发明创造名称：膜分选培养器、膜分选培养试剂盒、和使用其的干细胞分选方法、以及分离膜
外观设计名称：
决定号：196778
决定日：2019-12-05
委内编号：1F246606
优先权日：2011-03-30
申请（专利）号：201510071373.2
申请日：2012-03-30
复审请求人：国立研究开发法人国立长寿医疗研究中心 内帕基因株式会社
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：韩世炜
合议组组长：孙俊荣
参审员：李金光
国际分类号：C12M3/06,C12N5/074,C12N5/0775
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在发明所要求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征的情况下，如果现有技术中已经给出了将此区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，同时这种启示会使本领域的技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的发明，则发明是显而易见的，不具有突出的实质性特点。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510071373.2，名称为“膜分选培养器、膜分选培养试剂盒、和使用其的干细胞分选方法、以及分离膜”的发明专利申请。申请人于2018年09月10日由独立行政法人国立长寿医疗研究中心、东丽株式会社变更为国立研究开发法人国立长寿医疗研究中心、内帕基因株式会社。本申请的申请日为2012年03月30日，优先权日为2011年03月30日，公开日为2015年06月03日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年11月28日以权利要求1-20不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为2015年02月11日提交的说明书摘要、说明书第1-252段、摘要附图、说明书附图、说明书核苷酸和氨基酸序列表；2017年08月28日提交的权利要求第1-20项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 膜分选培养器，其含有上部结构体和下部结构体，
所述上部结构体由容器构成，该容器的底面的至少一部分用具有干细胞透过用孔的分离膜形成，
所述下部结构体由容器构成，该容器保持使所述上部结构体的膜浸渍于其中的流体；
所述分离膜具备基材膜和功能层，
所述基材膜由疏水性聚合物构成，
所述功能层是选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1种以上的亲水性聚合物通过共价键键合于所述基材膜的表面而成的功能层，所述亲水性聚合物是具有水溶性单元和酯基的共聚物，
构成所述功能层的亲水性聚合物的重量是所述分离膜总重量的1.5重量%至35重量%；
所述孔的尺寸是5μm～8μm，密度是1×105～4×106孔/cm2。
2. 权利要求1所述的膜分选培养器，其中，具备多个所述上部结构体，
并进一步含有框体，所述框体容纳于所述下部结构体中，且具备设置有将该多个上部结构体的各个固定的多个孔的板状构件。
3. 权利要求1所述的膜分选培养器，其中，具备多个所述上部结构体，
并进一步含有框体，所述框体容纳于所述下部结构体中，且具备设置有将该多个上部结构体的各个固定的多个孔的板状构件，
所述下部结构体由与所述该多个上部结构体的各个对应的多个容器构成。
4. 权利要求2或3所述的膜分选培养器，其中，所述多个上部结构体具有不同孔尺寸和/或不同孔密度的膜。
5. 权利要求1所述的膜分选培养器，其中，进一步含有盖状结构体，所述盖状结构体可覆设或密封所述上部结构体和下部结构体。
6. 权利要求5所述的膜分选培养器，其中，所述盖状结构体进一步含有气体交换装置，所述气体交换装置具备气体导入口和气体排出口。
7. 权利要求5或6所述的膜分选培养器，其中，所述盖状结构体的至少一部分是由具有孔尺寸1～100nm的孔的膜形成的。
8. 权利要求5或6所述的膜分选培养器，其中，在所述盖状结构体和所述下部结构体之间设置有密封用的弹性体。
9. 权利要求5或6所述的膜分选培养器，其中，进一步具备含有温度测定装置和温度调节装置的温度调节系统。
10. 权利要求5或6所述的膜分选培养器，其中，所述下部结构体进一步含有具备培养基导入口和培养基送出口的培养基交换系统。
11. 膜分选培养试剂盒，其含有权利要求1～10中任一项所述的膜分选培养器、和用于注入所述下部结构体的细胞迁移因子。
12. 权利要求11所述的试剂盒，其中，所述细胞迁移因子是选自SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、S1P、原儿茶酸和血清中的一种以上。
13. 权利要求11或12所述的试剂盒，其中，所述细胞迁移因子的浓度为1ng/ml～500ng/ml。
14. 权利要求11所述的试剂盒，其进一步含有用于注入所述下部结构体的血清，所述细胞迁移因子为G-CSF或bFGF。
15. 使用权利要求1～10中任一项所述的膜分选培养器的干细胞分选方法，其包括：
将样本细胞或样本组织接种于所述上部结构体的膜的步骤、
将含有细胞迁移因子的培养基填充于所述下部结构体的容器的步骤、和
使所述上部结构体的膜与所述下部结构体中的培养基接触的步骤。
16. 权利要求15所述的方法，其中，所述细胞迁移因子是选自SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、S1P、原儿茶酸和血清中的一种以上。
17. 权利要求15或16所述的方法，其中，所述细胞迁移因子的浓度为1ng/ml～500ng/ml。
18. 权利要求15或16所述的方法，其中，将所述样本细胞以相对于分离膜1mm2为3×102细胞～3×104细胞进行接种。
19. 权利要求15所述的干细胞分选方法，其中，所述干细胞为牙髓干细胞，所述细胞迁移因子为G-CSF或bFGF，所述G-CSF或bFGF的浓度为50～150ng/ml，将所述样本细胞以相对于分离膜1mm2为3×102～1.5×103细胞进行接种，或将所述样本组织以相对于分离膜1mm2为0.1mg～1mg进行静置，在所述含有细胞迁移因子的培养基中添加相对于该培养基的体积为5～20vol%的血清。
20. 权利要求15所述的干细胞分选方法，其中，所述干细胞为骨髄干细胞或脂肪干细胞，所述细胞迁移因子为G-CSF或bFGF，所述G-CSF或bFGF的浓度为50～150ng/ml，将所述样本细胞以相对于分离膜1mm2为3×102～1.5×103细胞进行接种，或将所述样本组织以相对于分离膜1mm2为0.1mg～1mg进行静置，在所述含有细胞迁移因子的培养基中添加相对于该培养基的体积为5～20vol%的血清。”
驳回决定认为：
权利要求1请求保护膜分选培养器。对比文件1（WO2010/069080A1，公开日2010年06月24日）公开了一种过滤装置（即膜分选培养器），其与对比文件1相比，区别技术特征为：权利要求1中的分离膜还具有功能层，且功能层是选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1种以上的亲水性聚合物通过共价键键合于基材膜的表面而成的功能层，还限定了孔的尺寸及密度，限定了亲水性聚合物的组成。基于上述区别技术特征，权利要求1的技术方案与对比文件1公开的内容相比，实际所要解决的技术问题是：提供一种避免分离膜分离效果下降的膜分选培养器。针对上述区别技术特征，对于功能层，对比文件2（US2011017654，公开日2011年01月27日）公开了一种分离膜，该分离膜的特征在于，在膜的一侧表面具有功能层，并且将酯基定位于分离膜功能层的表面。分离膜成型后，用含有酯基的反应性化合物对功能层表面进行化学修饰（改性），由此可以在功能层表面导入酯基。从抑制蛋白质或血小板的附着的观点考虑，分离膜除了含酯基的聚合物之外还含有水溶性聚合物。除了含酯基的聚合物之外，还含有比含酯基的聚合物亲水性强的水溶性聚合物时，蛋白质或血小板的附着抑制效果进一步提高。含酯基的聚合物应当是含有水溶性单元和酯基单元的共聚物（即亲水性聚合物是具有水溶性单元和酯基的共聚物），这样可以在单分子内达到亲水性和疏水性的平衡，水溶性单元包括乙烯基吡咯烷酮基团、乙二醇基团、乙烯醇基团等等（即亲水性聚合物可以是乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物、乙烯醇系聚合物）。水溶性聚合物选自聚乙烯基吡咯烷酮（乙烯基吡咯烷酮系聚合物的下位概念）、聚乙二醇（聚乙二醇系聚合物的下位概念）和聚乙烯醇（乙烯醇系聚合物的下位概念），水溶性聚合物键合于基材膜的表面形成功能层。功能层的水溶性聚合物的重量是分离膜总重量的10重量%至50重量%（参见说明书第[0034]段、[0041]-[0042]段、[0046]-[0056]段）。对比文件2中公开的功能膜可抑制蛋白质或培养基中的其它物质的黏附，从而避免了分离膜分离效果的下降（参见说明书第[0002]段和[0035]段），该功能层所起的作用与本申请相同，可见，在对比文件2的技术教导下，本领域技术人员在对比文件1的分离膜中增加含有选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物、乙烯醇系聚合物等的亲水性聚合物的功能层是显而易见的。进一步，对于功能层具体材料的选择，对比文件4（CN1546214A，公开日2004年11月17日）公开了一种聚合物分离膜亲水化及生物相容性改性方法，具体公开了（参见说明书第2页第2段-第3页第2段，实施例1-6）将疏水性聚合物分离膜表面结合亲水性聚合物聚乙烯基吡咯烷酮，经过处理后可改善分离膜的生物相溶性，抑制蛋白质或血小板吸附，与本申请作用相同，故在对比文件4的启示下，为了降低由于蛋白、细胞吸附而导致的膜分离效率下降的情况，同时简化分离膜的结构，本领域技术人员仅选用1种亲水性聚合物构成功能层是显而易见的。而且对比文件2已经公开了功能层的亲水性聚合物可包括乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物、乙烯醇系聚合物，选用大于1种亲水性聚合物构成功能层属于常规的技术手段，其技术效果也是可以预期的。而在对比文件2前述公开的功能层的水溶性聚合物的重量是分离膜总重量的10重量%至50重量%的基础上，本领域技术人员基于本领域普通技术知识并结合有限的实验即可确定亲水性聚合物占分离膜总重量的百分比，其效果可预期。此外，对比文件1还公开了滤膜的孔的尺寸可根据具体的需要合理变化，在一些实施例中，孔的尺寸可在5μm-100μm之间（该数值范围与5μm-8μm有共同的端点值5μm）（参见说明书第[00107]段）。而对于孔的密度，本领域常规使用的分离膜的孔密度为(1-6)×109/cm2（参见参考文献《树脂与塑料《化工百科全书》专业卷（上、下册）》，《化工百科全书》编辑委员会，第572-577页，3.分离膜的制备方法，公开日2003年12月31日），在此基础上，本领域技术人员可以结合具体孔的尺寸、待分选细胞的尺寸等因素合理调整具体孔的密度，且孔的密度的数值范围是本领域技术人员通过有限的试验容易得出的，其并未产生任何预料不到的技术效果。因此，本领域技术人员在对比文件1基础上结合对比文件2、4和本领域普通技术知识得到权利要求1的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。权利要求2-10的附加技术特征被对比文件1公开或属于本领域常规技术手段、常规选择，在权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2-10也不具备创造性。
权利要求11请求保护一种膜分选培养试剂盒。对于该权利要求中限定的细胞迁移因子，对比文件3（CN101970022A，公开日2011年02月09日）公开了使用SDF1、VEGF、GCSF、MMP3、Slit以及GMCSF中的至少一种细胞移动因子（即细胞迁移因子）来促进牙髓干细胞移动，从而促进牙髓再生（参见说明书第[0026]段），其所起的所用与本申请相同，可见，在对比文件3的启示下，为了促进干细胞的移动，本领域技术人员向下部结构体中注入细胞迁移因子，并将其与膜分选培养器共同使用，组成膜分选培养试剂盒是显而易见的。当权利要求1-10的膜分选培养器不具备创造性时，权利要求11的技术方案不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求12-14为权利要求11的从属权利要求，其附加技术特征被对比文件3公开或属于本领域常规选择，因此，当其引用的在前权利要求不具备创造性时，权利要求12-14的技术方案亦不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求15请求保护使用权利要求1-10中任一项所述的膜分选培养器的干细胞分选方法。对于该权利要求中限定的将含有细胞迁移因子的培养基填充于下部结构体的容器的步骤；使上部结构体的膜与下部结构体中的培养基接触的步骤，对比文件1还公开了：在一些实施例中，分选目标细胞群的方法还包括去除容器孔中的液体培养基，并向容器孔中加入第二容积的液体培养基（即将培养基填充于下部结构体的容器的步骤），且将滤孔放置于容器孔中（即使上部结构体的膜与下部结构体的培养基接触的步骤）（参见说明书第[0052]段）。此外，对比文件3公开了使用SDF1、VEGF、GCSF、MMP3、Slit以及GMCSF中的至少一种的细胞移动因子来促进牙髓干细胞移动，从而促进牙髓再生（参见说明书第[0026]段），其所起的所用与本申请相同，在其启示下，为了促进细胞的迁移，本领域技术人员在下部结构体的培养基中加入细胞迁移因子是显而易见的。因此，在权利要求1-10的膜分选培养器不具备创造性的基础上，权利要求15的技术方案不具备专利法第22条第3款规定的创造性。从属权利要求16-20的附加技术特征被对比文件3公开或通过本领域常规手段容易确定，在权利要求15不具备创造性的基础上，权利要求16-20也不具备创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2018年03月13日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。复审请求人认为：1）本申请权利要求1中所述的亲水性聚合物被限定为相对于20℃的水100g的溶解度为1g 以上，优选为10g 以上的水溶性聚合物（参见本申请说明书0154-0156 段），是指特定的水溶性聚合物，而对比文件2中记载的“相对于20℃的水100g 的溶解度为1g 以上，优选为10g以上的水溶性聚合物”相当于本申请发明的亲水性聚合物，对比文件2中完全没有记载或暗示追加仅含有聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇等水溶性聚合物的功能层能够实现蛋白质和血小板的附着抑制。2）对比文件2的表1所示的效果是含酯基的聚合物和水溶性聚合物这两者所致的效果，其比较例2中，仅含PVP（聚乙烯吡咯烷酮）的功能层的情形中，蛋白质和血小板的附着抑制效果明显要差。3）对比文件2中并未公开孔的尺寸和密度的具体数值范围。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月23日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：1）从说明书记载的内容仅能说明权利要求1中组成功能层的聚合物为亲水性聚合物，并不能认定权利要求1中所述的亲水性聚合物就是特定的水溶性聚合物；对比文件2公开了使用100%亲水性聚合物来形成功能层的技术手段；在对比文件2、4的教导下，本领域技术人员有动机使用100%的特定亲水性聚合物作为功能层。2）对比文件2的表1所示的VA64功能层的效果均是含水溶性聚合物的功能层所致的结果，而不是含酯基的聚合物和水溶性聚合物两者所致的效果；对比文件2的比较例2中，仅含PVP的功能层的蛋白质附着抑制效果并没有变差，只是血小板的附着抑制效果较差。3）如第二、三次审查意见通知书中的评述，孔的尺寸和密度并不能给本申请带来创造性。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年04月30日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1相比，区别技术特征为：权利要求1中的分离膜还具有功能层，且功能层是选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1种以上的亲水性聚合物通过共价键键合于基材膜的表面而成的功能层，所述亲水性聚合物是具有水溶性单元和酯基的共聚物，构成所述功能层的亲水性聚合物的重量是所述分离膜总重量的1.5重量%至35重量%，还限定了孔的尺寸及密度。根据本申请说明书第[0154]段的记载，构成这些基材膜的聚合物一般疏水性强，具有大量附着蛋白质和细胞等的倾向。特别是由于活化的蛋白质或血小板、附着性细胞容易附着于膜表面，因而得到的结论是需要均匀地实施一定量以上的表面改性、即亲水性聚合物的共价键合。基于上述区别技术特征及本申请记载的效果，权利要求1相对于对比文件1实际所要解决的技术问题是：提供一种含有比基材膜的分选效果更好的分离膜的膜分选培养器。针对上述区别技术特征，对比文件2公开了一种分离膜，该分离膜的特征在于，在膜的一侧表面具有功能层，并且将酯基定位于分离膜功能层的表面（参见第[0034]段）。涂布通过放射线或热处理使分离膜交联，这是用于抑制含酯基的聚合物洗脱的优选方法（参见第[0046]段，相当于通过共价键键合于所述基材膜的表面形成功能层）。从抑制蛋白质或血小板的附着的观点考虑，分离膜除了含酯基的聚合物之外还含有在20℃的100g水中的溶解度为1g以上、优选为10g以上的水溶性聚合物。一般认为表面的亲水性和疏水性的适度平衡对抑制蛋白质或血小析的附着可能是重要的。实际上，除了含酯基的聚合物之外，还含有比含酯基的聚合物亲水性强的水溶性聚合物时，蛋白质或血小板的附着抑制效果进一步提高（参见第[0052]段）。作为含有酯基的聚合物……优选乙酸乙烯酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯等在侧链中含有酯基的物质。其中，乙酸乙烯酯在对蛋白质或血小板的附着的抑制性方面优异（参见第[0042]段）。含酯基的聚合物应当是含有水溶性单元和酯基单元的共聚物，这样可以在单分子内达到亲水性和疏水性的平衡，水溶性单元包括乙烯基吡咯烷酮基团、乙二醇基团、乙烯醇基团等等，特别是乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯的共聚物具有亲水性和疏水性的平衡，故优选使用（参见第[0053]段）。作为分离膜中含有的水溶性聚合物的量优选在0.1重量%或1重量%以上，由于含量过高时存在膜性能降低的趋势，所以优选为30重量%或10重量%以下（参见第[0052]段）。因此，对比文件2中公开的含酯基的聚合物与本申请的亲水性聚合物均为水溶性单元和酯基的共聚物，乙烯基吡咯烷酮基团、乙二醇基团、乙烯醇基团与酯基单元的共聚物（例如乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯的共聚物）即为权利要求1所限定的乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物，且均具有蛋白质或血小板的附着的作用，本领域技术人员有动机在对比文件1的基础上在基质膜表面增加所述重量百分比的功能层。此外，对比文件1还公开了滤膜的孔的尺寸可根据具体的需要合理变化，在一些实施例中，孔的尺寸可在5μm-100μm之间（参见说明书第[0107]段）。而对于孔的密度，本领域技术人员可以结合具体孔的尺寸、待分选细胞的尺寸等因素合理调整具体孔的密度，且孔的密度的数值范围是本领域技术人员通过有限的试验容易得出的，其并未产生任何预料不到的技术效果。因此，本领域技术人员在对比文件1基础上结合对比文件2和本领域普通技术知识得到权利要求1的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。从属权利要求2-10的附加技术特征被对比文件1公开或属于本领域常规技术手段、常规选择，在权利要求1不具备创造性基础上，从属权利要求2-10也不具备创造性。
权利要求11请求保护一种膜分选培养试剂盒，其含有权利要求1～10中任一项所述的膜分选培养器、和用于注入所述下部结构体的细胞迁移因子。对比文件3公开了使用SDF1、VEGF、GCSF、MMP3、Slit以及GMCSF中的至少一种细胞移动因子（即细胞迁移因子）来促进牙髓干细胞移动，从而促进牙髓再生（参见说明书第[0026]段），其所起的所用与本申请相同。在对比文件3的启示下，为了促进干细胞的移动，本领域技术人员向下部结构体中注入细胞迁移因子，并将其与膜分选培养器共同使用，组成膜分选培养试剂盒是显而易见的。在权利要求1-10的膜分选培养器不具备创造性的基础上，权利要求11的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。从属权利要求12-14的附加技术特征被对比文件3公开或属于本领域常规选择，因此，当权利要求11不具备创造性时，权利要求12-14的技术方案亦不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求15请求保护使用权利要求1-10中任一项所述的膜分选培养器的干细胞分选方法。对于该权利要求中限定的将含有细胞迁移因子的培养基填充于下部结构体的容器的步骤；使上部结构体的膜与下部结构体中的培养基接触的步骤，对比文件1还公开了：在一些实施例中，分选目标细胞群的方法还包括去除容器孔中的液体培养基，并向容器孔中加入第二容积的液体培养基（即将培养基填充于下部结构体的容器的步骤），且将滤孔放置于容器孔中（即使上部结构体的膜与下部结构体的培养基接触的步骤）（参见说明书第[0052]段）。此外，对比文件3公开了使用SDF1、VEGF、GCSF、MMP3、Slit以及GMCSF中的至少一种的细胞移动因子来促进牙髓干细胞移动，从而促进牙髓再生（参见说明书第[0026]段），其所起的所用与本申请相同，在其启示下，为了促进细胞的迁移，本领域技术人员在下部结构体的培养基中加入细胞迁移因子是显而易见的。因此，在权利要求1-10的膜分选培养器不具备创造性的基础上，权利要求15的技术方案不具备专利法第22条第3款规定的创造性。从属权利要求16-20的附加技术特征被对比文件3公开或通过本领域常规手段容易确定，在权利要求15不具备创造性的基础上，权利要求16-20也不具备创造性。
对于复审请求人的复审理由，复审通知书中指出，（1）首先，本申请说明书第0156段记载的是“水溶性的聚合物”的溶解度，而非亲水性聚合物的溶解度，这与对比文件2的记载的水溶性聚合物是一致的；其次，本申请说明书第0155段记载了“乙烯基吡咯烷酮系聚合物是指选自聚乙烯基吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮?乙酸乙烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮?乙烯醇共聚物、乙烯基吡咯烷酮?苯乙烯共聚物、乙烯基吡咯烷酮?二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯共聚物和它们的改性聚合物中的聚合物，乙二醇系聚合物也包括侧链含酯基的那些。乙烯醇系聚合物可根据皂化度而获得各种种类，并无限定”，说明本申请权利要求1中记载的“选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的亲水性聚合物”也并不限于仅含有聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇等水溶性聚合物，而是也可以含有酯基的聚合物，这与权利要求1本身限定的“亲水性聚合物是具有水溶性单元和酯基的共聚物”以及对比文件2公开的“含酯基的聚合物应当是含有水溶性单元和酯基单元的共聚物”一致；对比文件2与本申请实施例中均使用了乙烯基吡咯烷酮/ 乙酸乙烯酯（6/4）共聚物（BASF社制、“Kollidon VA64”。可见，对比文件2公开的含酯基聚合物即相当于本申请权利要求1所限定的亲水性聚合物。（2）本申请以及对比文件2均验证了含酯基的亲水性聚合物效果好于不含酯基的，这也与两者在说明书中对酯基作用的描述一致。即使复审请求人将权利要求1明确限定为不含酯基，由于对比文件2也公开了含酯基的聚合物和仅含水溶性聚合物的对比例，限定后的权利要求也不具备创造性。（3）如前所述，对比文件1已公开了孔的尺寸范围，本领域技术人员可根据需要选择适当的孔密度，本申请也未证明所述参数限定取得了预料不到的技术效果。综上，复审请求人的理由不具备说服力。
复审请求人于2019年08月15日提交了意见陈述书和修改的权利要求书（共20项），其中在权利要求1中限定孔密度是“1×105～2×105孔/cm2，分离膜的厚度为10～100μm。修改后的权利要求1如下：
“1. 膜分选培养器，其含有上部结构体和下部结构体，
所述上部结构体由容器构成，该容器的底面的至少一部分用具有干细胞透过用孔的分离膜形成，
所述下部结构体由容器构成，该容器保持使所述上部结构体的膜浸渍于其中的流体；
所述分离膜具备基材膜和功能层，
所述基材膜由疏水性聚合物构成，
所述功能层是选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1种以上的亲水性聚合物通过共价键键合于所述基材膜的表面而成的功能层，所述亲水性聚合物是具有水溶性单元和酯基的共聚物，
构成所述功能层的亲水性聚合物的重量是所述分离膜总重量的1.5重量%至35重量%；
所述孔的尺寸是5μm～8μm，密度是1×105～2×105孔/cm2；
所述分离膜的厚度为10～100μm。”
复审请求人认为：（1）尽管对比文件2和本申请均使用了VA64，但是对比文件2根本没有记载或暗示如本申请发明那样仅以特定的亲水性聚合物来构成功能层的技术方案。如对比文件2的说明书0049-0051段记载，对比文件2中以酯基的存在量相对于分离膜功能层表面的聚砜的存在量的比值作为显示酯基存在量的指标。因此，对比文件2的功能层中并不是仅存在VA64，对比文件2还教导了聚砜这一疏水性聚合物的存在。基于对比文件2，本领域技术人员并无动机如本申请发明那样仅以亲水性聚合物来构成功能层，并且相对于分离膜以特定量含有上述亲水性聚合物，更不会预料到这样的技术方案所带来的本申请发明的技术效果（可适宜地用于抑制未向制膜原液中混合亲水性聚合物而进行成型得到的分离膜、例如使电子射线透过而形成孔的膜表面的蛋白质或细胞附着性）。（2）关于孔的尺寸和密度，其旨在用于使用迁移因子使规定的细胞通过分离膜的孔而分离，从而处于细胞若不主动移动则无法通过的数值范围。对比文件1和2的任一者均不能给出启示使得本领域技术人员有动机如本申请发明那样设定孔的尺寸、密度、分离膜的厚度。特别是通过使孔的密度为本申请实施例所述的规定范围，可以缩短分离时间，所得细胞的存活率（Viability）提高。这样的效果是根据对比文件1和对比文件2所无法获得的。因此修改后的本申请发明具备创造性。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人于2019年08月15日提交了权利要求书全文替换页（共3页20项），经合议组审查，所作修改符合专利法实施细则第61条第1款以及专利法第33条的规定，本复审决定所依据的文本为：2015年02月11日提交的说明书摘要、说明书第1-252段、摘要附图、说明书附图第1-16页、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-29页；2019年08月15日提交的权利要求第1-20项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
根据该款规定，在发明所要求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征的情况下，如果现有技术中已经给出了将此区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，同时这种启示会使本领域的技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的发明，则发明是显而易见的，不具有突出的实质性特点。
具体到本申请，权利要求1请求保护一种膜分选培养器。对比文件1公开了一种过滤板系统700（相当于膜分选培养器），其包括一个容器板702（相当于下部结构体），一个滤板704（相当于上部结构体）和盖子706，容器板702包括许多容器孔708（相当于下部结构体由容器构成），滤板704由许多滤孔710（相当于上部结构体由容器构成）组成。每个容器孔的基板711和侧壁713都是实心的，以便于盛放液体（相当于下部结构体的容器保持使上部结构体的膜浸渍于其中的流体）。每个滤孔710由一个滤孔基板715（相当于上部结构体容器的底面）和一个滤孔侧壁713组成，其中滤孔侧壁713通常为圆柱形。每个滤孔710包括至少一个滤网壁部分717，如实施例所示，滤孔基板715为滤网壁部分717，滤孔侧壁713为实心的。滤网壁部分717作为滤膜使用。滤网壁部分717可由尼龙、聚丙烯……聚砜等疏水性聚合物构成（即分离膜具备基材膜，基材膜由疏水性聚合物构成）。在使用中，该过滤装置700可以由每个滤孔710置于容器孔708中组装而成。当将目标细胞群和或/细胞聚集体加入滤孔710中时，滤网壁部分717可筛选一定大小的细胞聚集体。其有大于单个细胞而小于细胞聚集体尺寸的孔径，单个细胞即可透过滤网壁部分717。目标细胞群可以是哺乳动物细胞、干细胞、人类胚胎干细胞或肿瘤细胞（相当于上部结构体容器的底面的至少一部分用具有干细胞透过用孔的分离膜形成）。盖子706可以置于容器板702上，该过滤装置后续可用于对细胞培养数小时或数天（参见说明书第[00146]-[00147]段、[00151]-[00153]段、[00160]段，附图7-10）。
权利要求1与对比文件1相比，区别技术特征为：权利要求1中的分离膜还具有功能层，且功能层是选自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1种以上的亲水性聚合物通过共价键键合于基材膜的表面而成的功能层，所述亲水性聚合物是具有水溶性单元和酯基的共聚物，构成所述功能层的亲水性聚合物的重量是所述分离膜总重量的1.5重量%至35重量%，还限定了孔的尺寸及密度以及分离膜的厚度。根据本申请说明书第[0154]段的记载，构成这些基材膜的聚合物一般疏水性强，具有大量附着蛋白质和细胞等的倾向。特别是由于活化的蛋白质或血小板、附着性细胞容易附着于膜表面，因而得到的结论是需要均匀地实施一定量以上的表面改性、即亲水性聚合物的共价键合。基于上述区别技术特征及本申请记载的技术效果，权利要求1相对于对比文件1实际所要解决的技术问题是：提供一种含有比基材膜的分选效果更好的分离膜的膜分选培养器。
针对上述区别技术特征，对比文件2公开了一种分离膜，该分离膜的特征在于，在膜的一侧表面具有功能层，并且将酯基定位于分离膜功能层的表面（参见第[0034]段）。涂布通过放射线或热处理使分离膜交联，这是用于抑制含酯基的聚合物洗脱的优选方法（参见第[0046]段，相当于通过共价键键合于所述基材膜的表面形成功能层）。从抑制蛋白质或血小板的附着的观点考虑，分离膜除了含酯基的聚合物之外还含有在20℃的100g水中的溶解度为1g以上、优选为10g以上的水溶性聚合物。一般认为表面的亲水性和疏水性的适度平衡对抑制蛋白质或血小析的附着可能是重要的。实际上，除了含酯基的聚合物之外，还含有比含酯基的聚合物亲水性强的水溶性聚合物时，蛋白质或血小板的附着抑制效果进一步提高（参见第[0052]段）。作为含有酯基的聚合物……优选乙酸乙烯酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯等在侧链中含有酯基的物质。其中，乙酸乙烯酯在对蛋白质或血小板的附着的抑制性方面优异（参见第[0042]段）。含酯基的聚合物应当是含有水溶性单元和酯基单元的共聚物，这样可以在单分子内达到亲水性和疏水性的平衡，水溶性单元包括乙烯基吡咯烷酮基团、乙二醇基团、乙烯醇基团等等，特别是乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯的共聚物具有亲水性和疏水性的平衡，故优选使用（参见第[0053]段）。作为分离膜中含有的水溶性聚合物的量优选在0.1重量%或1重量%以上，由于含量过高时存在膜性能降低的趋势，所以优选为30重量%或10重量%以下（参见第[0052]段）。因此，对比文件2中公开的含酯基的聚合物与本申请的亲水性聚合物均为水溶性单元和酯基的共聚物，乙烯基吡咯烷酮基团、乙二醇基团、乙烯醇基团与酯基单元的共聚物（例如乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯的共聚物）即为权利要求1所限定的乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物，且均具有蛋白质或血小板的附着的作用，本领域技术人员有动机在对比文件1的基础上在基质膜表面增加所述重量百分比的功能层。
此外，对比文件1还公开了滤膜的孔的尺寸可根据具体的需要合理变化，在一些实施例中，孔的尺寸可在5μm-100μm之间（参见说明书第[0107]段）。而对于孔的密度及分离膜的厚度，本领域技术人员可以结合具体孔的尺寸、待分选细胞的尺寸等因素合理调整，其数值范围是本领域技术人员通过有限的试验容易得出的，其并未产生任何预料不到的技术效果。因此，本领域技术人员在对比文件1基础上结合对比文件2和本领域普通技术知识得到权利要求1的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
从属权利要求2-10引用在前的权利要求，对膜分选培养器作了进一步的限定。如前所述，对比文件1所述滤板中固定有多个滤孔（参见图8，滤孔即上部结构体，滤板即为设置有将多个上部结构体的各个固定的多个孔的板状构件），滤孔含有基板和滤孔侧壁（滤孔的侧壁即为上部结构体的框体，且框体容纳于下部结构体中）；每个滤孔置于容器孔中组装而成（即公开了下部结构体由与该多个上部结构体的各个对应的多个容器构成）；滤网壁部分的孔的尺寸可根据具体的需要合理变化，在此基础上，为了提高细胞分选的效率，本领域技术人员可根据实际试验需求将上部结构体的滤膜设置为具有不同孔尺寸和/或不同孔密度的膜，其效果可预期；过滤装置包括盖子706（即盖状结构体），盖子706在容器板上形成密封（即盖状结构体可覆设或密封上部结构体和下部结构体），并且盖子允许气体交换（即允许气体进入和排除）（参见说明书第[00157]段，附图8）；而使用一定尺寸的孔来进行气体交换是本领域的常规技术手段，本领域技术人员可根据实际需要将盖状结构体的一部分设计为由一定尺寸的孔组成的膜，且基于本领域普通技术知识可知气体分子大小约为0.1 nm，而细菌等微生物的尺寸为微米级别，气体交换的孔尺寸应当大于气体分子的大小且小于微生物的尺寸，可见本领域技术人员将用于气体交换的膜的孔尺寸设置为大于0.1 nm且小于1微米是显而易见的，具体的孔尺寸范围可通过有限的试验得出；为了达到更好地密封效果，避免细菌等微生物的污染，在盖状结构体和下部结构体之间设置密封用的弹性体是本领域技术人员基于本领域普通技术知识容易确定的，其效果可预期；在设计膜分选培养器时增加温度设定装置和温度调节装置的温度调节系统以及具备培养基导入口和培养基送出口的培养基交换系统是本领域技术人员的常规操作。因此，当其引用的在前权利要求不具备创造性时，权利要求2-10的技术方案亦不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求11请求保护一种膜分选培养试剂盒，其含有权利要求1～10中任一项所述的膜分选培养器、和用于注入所述下部结构体的细胞迁移因子。对比文件3公开了使用SDF1、VEGF、GCSF、MMP3、Slit以及GMCSF中的至少一种细胞移动因子（即细胞迁移因子）来促进牙髓干细胞移动，从而促进牙髓再生（参见说明书第[0026]段），其所起的所用与本申请相同。在对比文件3的启示下，为了促进干细胞的移动，本领域技术人员向下部结构体中注入细胞迁移因子，并将其与膜分选培养器共同使用，组成膜分选培养试剂盒是显而易见的。在权利要求1-10的膜分选培养器不具备创造性的基础上，权利要求11的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求12和13引用在前的权利要求，对细胞迁移因子作了进一步的限定。所述细胞迁移因子已被对比文件3公开或属于本领域技术人员的常规选择，且对比文件3还公开了细胞移动因子的含量在0.1ng/μl以上500ng/μl以下（与1ng/ml-500ng/ml浓度范围相交叠）。因此，在权利要求11不具备创造性的基础上，权利要求12和13的技术方案亦不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求14引用权利要求11，并对试剂盒作了进一步的限定。在培养细胞时，向下部结构体的培养基中加入血清是本领域的常规操作。并且对比文件3公开了细胞迁移因子是选自SDF1、VEGF、GCSF、MMP3、Slit以及GMCSF中的至少一种（参见说明书第[0026]段），本领域技术人员可以根据具体情况选择具体的细胞迁移因子，其效果可预期。可见，当其引用的权利要求11不具备创造性时，权利要求14的技术方案亦不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求15请求保护使用权利要求1-10中任一项所述的膜分选培养器的干细胞分选方法。如前所述，对比文件1公开了一种膜分选培养器。此外，对比文件1还公开了一种分选目标细胞群的方法，其中包含：向至少一个滤孔中加入目标细胞群（即将样本细胞或样本组织接种于上部结构体的膜的步骤）（说明书第[0051]段）。权利要求15与对比文件1相比，区别技术特征为：1）权利要求15中膜分选培养器与对比文件1中膜分选培养器的结构差别。2）权利要求15的方法还包括将含有细胞迁移因子的培养基填充于下部结构体的容器的步骤；以及使上部结构体的膜与下部结构体中的培养基接触的步骤。
针对区别技术特征1），如前所述，权利要求1-10的膜分选培养器不具备创造性。
针对区别技术特征2），对比文件1还公开了：在一些实施例中，分选目标细胞群的方法还包括去除容器孔中的液体培养基，并向容器孔中加入第二容积的液体培养基（即将培养基填充于下部结构体的容器的步骤），且将滤孔放置于容器孔中（即使上部结构体的膜与下部结构体的培养基接触的步骤）（参见说明书第[0052]段）。此外，对比文件3公开了使用SDF1、VEGF、GCSF、MMP3、Slit以及GMCSF中的至少一种的细胞移动因子来促进牙髓干细胞移动，从而促进牙髓再生（参见说明书第[0026]段），其所起的所用与本申请相同，在其启示下，为了促进细胞的迁移，本领域技术人员在下部结构体的培养基中加入细胞迁移因子是显而易见的。综上并结合对权利要求1-10的评述，当权利要求1-10的膜分选培养器不具备创造性时，权利要求15的技术方案不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求16、17进一步限定了细胞迁移因子及其浓度，基于权利要求12、13类似的评述理由，权利要求16、17的技术方案亦不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求18引用在前的权利要求，并对干细胞分选方法作了进一步的限定。针对样本细胞相对于分离膜的接种密度，本领域技术人员基于本领域普通技术知识并结合有限的试验容易得出其数值范围，其效果可预期。因此，当其引用的在前权利要求不具备创造性时，权利要求18的技术方案亦不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求19和20均引用权利要求15，并对干细胞分选方法作了进一步的限定。首先，对比文件3公开了使用SDF1、VEGF、GCSF、MMP3、Slit以及GMCSF中的至少一种的细胞移动因子来促进牙髓干细胞移动，从而促进牙髓再生（参见说明书第[0026]段），此外，本领域技术人员亦可以根据实际情况选择分选及培养的干细胞种类，并结合有限的试验选择最合适的细胞迁移因子，其效果可预期。其次，对比文件3还公开了细胞移动因子的含量在0.1ng/μl以上500ng/μl以下（与1ng/ml-500ng/ml浓度范围相交叠）（参见说明书第[0140]段）。最后，对于样本细胞或样本组织相对于分离膜的接种密度，本领域技术人员基于本领域普通技术知识并结合有限的试验容易得出其数值范围，而当接种对象为样本组织时，将其置于分离膜中进行静置是本领域的常规操作。同时，在进行细胞分选及培养时，向培养基中添加相对于该培养基的体积为5%-20%的血清为本领域技术人员的常规技术手段，其效果可预期。因此，当其引用的权利要求15不具备创造性时，权利要求19和20的技术方案亦不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对复审请求人相关意见的评述
对于复审请求人答复复审通知书时陈述的意见，合议组认为，（1）对比文件2在制膜时实际上公开了多种将含有酯基的聚合物导入功能层表面的方法，包括使用将聚合物混合在分离膜的制膜原液中进行成型的方法（即复审请求人所引用的第0049-0051段所述方法）、将聚合物混合在注入液中的方法、在分离膜成型后进行涂布的方法等（参见第0058段）。其中，在分离膜成型后进行涂布的方法，功能层上即仅存在含有酯基的聚合物（即权利要求1所限定的亲水性聚合物），而不含有分离膜（如聚砜）。而且，本领域技术人员根据对比文件2可以理解，无论哪种导入方式，对比文件2和本申请一样，均是以疏水性聚合物（如聚砜）作为分离膜，以具有水溶性单元和酯基的亲水性聚合物（如VA64）作为功能膜，在功能上并无本质区别。（2）本领域技术人员通过常规实验容易确定适当的孔的尺寸、密度、分离膜的厚度，缩短分离时间，所得细胞的存活率提高是本领域通过膜分离细胞的基本要求，说明书中的记载并不能表明所述参数的限定取得了预料不到的技术效果。综上，复审请求人的意见不具备说服力。
基于以上事实和理由，合议组作出如下复审决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年11月28日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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