脱蛋白方法。然而，猴头菇和金针菇都是常见食用菌菇，技术领域相近，猴头菇多糖提取液中也普遍存在蛋白质杂质，基于壳聚糖脱蛋白的机理，将对比文件1中的脱蛋白方法用于猴头菇多糖提取液中蛋白的脱除只是一种简单的转用，未产生预料不到的技术效果。而具体的工艺细节如溶解壳聚糖时搅拌均匀、处理次数以及提取液和壳聚糖溶液的合适体积比是本领域的常规技术手段或者通过常规技术手段例如正交实验能够确定的；对于多次纯化的工艺细节，本申请未记载所述静置、离心等工艺解决了何种技术问题，带来了何种技术效果，而将第一上清液处于一定温度下静置一定时间后再离心处理可以避免残留未除尽的蛋白，将第二上清液处于一定温度下静置一定时间可以避免残留未除尽的蛋白的同时，还可以检验脱蛋白效果，沉淀温度和时间以及离心转速和时间属于常规选择，并且没有任何证据表明采用该步骤时为本申请的技术方案带来预料不到的技术效果。因此在对比文件1的基础上结合本领域的常规技术手段得到权利要求1中的技术方案对于本领域的技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具备创造性。（2）从属权利要求2-3的附加技术特征或者已经被对比文件1所教导，或者属于本领域的常规技术手段，因此，在其引用的权利要求不具备创造时，权利要求2-3也不具备创造性。（3）针对申请人的如下意见陈述：①脱蛋白对象不同，导致具体工艺和所采用的脱蛋白剂不同，醋酸浓度、壳聚糖浓度是针对猴头菇多糖提取液进行设置的；②对比文件1未公开步骤三第一次离心处理和步骤四第二次离心处理，其是本申请能够达到提高蛋白质去除率和降低多糖损失率的必要技术特征，进而使得所制得的脱蛋白后的猴头菇多糖提取液蛋白质去除率和多糖损失率均优于现有技术的Sevage法。驳回决定认为，①首先，本申请和对比文件1的脱蛋白试剂是相同的，对比文件1也公开了混合后离心脱蛋白，其对应步骤三第一次离心处理的离心操作。其次，猴头菇和金针菇的技术领域非常相近，壳聚糖脱蛋白的机理是针对蛋白质固有的活性基团来设计的，不局限于蛋白质的来源，普遍适用于不同蛋白质的吸附，将对比文件1中的脱蛋白方法用于猴头菇多糖提取液中蛋白的脱除只是一种简单的转用，并不存在技术障碍，其效果可预期。②对比文件1已经公开了对应步骤三第一次离心处理的离心操作，技术效果与本申请相同或相似。对于后续的工艺细节，将第一上清液处于一定温度下静置一定时间后再离心处理（对应第二次离心）可以避免残留未除尽的蛋白，第二次离心可以将絮凝物去除，将第二上清液处于一定温度下静置一定时间可以避免残留未除尽的蛋白的同时，还可以检验脱蛋白效果。本申请未记载静置等工艺解决了何种技术问题，带来了何种技术效果，本领域技术人员根据说明书的记载也无法看出采用第一次离心后的工艺细节在蛋白质去除率、多糖的损失率方面带来了何种预料不到的技术效果。因此，申请人的意见陈述不具有说服力。
申请人广东太阳神集团有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年07月25日向国家知识产权局提出了复审请求，未对申请文件进行修改。复审请求人认为：①本申请与对比文件1的脱蛋白对象不同，导致具体工艺步骤和所采用的脱蛋白剂不同，本申请的醋酸浓度、壳聚糖浓度是针对猴头菇多糖提取液进行设置的，脱蛋白的原理是壳聚糖的氨基在醋酸存在下质子化，壳聚糖表现出阳离子型电解质的作用，因此能够有效地吸附溶液中带负电的蛋白质胶粒。②对比文件1未公开步骤三第一次离心处理和步骤四第二次离心处理，本申请通过离心后的静置进一步沉淀了蛋白质，有利于提高蛋白质去除率，其得到补充实验数据的证明。③两次离心处理是本申请能够达到提高蛋白质去除率和降低多糖损失率的必要技术特征，所制得的脱蛋白后的猴头菇多糖提取液的蛋白质去除率和猴头菇多糖损失率均低于现有技术的Sevage法。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年08月01日依法受理了该复审请求，并将其转送至国家知识产权局原审查部门进行前置审查。
国家知识产权局原审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定中的意见，同时进一步提供证据以佐证壳聚糖脱蛋白试剂是一种公知的脱蛋白试剂（参见：《桑黄栽培和利用》，段毅等，第126页，新华彩印出版社等，2011年9月第一版第一次印刷；《功能性食品胶》，胡国华等，第204页，北京：化学工业出版社，2004年1月第1版第1次印刷（下称公知常识性证据2）），并指出现有技术中也将该脱蛋白试剂用于多种类型多糖的脱蛋白处理。此外，针对复审请求人新提供的静置时间为0、1、2、4小时的脱蛋白数据，指出其是原申请文件中并未记载的内容，而且静置本身可以使残留蛋白质充分沉淀，离心可以将絮凝物进一步的去除，该操作为本领域技术人员所熟知的基础操作知识，必然利于蛋白质去除率的提高，本领域技术人员可根据实际脱蛋白效果对上述操作细节进行常规设置。因此，复审请求人的意见陈述不具有说服力，因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年08月29日向复审请求人发出复审通知书，指出：（1）权利要求1与对比文件1公开的技术方案相比，区别特征在于：①二者的处理对象不同，权利要求1中处理对象为猴头菇多糖提取液，而对比文件1为金针菇多糖提取液；②二者在多糖提取液与壳聚糖-醋酸溶液的体积比、离心速度上有所不同；并且权利要求1还包括了第一次离心之后的静置和第二次离心及静置。基于区别特征所能达到的技术效果可以确定，权利要求1相对于对比文件1所实际解决的技术问题是提供一种猴头菇多糖提取液的脱蛋白方法。对于区别特征①，猴头菇和金针菇的技术领域相近，有效成分相似（参见公知常识性证据1：《中国食用药用真菌化学》，陈若芸主编，上海：上海科学技术出版社，2016年3月第1版第1次印刷，第352-353，375-376页），因此在提取分离多糖时所面临的技术问题和所采用的技术手段相似。猴头菇多糖提取液中也普遍存在蛋白质杂质，因此存在除去蛋白质杂质、提高有效成分多糖含量的需求。而本领域公知壳聚糖脱蛋白的原理（参见公知常识性证据2），壳聚糖-醋酸体系作为脱蛋白剂去除蛋白质的方法并不受限于蛋白质的来源。因此，将对比文件1中的脱蛋白方法应用于猴头菇多糖提取液中蛋白质的脱除是本领域技术人员容易想到的，其只是一种简单的转用，未产生预料不到的技术效果。对于区别特征②，首先，对比文件1公开了脱蛋白效果与壳聚糖用量、提取液浓度、作用时间有关，本领域技术人员在将对比文件1的方法转用至猴头菇多糖提取液的脱蛋白时，可以根据所要处理的猴头菇多糖提取液的浓度和壳聚糖-醋酸溶液的浓度设置合适的壳聚糖-醋酸溶液用量。其次，对比文件1的脱蛋白溶液中可能还有未反应的壳聚糖，通过静置以使得壳聚糖与蛋白质进一步作用，然后进行再一次的离心分离是容易想到的。类似地，本领域技术人员也容易想到进行第二次静置，以保证壳聚糖的作用得到充分发挥，并可检验脱蛋白效果。静置的温度和时间、离心时的转速是本领域技术人员通过有限的试验能够确定的。因此，权利要求1不具备创造性。（2）从属权利要求2-3的附加技术特征或者已经被对比文件1所教导，或者属于本领域的常规技术手段，因此，在其引用的权利要求不具备创造时，权利要求2-3也不具备创造性。（3）关于复审请求人的意见陈述，合议组认为：①本申请与对比文件1虽然脱蛋白对象不同，但二者的多糖提取液成分相近，脱蛋白体系、醋酸浓度、壳聚糖浓度均是相同的，未发现将对比文件1的絮凝剂转用至猴头菇多糖提取液中进行脱蛋白时存在技术障碍，或需要对该体系进行大幅度的改变。此外，本申请壳聚糖脱蛋白的原理与本领域公知的原理相同。②对比文件1已经公开了离心分离的步骤，其相当于本申请的第一次分离，而在第一次离心后进行静置以及再次离心和静置以提高蛋白质去除率是本领域技术人员容易想到的，且本申请相对于对比文件1并未取得改善的效果；所补充的实验数据由于没有记载于原始申请文件中以及实验数据本身没有明确测试条件而不能用来证明本申请的创造性。③虽然本申请相较于Sevage法在蛋白质去除率和多糖损失率上取得了改善，但Sevage法并非本申请最接近的现有技术，本申请与对比文件1相比在蛋白质去除率和多糖损失率并没有明显改善。
针对上述复审通知书，复审请求人于2019年09月27日提交了意见陈述书和权利要求书全文替换页（共2页，1项），相对于复审通知书所针对的文本，对权利要求书的修改体现在：将权利要求2和3的附加技术特征补入权利要求1中；删除权利要求2和3。
复审请求人在其复审理由的基础上，进一步明确了所补充的实验数据是第二次离心后静置时间与蛋白质去除率的关系，并认为对比文件1没有公开步骤二的猴头菇多糖提取液是以猴头菇子实体粉末为原料，然后进行热水浸提，并离心处理后得到的猴头菇多糖提取液，以及猴头菇多糖提取液与步骤一制得的壳聚糖-醋酸溶液的混合是采用旋涡混合器进行混合均匀，也没有公开所述脱蛋白方法具有易于提取和混合均匀的优点。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、关于审查文本
复审请求人于2019年09月27日提交了权利要求书的全文修改替换页（共2页，1项），经合议组审查，其修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。
本复审请求审查决定所依据的审查文本为：复审请求人于2019年09月27日提交的权利要求第1项，于申请日2016年04月28日提交的说明书摘要、说明书第1-37段（下称复审决定文本）。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
在判断一项权利要求的创造性时，如果该权利要求的技术方案和最接近的现有技术相比存在区别特征，而现有技术中给出了将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其实际解决的技术问题的启示，则该权利要求的技术方案不具备创造性。
就本申请而言，复审决定文本的权利要求1要求保护一种猴头菇多糖提取液的脱蛋白方法（具体参见案由部分）。
对比文件1公开了一种金针菇多糖的壳聚糖絮凝工艺优化，具体为：准确称取10g壳聚糖，加入1%乙酸溶液（即醋酸溶液，对于本领域技术人员来说，在没有特殊说明的情况下，液体乙酸的浓度一般为体积浓度）溶解并定容至1000mL，得1%壳聚糖溶液。将新鲜金针菇子实体放置在自然光下晒干，加入10倍体积的95%乙醇，冷凝水回流冷却状态下煎煮2h，除去部分小分子物质，冷却至室温，65℃恒温干燥箱中干燥至恒重，准确称取200g，加入去离子水6000mL，100℃提取2h，抽滤得提取液。分别取提取液150mL，利用旋转蒸发仪浓缩到30、40、50mL（浓缩比分别为5:1、5:4和3:1），并通过HCl调节pH值至2，准确量取浓缩液25mL于50mL茄型瓶中，加入1%壳聚糖溶液，35℃下恒温磁力搅拌后，6000g离心5min，上清液为絮凝后溶液（参见对比文件1第1.2-1.4节）。
权利要求1与对比文件1公开的技术方案相比，区别特征在于：（1）二者的处理对象不同，权利要求1中处理对象为猴头菇多糖提取液，而对比文件1为金针菇多糖提取液；（2）二者在多糖提取液与壳聚糖-醋酸溶液的体积比、离心速度上有所不同；并且权利要求1还包括了第一次离心之后的静置和第二次离心及静置；（3）权利要求1还限定了步骤二的猴头菇多糖提取液是由猴头菇实体粉末热水浸提并离心处理得到，限定了其与壳聚糖-醋酸溶液的混合是采用旋涡混合器进行混合。
合议组查明，根据本申请说明书的记载，本申请的目的在于针对现有技术的不足之处而提供一种安全无毒、绿色环保的猴头菇多糖提取液的脱蛋白方法，其具有安全无毒、绿色环保的优点，不会使多糖发生水解，进而能够保证多糖的结构及活性。其中，壳聚糖-醋酸溶液与猴头菇多糖提取液中的蛋白质的络合原理是：壳聚糖-醋酸溶液中的壳聚糖用于吸附络合蛋白质，壳聚糖与蛋白质结合过程包括静电作用和疏水作用；壳聚糖的分子链上含有大量的游离氨基和羟基，这些游离氨基和羟基易于与蛋白质发生交联反应；其中，氨基在醋酸条件质子化而使得壳聚糖能够表现出阳离子型聚电解质的作用，因此能够有效地吸附溶液中带负电的蛋白质胶粒，进而达到脱蛋白的目的（参见本申请说明书第0004，0015-0020段）。实施例1-5表明，根据本申请的方法，脱蛋白后的猴头菇多糖提取液蛋白质含量为12.3%-12.8%，蛋白质去除率为59.64%-60.58%，多糖的损失率为12%-16.5%，壳聚糖残留率为0.18%-0.21%。复审请求人在答复复审通知书时还提交了如下补充实验数据，以证明先后经过两次离心并将两次离心后的上清液在特定的温度2℃~6℃下静置2h~3h均有利于提高蛋白质去除率：
。
对比文件1的目的是絮凝金针菇多糖提取液，以除去其中的蛋白质，并保留作为金针菇重要活性成分的多糖（参见对比文件1摘要，第68页左栏第1段）。对比文件1同样采用壳聚糖-醋酸体系，并研究了不同的絮凝剂用量、提取液浓缩比、絮凝时间的条件下，多糖保留率和蛋白质清除率的变化情况。其中，多糖保留率为64.22%-91.43%（即多糖损失率为8.57%-35.78%），蛋白质清除率为40.41%-66.74%（参见对比文件1第2.1节，表2）。本申请与对比文件1相比，由于使用相同的壳聚糖-醋酸溶液体系，因此在无毒、环保方面将具有类似的表现，而在多糖损失率、蛋白质去除率上本申请相对于对比文件1并没有获得改善。至于复审请求人所补交的实验数据，虽然该实验数据证明了静置有助于提高蛋白质去除率，但是从最终结果上看，本申请经过两次静置和离心所取得的蛋白质去除率并没有优于对比文件1。而采用猴头菇实体粉末热水浸提以及采用旋涡混合器进行混合是否会带来多糖损失率的降低或者蛋白质去除率的提高，在说明书中并没有提及。因此，基于区别特征所能达到的技术效果可以确定，权利要求1相对于对比文件1所实际解决的技术问题是提供一种猴头菇多糖提取液的脱蛋白方法。
对于区别特征（1），猴头菇和金针菇都是常见食用真菌，其都具有抗肿瘤、提高机体免疫力等方面的作用，技术领域相近。猴头菇和金针菇的有效成分都以多糖为主，并且两者的多糖主要是具有β(1-3)键连接的主链的葡聚糖（参见公知常识性证据1），因此在提取分离多糖时所面临的技术问题和所采用的技术手段相似。猴头菇多糖提取液中也普遍存在蛋白质杂质，因此存在除去蛋白质杂质、提高有效成分多糖含量的需求。而本领域公知壳聚糖脱蛋白的原理主要是壳聚糖的分子链上分布着大量的游离氨基，其溶于稀酸成盐后这些氨基与质子结合带正电荷，可吸附阴离子型电解质的蛋白质胶体微粒并使其凝集，进而可以将蛋白质除去（参见公知常识性证据2）。显然，壳聚糖-醋酸体系作为脱蛋白剂去除蛋白质的方法并不受限于蛋白质的来源，其可适用于不同蛋白质的脱除。因此，将对比文件1中的脱蛋白方法应用于猴头菇多糖提取液中蛋白质的脱除是本领域技术人员容易想到的，其只是一种简单的转用。
对于区别特征（2），首先，对比文件1公开了脱蛋白效果与壳聚糖用量、提取液浓度、作用时间有关，并通过正交实验确定了最佳条件，虽然本申请所限定的提取液与壳聚糖-醋酸溶液的体积比40～60:1并非对比文件1所公开的最佳条件，但本领域技术人员在将对比文件1的方法转用至猴头菇多糖提取液的脱蛋白时，可以根据所要处理的猴头菇多糖提取液的浓度和壳聚糖-醋酸溶液的浓度设置合适的壳聚糖-醋酸溶液用量。其次，对比文件1公开了蛋白质的清除率为40.41%-66.74%，也就是说，在离心后的上清液中仍含有较大量的蛋白质杂质，而由于此时溶液中还可能有未反应的壳聚糖，因此通过静置以使得壳聚糖与蛋白质进一步作用，然后进行再一次的离心分离是容易想到的。类似地，本领域技术人员也容易想到第二次静置和离心，以保证壳聚糖的作用得到充分发挥，并可检验脱蛋白效果。低温下静置有利于蛋白质絮凝物的析出和沉淀，具体的温度和时间是本领域技术人员根据脱蛋白效果通过有限的试验能够确定的。而离心时转速的确定也是本领域的常规选择。
对于区别特征（3），对比文件1已经公开了可以通过95%乙醇除去金针菇子实体中的小分子物质，用去离子水在100℃下提取2h得到金针菇多糖提取液。本领域技术人员容易想到采用类似的方法来制备猴头菇多糖提取液，而粉末状原料有利于提取的进行，提取之后离心分离则是本领域的惯用手段，采用旋涡混合器混合两种液体也是本领域的惯用手段，其技术效果均可预期。
因此，在对比文件1的基础上结合本领域的常规技术手段得到权利要求1请求保护的技术方案对于本领域的技术人员来说是显而易见的，其不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、关于复审请求人的意见
对于复审请求人答复复审通知书时陈述的意见，合议组认为：①本申请与对比文件1虽然脱蛋白对象不同，但二者的多糖提取液成分相近，脱蛋白体系、醋酸浓度、壳聚糖浓度均是相同的，未发现将对比文件1的絮凝剂转用至猴头菇多糖提取液中进行脱蛋白时存在技术障碍，或需要对该体系进行大幅度的改变。此外，本申请壳聚糖脱蛋白的原理与本领域公知的原理相同。②如前所述，对比文件1已经公开了离心分离的步骤，即相当于本申请的第一次离心，而在第一次离心后进行静置以及再次离心和静置以提高蛋白质去除率是本领域技术人员容易想到的。复审请求人提供的实验数据仅是证明了静置有助于提高蛋白质去除率，如前所述，该效果本是本领域技术人员可以预期的，且从最终结果上看，本申请经过两次静置和离心所取得的蛋白质去除率并没有显著优于对比文件1。③虽然本申请相较于Sevage法在蛋白质去除率和多糖损失率上取得了改善，但Sevage法并非本申请最接近的现有技术，本申请与对比文件1相比在蛋白质去除率和多糖损失率并没有明显改善。④制备提取液时粉末状原料有利于提取的进行，提取之后离心分离以及采用旋涡混合器混合两种液体都是本领域的惯用手段，其技术效果可以预期。因此，对于复审请求人的主张合议组不予支持。
根据以上事实和理由，合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年05月03日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
郑重声明：本文版权归原作者所有，转载文章仅为传播更多信息之目的，如作者信息标记有误，请第一时间联系我们修改或删除，多谢。
