发明创造名称：一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法
外观设计名称：
决定号：199213
决定日：2019-12-10
委内编号：1F250137
优先权日：
申请（专利）号：201510271513.0
申请日：2015-05-26
复审请求人：中国水产科学研究院黄海水产研究所
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：王慧梅
合议组组长：王启扬
参审员：李振鹏
国际分类号：C12N15/10
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：根据该款规定，评价一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别技术特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示。如果现有技术中存在这种启示，并且所获得的发明的技术效果是可以预料的，则该发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510271513.0，名称为“一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法”的发明专利申请。申请人为中国水产科学研究院黄海水产研究所。本申请的申请日为2015年05月26日，公开日为2015年08月12日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年02月26日以权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请，其理由是：权利要求1请求保护一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法。对比文件1（半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA 克隆及表达分析，邓思平等，《动物学研究》，第29卷，第1期，公开日：2008年02月）公开了半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA 克隆及表达分析，并具体公开了如下技术特征：半滑舌鳎取自于山东海阳国家863计划海水养殖种子资源北方基地，分别取二龄鱼脑、性腺、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、皮肤、心肌、肠、头肾、鳃、皮肤、小肠和眼后立即投入液氮保存，随后转于－80℃低温冰箱保存以用于组织RNA提取（参见第1.1节）。权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，其区别在于：①权利要求1涉及从刚刚死亡的半滑舌鳎切取皮肤组织的具体操作，对比文件1公开的是直接从半滑舌鳎中切取皮肤组织用于提取RNA；②权利要求1涉及采用PBS清洗鱼体表面；③权利要求1涉及对切取的皮肤组织进行相应的切块并采用多聚甲醛固定化处理。基于上述区别技术特征，本申请所要解决的技术问题是提供一种新的固定化处理RNA提取样品的操作。对于区别技术特征①，对比文件1公开了可以从皮肤组织提取RNA，由于半滑舌鳎的解剖结构已经相当清楚，从半滑舌鳎上分离相应的皮肤组织是本领域技术人员容易实现的，并不需要付出创造性的劳动，且刚刚死亡的半滑舌鳎的组织材料新鲜，适合提取RNA，本领域技术人员容易想到；对于区别技术特征②，由于鱼体表面存在粘液，实际操作中容易滑动，因此，在处理之前采用PBS清洗以去除是本领域技术人员容易想到的；对于区别技术特征③，对比文件2（标本固定对组织总RNA和病毒RNA的影响，贺莉萍等，《中国组织工程研究与临床康复》，第11卷，第5期，公开日：2007年12月）公开了标本固定对组织总RNA和病毒RNA的影响，并具体公开了采用4%多聚甲醛溶液对RNA提取样本处理之后，可以对组织细胞的蛋白起到沉淀作用，并有脱水效应（参见第3.1.2节），可见，对比文件2给出了采用多聚甲醛固定RNA提取样品的启示；由上述分析评述可知，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的常规技术得出权利要求1所要求保护的技术方案，对本领域的技术人员来说是显而易见的，因此权利要求1所要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
驳回决定所依据的文本为申请日2015年05月26日提交的说明书摘要、摘要附图、说明书第1-45段（即第1-6页）和说明书附图图1-图2（即第1页），以及2017年09月06日提交的权利要求第1项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法，其特征在于它包括以下步骤
(1)首先用1×PBS缓冲液清洗刚刚死亡的半滑舌鳎鱼体表面，去除皮肤表面覆盖的粘液；
(2)在选取的皮肤部位，利用解剖刀切入深度为1.8-3.0mm方块，所述方块面积大约为0.25-4cm2，且不要脱离鱼体；
(3)利用移液枪向步骤(2)中1.8-3.0mm深的方块四周裂口处注满4％(g/100ml)多聚甲醛溶液，固定处理1min-4min；
(4)然后吸取4％(g/100ml)多聚甲醛溶液滴加到所处理的方块皮肤表面，固定处理30s-1min；
(5)选取方块的一角，用镊子直接撕取该组织块表面皮肤，获取的皮肤组织能够直接用于RNA的提取或冷冻保存。”
申请人中国水产科学研究院黄海水产研究所（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年04月24日向国家知识产权局提出了复审请求，未提交修改的申请文件。复审请求人认为：（1）对比文件1虽然公开了从半滑舌鳎皮肤组织中提取RNA，但是没有公开具体的方法，而获得高质量的RNA的关键技术在于对半滑舌鳎皮肤前处理步骤。（2）没有文献公开用1 X PBS缓冲液清洗半滑舌鳎表面，现有技术中一般采用刀刮或水清洗。（3）对比文件1或2没有公开利用4％多聚甲醛溶液注入在切口四周，能够使半滑舌鳎组织很好的剥离肌肉，从而能够获得干净的半滑舌鳎皮肤组织这一技术方案，而且RNA完整性好。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年05月14日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，（1）由于半滑舌鳎的解剖结构已经很清楚，从其上分离皮肤组织是本领域技术人员容易实现的；（2）PBS是常见的清洗缓冲液，而且本申请实施例也没有证明采用PBS清洗取得了预料不到的技术效果；（3）多聚甲醛对样本的固定作用在于对样本中组织细胞的蛋白起到沉淀作用，并进行相应的脱水，显然，切口处的组织相对于完好组织来讲更加容易被固定，且进一步脱水沉淀后，能明显区分于周围的组织，能更好地剥离。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019 年07 月31 日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1（参见“1.1 组织制备、RNA和DNA提取”）公开的内容相比，其区别技术特征在于：①权利要求1限定了从刚刚死亡的半滑舌鳎切取皮肤组织；②权利要求1采用PBS缓冲液清洗鱼体表面；③权利要求1限定了直接在鱼体上选取的皮肤部位切入深度为1.8-3.0mm、面积为0.25-4cm2的方块，并采用多聚甲醛对切块四周裂口处和切块表面皮肤先后进行固定化处理。基于上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题是如何改善半滑舌鳎的皮肤组织不易剥离难以获得高质量皮肤组织RNA的问题。对于区别技术特征①，对比文件1公开了可以从半滑舌鳎的皮肤组织提取RNA，而刚刚死亡的半滑舌鳎的组织材料新鲜，适合用于提取RNA，从而本领域技术人员能常规选择刚刚死亡的半滑舌鳎用于提取RNA；对于区别技术特征②，由于半滑舌鳎鱼体表面存在粘液，实际操作中容易滑动，因此，在处理之前采用PBS清洗以去除表面粘液是本领域技术人员容易想到的；对于区别技术特征③，对比文件2公开了标本固定对组织总RNA和病毒RNA的影响，并具体公开了采用4%多聚甲醛溶液对RNA提取样本进行固定处理（参见“3.1.1 醛类固定剂固定方式对RNA的影响”），即对比文件2给出了采用4% 多聚甲醛固定RNA提取样品的启示。且对比文件2还公开了标本的采集、固定和贮存均影响标本组织结构、抗原及其核酸的完整性（参见引言），从组织切除到浸入固定剂中间隔的时间尽量缩短，以减少因污染出现假阳性或因组织自溶释放RNA酶而破坏RNA导致假阴性（参见“3.2.1 标本处理过程”）。从而本领域技术人员为了保持样本的组织结构和核酸的完整性，有动机直接在鱼体上选取部位切入合适大小的方块，并马上将4%多聚甲醛注入到切口周围进行固定，然后再滴加4%多聚甲醛到所述方块皮肤表面进行固定，而且固定时间也是本领域技术人员根据需要可以常规确定的。综上，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的常规技术获得权利要求1所要求保护的技术方案，对本领域的技术人员来说是显而易见的，因此权利要求1所要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
复审请求人于2019 年09 月02 日提交了意见陈述书，但未修改申请文件。复审请求人认为：（1）虽然去掉粘液是本领域技术人员容易想到的，但目前的去除方法仅限于用水清洗或用刀刮，这些方法提取的RNA质量不高。而且实施例部分图2显示了采用1×PBS缓冲液清洗所取得的效果。（2）对比文件2将标本加入4%多聚甲醛溶液中是为了防止样本中的RNA酶破坏RNA的完整性，而本发明在切口周围加入4%多聚甲醛溶液，是为了肌肉组织硬化，便于剥离皮肤组织，此时样本并没有脱离鱼体，不存在RNA酶破坏RNA的完整性的问题。复审通知书中指出的“本领域公知，固定剂的硬化作用能使柔软组织的质地变硬而便于操作”，是指将柔软组织通过加入固定剂硬化而便于操作，其操作对象是柔软组织，而本申请的操作对象是皮肤组织，并非使用4%多聚甲醛溶液固定对象。因此，对比文件2和公知常识也没有公开本申请的技术方案。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
由于复审请求人复审阶段没有提交修改的申请文件，因此，本复审请求审查决定所针对的文本同驳回决定针对的文本，即：申请日2015年05月26日提交的说明书摘要、摘要附图、说明书第1-45段（即第1-6页）和说明书附图图1-图2（即第1页），以及2017年09月06日提交的权利要求第1项。
专利法第22条第3款
根据该款规定，评价一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别技术特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示。如果现有技术中存在这种启示，并且所获得的发明的技术效果是可以预料的，则该发明不具备创造性。
本案中，权利要求1请求保护一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法，其特征在于它包括以下步骤
(1)首先用1×PBS缓冲液清洗刚刚死亡的半滑舌鳎鱼体表面，去除皮肤表面覆盖的粘液；
(2)在选取的皮肤部位，利用解剖刀切入深度为1.8-3.0mm方块，所述方块面积大约为0.25-4cm2，且不要脱离鱼体；
(3)利用移液枪向步骤(2)中1.8-3.0mm深的方块四周裂口处注满4％(g/100ml)多聚甲醛溶液，固定处理1min-4min；
(4)然后吸取4％(g/100ml)多聚甲醛溶液滴加到所处理的方块皮肤表面，固定处理30s-1min；
(5)选取方块的一角，用镊子直接撕取该组织块表面皮肤，获取的皮肤组织能够直接用于RNA的提取或冷冻保存。
对比文件1公开了半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA 克隆及表达分析，并具体公开了如下技术特征：半滑舌鳎取自于山东海阳国家863计划海水养殖种子资源北方基地，分别取二龄鱼脑、性腺、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、皮肤、心肌、肠、头肾、鳃、皮肤、小肠和眼后立即投入液氮保存，随后转于－80℃低温冰箱保存以用于组织RNA提取（参见“1.1 组织制备、RNA和DNA提取”）。权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，其区别技术特征在于：①权利要求1限定了从刚刚死亡的半滑舌鳎切取皮肤组织；②权利要求1限定了采用PBS缓冲液清洗鱼体表面；③权利要求1限定了直接在鱼体上选取的皮肤部位切入深度为1.8-3.0mm、面积为0.25-4cm2的方块，并采用多聚甲醛对切块四周裂口处和切块表面皮肤先后进行固定化处理。基于上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题是如何改善半滑舌鳎的皮肤组织不易剥离难以获得高质量皮肤组织RNA的问题。
对于区别技术特征①，对比文件1公开了可以从半滑舌鳎的皮肤组织提取RNA，而刚刚死亡的半滑舌鳎的组织材料新鲜，适合用于提取RNA，从而本领域技术人员能常规选择刚刚死亡的半滑舌鳎用于提取RNA；
对于区别技术特征②，由于半滑舌鳎鱼体表面存在粘液，实际操作中容易滑动，因此，在处理之前采用PBS清洗以去除表面粘液是本领域技术人员容易想到的；
对于区别技术特征③，对比文件2公开了标本固定对组织总RNA和病毒RNA的影响，并具体公开了采用4%多聚甲醛溶液对RNA提取样本进行固定处理（参见“3.1.1 醛类固定剂固定方式对RNA的影响”），可见，对比文件2给出了采用4% 多聚甲醛固定RNA提取样品的启示。而且对比文件2还公开了标本的采集、固定和贮存均影响标本组织结构、抗原及其核酸的完整性（参见引言），从组织切除到浸入固定剂中间隔的时间尽量缩短，以减少因污染出现假阳性或因组织自溶释放RNA酶而破坏RNA导致假阴性（参见“3.2.1 标本处理过程”）。同时基于半滑舌鳎的皮肤组织不易剥离的特点，本领域技术人员为了保持样本的组织结构和核酸的完整性，有动机直接在鱼体上选取部位切入合适大小的方块，并马上将4%多聚甲醛注入到切口周围进行固定，然后再滴加4%多聚甲醛到所述方块皮肤表面进行固定，接着用镊子直接撕取该方块的表面皮肤并用于后续的操作，而且固定时间也是本领域技术人员根据需要可以常规确定的。
综上，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的常规技术获得权利要求1所要求保护的技术方案，对本领域的技术人员来说是显而易见的，因此权利要求1所要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
针对复审请求人的意见陈述，合议组认为：（1）半滑舌鳎鱼体表面存在粘液，实际操作中容易滑动，从而在处理之前去掉其表面存在的粘液是本领域技术人员容易想到的，1 X PBS缓冲液是本领域常见的清洗缓冲液，而且本领域技术人员能根据实际清洗后的粘液去除效果选择合适的清洗缓冲液如1 X PBS缓冲液。而本申请说明书附图图2所示的结果也只能证实使用本申请所述的方法也即包括PBS清洗、多聚甲醛固定等所有步骤组合在一起的技术效果，并不是单独采用1 X PBS缓冲液清洗后的技术效果，即本申请也没有证据表明采用1 X PBS缓冲液清洗取得了预料不到的技术效果。（2）对比文件2公开了标本的采集、固定和贮存均影响标本组织结构、抗原及其核酸的完整性（参见引言），从组织切除到浸入固定剂中间隔的时间尽量缩短，以减少因污染出现假阳性或因组织自溶释放RNA酶而破坏RNA导致假阴性（参见“3.2.1 标本处理过程”）。本申请分离的皮肤组织是用于RNA提取，从而本领域技术人员为了保持样本的组织结构和核酸的完整性，有动机尽量缩短从组织切除到浸入固定剂中间隔的时间而直接在鱼体上选取部位切入合适大小的方块，并马上将多聚甲醛注入到切口周围进行固定，再滴加多聚甲醛到所述方块皮肤表面进行固定。而皮肤组织容易剥离的技术效果是在解决上述技术问题时附带的技术效果，况且，本领域公知，固定剂的硬化作用能使柔软组织的质地变硬而易于操作（参见来茂德主编，病理学高级教程 精装珍藏本，人民军医出版社，2015年02月，第723页）。皮肤组织下面的肌肉组织和皮肤组织也都存在因柔软而不易操作的问题，经过切口周围注满多聚甲醛进行固定和皮肤表面滴加多聚甲醛进行固定以后，皮肤组织下面的肌肉组织和皮肤组织都变硬，从而本领域技术人员也可以预期经过这样固定化处理后的皮肤组织能比较容易地从鱼体撕离下来，而且不会带有肌肉组织。因此，复审请求人的意见陈述不具备说服力。
基于上述事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018 年02月26日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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