发明创造名称：一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法
外观设计名称：
决定号：197550
决定日：2019-12-06
委内编号：1F280919
优先权日：
申请（专利）号：201610700170.X
申请日：2016-08-22
复审请求人：武汉采思生物科技有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：王丽华
合议组组长：杨冀川
参审员：胡晓佳
国际分类号：G01N33/68，G01N21/64
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求与作为最接近现有技术的对比文件之间存在区别技术特征，而没有其他现有技术证据公开该区别技术特征，也没有证据证明该区别技术特征是所属技术领域的公知常识，则该权利要求相对于上述对比文件具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610700170.X，名称为“一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法”的发明专利申请。本申请的申请人为武汉采思生物科技有限公司，申请日为2016年08月22日，公开日为2017年02月08日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2019年01月11日发出驳回决定，驳回了本发明专利申请，其理由是：权利要求1-2不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。其中引用了以下1篇对比文件：
对比文件1：Changfeng Zhu等，“Single-Layer MoS2-Based Nanoprobes for Homogeneous Detection of Biomolecules”， JACS，第135卷第16期，第5998–6001页，公开日期为2013年04月09日。
驳回决定所依据的文本为申请日2016年08月22日提交的说明书摘要、摘要附图、说明书第1-50段、说明书附图图1-图5；2018年08月21日提交的权利要求第1-2项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、使用荧光分子对具有特定序列的胶原多肽进行修饰，得到探针多肽，并配制一定浓度的探针多肽溶液；
步骤二、将一定体积、同一浓度的所述探针多肽溶液分别加入到不同浓度的二硫化物纳米材料溶液中，在一定的激发波长下，检测各溶液的荧光强度，并根据所述荧光强度确定荧光猝灭效果观测最佳时二硫化物纳米材料溶液的浓度，将该浓度的二硫化物纳米材料溶液作为标准溶液，所述二硫化物纳米材料溶液的浓度为5～87μg/mL，所述二硫化物纳米材料为二硫化钨、二硫化钼中的一种；以及
步骤三、将一定体积和已知浓度的探针多肽溶液分别与不同浓度的待测多肽进行预混，预混时间为24hrs，得到多个待测溶液，将一定体积的所述多个待测溶液分别滴加至与步骤二相同体积的标准溶液中，孵育3～250min后，得到混合溶液，检测各混合溶液的荧光强度，若随着待测多肽浓度的增加，混合溶液的荧光强度增强，那么待测溶液中的探针多肽与待测多肽生成了胶原蛋白三重螺旋结构；
其中，步骤一所述的探针多肽是将氨基酸序列为G(PRGPOG)5的多肽的N端用羧基荧光素进行修饰，用液相色谱进行纯化，得到探针多肽FAM-G(PRGPOG)5。
2. 如权利要求1所述的利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法，其特征在于，所述二硫化物纳米材料是采用水热法制备的纳米层状结构的二硫化物纳米材料。”
驳回决定主要认为：1、权利要求1和对比文件1的区别在于：（1）检测对象有所不同，因而相应使用的探针和待测物有所不同，权利要求1是基于二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构，相应使用的探针是用荧光分子进行修饰过的具有特定序列的胶原多肽，待测物是多肽，检测的探针多肽与待测多肽是否生成了胶原蛋白三重螺旋结构；对比文件1公开的是基于二硫化物纳米材料检测DNA双螺旋结构，使用的探针是用荧光分子FAM进行修饰过的具有特定序列的单链DNA，待测物是DNA分子，检测的是探针DNA与待测目标DNA是否形成双螺旋结构；（2）方法有所不同，具体体现在权利要求1限定了确定二硫化物纳米材料溶液的浓度（标准溶液）的方法，二硫化物纳米材料的浓度、使用的体积、预混和孵育时间等参数，并具体限定了所述的探针多肽是将氨基酸序列为G(PRGPOG)5的多肽的N端用羧基荧光素进行修饰，用液相色谱进行纯化得到。对于区别技术特征（1），对比文件1明确公开了基于二硫化钼纳米片和荧光共振能量转移对DNA双螺旋结构进行检测的技术方案，且对比文件1还公开了除检测DNA分子杂交外，基于适配体-目标分子识别的检测模式也拓宽了本发明的可检测对象；据此，本领域技术人员能够预见到对比文件1公开的方法可转用于胶原蛋白三重螺旋结构的检测，不需要克服技术障碍，只需将探针替换为用荧光分子修饰过的具有特定序列的胶原多肽，将待测物替换为待测多肽溶液，即可实现胶原蛋白三重螺旋结构的检测。对于区别技术特征（2），参数的优化和调整中本领域技术人员通过有限的试验即可得到最佳的效果参数，无需付出创造性劳动。而胶原蛋白的结构特征和氨基酸组成是本领域的公知常识，本领域技术人员也知晓制备检测探针的基本原理和方法，本领域技术人员能够根据实际检测需要确定探针多肽的氨基酸组成。至于FAM的修饰、二硫化钨材料均为本领域的常规技术手段。因此，权利要求1相对于对比文件1和常规技术手段的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、从属权利要求2所限定的附加技术特征是本领域的常规技术手段，因此，也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人武汉采思生物科技有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2019年04月26日向国家知识产权局提出了复审请求，同时修改了权利要求书，将驳回决定所针对的权利要求1和2合并形成新的权利要求书。复审请求时新修改的权利要求书如下：
“1. 一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、使用荧光分子对具有特定序列的胶原多肽进行修饰，得到探针多肽，并配制一定浓度的探针多肽溶液；
步骤二、将一定体积、同一浓度的所述探针多肽溶液分别加入到不同浓度的二硫化物纳米材料溶液中，在一定的激发波长下，检测各溶液的荧光强度，并根据所述荧光强度确定荧光猝灭效果观测最佳时二硫化物纳米材料溶液的浓度，将该浓度的二硫化物纳米材料溶液作为标准溶液，所述二硫化物纳米材料溶液的浓度为5～87μg/mL，所述二硫化物纳米材料为二硫化钨、二硫化钼中的一种；以及
步骤三、将一定体积和已知浓度的探针多肽溶液分别与不同浓度的待测多肽进行预混，预混时间为24hrs，得到多个待测溶液，将一定体积的所述多个待测溶液分别滴加至与步骤二相同体积的标准溶液中，孵育3～250min后，得到混合溶液，检测各混合溶液的荧光强度，若随着待测多肽浓度的增加，混合溶液的荧光强度增强，那么待测溶液中的探针多肽与待测多肽生成了胶原蛋白三重螺旋结构；
其中，步骤一所述的探针多肽是将氨基酸序列为G(PRGPOG)5的多肽的N端用羧基荧光素进行修饰，用液相色谱进行纯化，得到探针多肽FAM-G(PRGPOG)5；
所述二硫化物纳米材料是采用水热法制备的纳米层状结构的二硫化物纳米材料。”
复审请求人认为：1、本申请核心在于，二硫化钨或二硫化钼纳米材料对精氨酸有很强的结合能力，导致富含精氨酸的多肽荧光探针吸附到它们表面，从而造成荧光淬灭；当富含精氨酸的多肽探针和靶标胶原多肽结合形成三重螺旋结构以后，多肽探针与二硫化钨或二硫化钼纳米材料的结合能力被削弱，脱离其表面，从而导致荧光恢复。因此，二硫化钨或二硫化钼纳米材料和富含精氨酸的多肽荧光探针的平台，可以用来检测胶原蛋白三重螺旋结构。而对比文件1的检测原理在于，二硫化钼纳米材料因为碱基和基面的范德华力作用对单链DNA有很强的结合能力，导致荧光标记的单链DNA探针分子荧光淬灭；但是当单链DNA和靶标DNA分子形成双链结构以后，碱基和基面的范德华力作用被削弱，导致双链DNA和二硫化钼纳米材料的结合能力很弱，荧光标记的单链DNA脱离二硫化钼纳米材料表面，从而实现探针分子的荧光恢复。利用小分子和单链DNA探针结合后形成的复合物结构同样的削弱了二硫化钼纳米材料对单链DNA探针的结合能力，二硫化钼纳米材料和单链DNA探针的平台可以用来检测小分子。可见对比文件1的单链DNA探针和和本申请的富含精氨酸的多肽探针性质完全不同。2、本申请主要涉及二硫化钨纳米材料，对比文件1中完全没有涉及二硫化钨纳米材料。3、本申请的二硫化物纳米材料-探针多肽平台用于高灵敏、特异性地识别探针多肽与待测多肽形成的胶原蛋白三重螺旋结构，具有灵敏度高，特异性强的优点，同时也可以对nM级别的胶原蛋白三重螺旋结构进行检测，并可以实现复杂生物体系中样品的检测，具有操作简单、检测方便、成本低廉、灵敏度高、用样量少的优点。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年05月07日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：（1）对比文件1与本发明的构思是相同的，均是基于二硫化钼纳米片和荧光共振能量转移对能够形成螺旋结构的分子进行检测，且对比文件1还公开了除检测DNA分子杂交外，基于适配体-目标分子识别的检测模式也拓宽了本发明的可检测对象。虽然蛋白质与DNA的性质不完全相同，但本领域技术人员周知，含有巯基和氨基的寡聚核苷酸或氨基酸均能修饰到纳米材料表面，这是纳米材料功能化的普遍共性。也就是说，DNA和胶原蛋白均能吸附到二硫化钼纳米材料上导致荧光淬灭，且胶原蛋白Gly-X-Y肽段的重复出现使得胶原二级结构呈现特征性的聚脯氨酸Ⅱ型(P2)结构，P2结构进一步形成稳定的三螺旋结构，这是胶原蛋白区别于其他蛋白质的特征性结构心，这是本领域的公知常识。在此基础上，本领域技术人员能够预见到对比文件1公开的方法也可转用于胶原蛋白三重螺旋结构的检测，不需要克服技术障碍，只需将探针替换为用荧光分子修饰过的具有特定序列的胶原多肽，将待测物替换为待测多肽溶液，即可实现胶原蛋白三重螺旋结构的检测，这对本领域技术人员而言是显而易见的，无需付出创造性劳动；（2）权利要求中对二硫化物纳米材料作了进一步限定，为二硫化钨、二硫化钼中的一种，对比文件1公开的是二硫化钼，也就是说权利要求中的二硫化物纳米材料已被对比文件1公开，而二硫化钨纳米材料是一种可选的并列技术方案，其也是本领域常用的二硫化物纳米材料，本领域技术人员可以自行选择，且未达到预料不到的技术效果；（3）检测灵敏度很大程度上是由检测方法本身决定的，nM级别的检测灵敏度是对比文件1公开的检测方法本身所能达到的可预期的灵敏度级别。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，依法作出审查决定。
决定的理由
（一）审查文本的认定
在复审程序中，复审请求人于2019年04月26日提交了最终的权利要求书全文修改替换页，经审查，所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审决定以复审请求人于2019年04月26日提交的权利要求第1项；2016年08月22日提交的说明书摘要、摘要附图、说明书第1-50段、说明书附图图1-图5为基础做出。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果权利要求与作为最接近现有技术的对比文件之间存在区别技术特征，而没有其他现有技术证据公开该区别技术特征，也没有证据证明该区别技术特征是所属技术领域的公知常识，则该权利要求相对于上述对比文件具备创造性。
具体到本案，
1、独立权利要求1请求保护一种利用二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三重螺旋结构的方法，对比文件1（参见第5998页右栏第12行至第6000页左栏最后一行，以及scheme 1）公开了一种利用单层二硫化钼纳米探针均相检测生物分子的方法：将二硫化钼纳米片与荧光FAM标记的单链DNA（P1）混合，在P1与二硫化钼纳米片混合后，P1的荧光几乎被全部淬灭；将二硫化钼纳米片与P1、等量的与其互补配对的目标DNA T1混合形成P1/T1双螺旋时，荧光得到恢复；基于该检测方法能用于区分单链和双链DNA；具体检测如下：配制一定浓度（15nM）的荧光探针（P1），将其分别与不同浓度的待测目标DNA室温混合10分钟，再将混合溶液与二硫化钼溶液混合，随着T1浓度的增加，P1与T1杂交形成的双螺旋结构增加，荧光强度得到增强（参见第5998－5999页）。
独立权利要求1与对比文件1的区别在于：1）检测对象不同，由此采用的探针不同。即权利要求1采用的探针为FAM-G(PRGPOG)5，用于检测探针多肽与待测多肽是否生成了胶原蛋白三重螺旋结构；对比文件1采用FAM修饰的具有特定序列的单链DNA，用于检测探针DNA与待测目标DNA是否形成双螺旋结构。2）独立权利要求1中限定了具体的检测参数和步骤，包括二硫化物纳米材料溶液的浓度、孵育时间、预混时间、混合溶液的制备、以及二硫化物纳米材料的制备方法等。基于此，权利要求1实际解决的技术问题是将DNA的二硫化物纳米材料检测平台用于胶原蛋白三重螺旋结构的检测。
对于上述区别技术特征1），对比文件1公开了二硫化钼纳米层具有强荧光淬灭性能，其可以作为检测DNA检测平台。同时提示了，在此基础上本领域技术人员可以利用二硫化钼纳米层去检测本领域技术人员熟知的其它小分子。但是，本领域技术人员能否将对比文件1的检测平台无需创造性劳动地通过改变探针而扩充至其他检测对象，如本申请的胶原蛋白三重螺旋结构，在没有其他对比文件证据的情况下，需要综合考虑其他现有技术的教导和本领域技术人员的能力。
首先，从探针本身特点分析，对比文件1中的DNA探针与本申请中形成胶原蛋白三重螺旋结构的多肽探针并不属于相同或相近类型的探针，一种是以碱基为单位的核酸探针，一种是以氨基酸为单位的多肽探针。核酸探针通过核酸结合所特有的碱基互补配对原则被认为是符合“适配体-目标分子”的识别模式，而本申请形成胶原蛋白三重螺旋结构的多肽探针并不适用上述核酸探针的结合原则，同时也没有现有技术证据证明其符合“适配体-目标分子”的识别模式，显然驳回决定中关于“由于识别模式相同而推定本领域技术人员容易想到使用蛋白质多肽探针”这样的推论并不合理。
其次，从探针的具体结构分析，即便认为胶原蛋白的三螺旋结构符合探针体系的要求，那么仍然需要具体选择适当的探针多肽才能保证检测的进行。根据本申请的技术方案，该检测方法的实施必须选择合适的探针：第一，与荧光基团结合的多肽探针必须和二硫化物纳米材料层具有良好的结合能力，以保证探针上的荧光基团发生荧光淬灭；第二，该多肽探针与待测分子具有更强的结合能力并且形成三重螺旋结构，使得多肽探针脱离二硫化物纳米材料层，与待测分子结合形成稳定的空间构象从而恢复荧光。由此，所述二硫化物纳米材料层才能作为检测平台。
在本申请中采用G(PRGPOG)5作为探针多肽，该探针多肽具有五个重复单元的PRGPOG（Pro-Arg-Gly-Pro-Hyp-Gly）。如复审请求人所述，二硫化钨或二硫化钼纳米材料对精氨酸（Arg）有很强的结合能力，导致富含精氨酸的多肽荧光探针吸附到它们表面，从而荧光淬灭；当富含精氨酸的多肽探针和靶标胶原多肽结合形成三重螺旋结构以后，多肽探针与二硫化钨或二硫化钼纳米材料的结合能力被削弱，脱离其表面，从而导致荧光恢复。由此可知，并不是任何能够与待测胶原多肽形成三重螺旋结构的多肽均可以用于本申请。申请人在选择合适的探针多肽的过程中，需要对各种氨基酸以及不同的氨基酸组合与二硫化物纳米材料的结合能力进行分析和对比；同时还需要考虑该探针多肽能否与待测的胶原多肽形成三重螺旋结构、以及能否发生荧光的淬灭和恢复。综合考虑上述因素，对比文件1并没有公开该探针多肽的选择和设计，也没有充足的证据表明其是本领域的公知常识。
对于区别特征2），选择了特定的探针多肽之后，可以对反应参数和步骤进行优化，例如二硫化物纳米材料溶液的浓度、孵育时间、预混时间、混合溶液的制备、以及二硫化物纳米材料的制备方法等，由此来实现高灵敏、特异性地识别探针多肽与待测多肽形成的胶原蛋白三重螺旋结构，即本申请相对于现有技术取得了较好的技术效果。
综上所述，对于本领域技术人员来说，即使结合本领域的公知常识，在对比文件1的基础上得到权利要求1的技术方案不是显而易见的，权利要求1相对于对比文件1具有突出的实质性特点和显著的进步，具备专利法第22条第3款规定的创造性。
针对前置审查意见，合议组认为：
（1）对比文件1和本申请都是基于二硫化钼纳米片和荧光共振能量转移对能够形成螺旋结构的分子进行检测，胶原蛋白的三重螺旋结构也是本领域的公知常识，但是这并不意味着所有采用类似检测原理的技术方案都不具备创造性。
正如上文所述，本申请中现有技术中并不能证明用多肽探针形成胶原蛋白三重螺旋结构与对比文件1中特异性DNA探针的作用模式相同，也没有证据证明形成胶原蛋白三重螺旋结构符合生物检测实验中常用的“适配体-目标分子”特异性结合模式，如类似“抗原-抗体”的特异性结合；同时，即使本领域技术人员想到将形成三重螺旋结构用于胶原蛋白的检测中，其仍然面临选择具体的探针的问题。不仅要求该探针多肽能够与待测的胶原多肽形成三重螺旋结构，还需要具有适合用于该二硫化物纳米层检测平台的特性，例如与二硫化物纳米层的良好结合能力、与待测胶原多肽结合成三重螺旋结构从而恢复荧光的能力等等。
对比文件1的检测原理是基于二硫化钨纳米材料层通过碱基和基面的范德华力作用对单链DNA有很强的结合能力。但是，胶原多肽的检测探针以氨基酸为基本单元，与对比文件1的以碱基为基本单元的DNA不同。众所周知，氨基酸以及各种氨基酸的组合形式有很多种。要从众多的氨基酸以及氨基酸组合形成的多肽中选择适用于二硫化物纳米检测平台、与胶原多肽形成三重螺旋结构、形成三重螺旋结构后能够恢复荧光等的探针多肽需要付出创造性劳动，对比文件1并不存在相应的技术启示，也不能通过常规技术手段来实现。
（2）权利要求中对二硫化物纳米材料作了进一步限定，为二硫化钨、二硫化钼中的一种，对比文件1公开的是二硫化钼。二硫化钨纳米材料是一种可选的并列技术方案，其也是本领域常用的二硫化物纳米材料，本领域技术人员可以自行选择。
（3）基于上述第（1）点的评述，由于对比文件1并不存在着本申请中探针多肽的技术启示，也没有证据表明这是本领域的常规技术手段。选择了特定的探针多肽之后，可以对反应参数和步骤进行优化，由此来实现高灵敏、特异性地识别探针多肽与待测多肽形成的胶原蛋白三重螺旋结构，即本申请相对于现有技术取得了较好的技术效果。
因此，前置意见中关于发明构思、探针选择、二硫化钨纳米材料和效果等方面的论述并不能用于证明本申请有关探针的选择属于本领域的公知常识。
决定
撤销国家知识产权局于2019年01月11日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本决定所针对的文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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