发明创造名称：皮革中有机氯类化合物的检测方法
外观设计名称：
决定号：197478
决定日：2019-12-03
委内编号：1F281038
优先权日：
申请（专利）号：201710584422.1
申请日：2017-07-18
复审请求人：泉州出入境检验检疫局综合技术服务中心 福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：孙春梅
合议组组长：边昕
参审员：陈永晖
国际分类号：G01N30/88，G01N30/06
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求与最接近的现有技术之间存在区别技术特征，该区别技术特征未被其他现有技术公开，并且没有证据证明该区别技术特征是本技术领域的公知常识，则该权利要求相对于上述现有技术具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201710584422.1，名称为“皮革中有机氯类化合物的检测方法”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请日为2017年07月18日，公开日为2017年09月05日，申请人为“泉州出入境检验检疫综合技术服务中心”和“福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所”。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2019年02月15日以本申请权利要求1-3不符合专利法第22条第3款的规定为由，驳回了本申请。驳回决定引用如下2篇对比文件：
对比文件1：CN103529153A，公开日期为2014年01月22日；
对比文件2：CN101498692A，公开日期为2009年08月05日。
在实审过程中还引用如下作为参考的对比文件：
对比文件3：CN105572239A，公开日期为2016年05月11日。
驳回决定所依据的文本为：申请日2017年07月18日提交的说明书第1-127段，说明书附图图1-4，说明书摘要，摘要附图；2018年05月14日提交的权利要求第1-3项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 皮革中有机氯类化合物的检测方法，其特征在于，具体检测步骤为：
1)样品液的制备：称取样品，置于离心管中，加入提取剂，振荡后，超声提取，离心分离，取上层清液；残渣再次进行提取、离心，取上层清液，将上层清液合并后浓缩；残余物用第一溶剂溶解后作为提取液；
用第二溶剂预淋洗固相萃取柱后，将提取液注入，再用第二溶剂进行洗脱，收集全部洗脱液并浓缩，加入第三溶剂溶解并过有机滤膜，所得样品液待用；
2)检测：运用气相色谱-质谱联用技术对步骤1)制备的样品液中所提取的有机氯类化合物进行检测，气相色谱-质谱工作条件如下：
进样口温度：250～290℃；
载气：氮气，纯度≥99.9％，
流速：1～1.5mL/min；
进样量:1～2μL；
进样方式：无分流进样，1～2min后打开阀；
色谱柱升温程序：初始温度50℃保持1～3min，以5～30℃/min程序升温至120～190℃保持1～5min，再以4℃/min升温至170～250℃，然后20℃/min程序升温至250～280℃保持3～7min；280～300℃后运行1～5min；
质谱条件：
接口温度：260～300℃；
电离方式：EI；
离子源温度：220～250℃；
扫描方式：SIM；
溶剂延迟：6～9min；
所述步骤2)中检测使用的气相色谱-质谱联用技术中的色谱柱为DB-1701，30m×0.25mm,0.25μm；所述提取剂为体积比为1:1的正己烷和乙酸乙酯混合物；所述第三溶剂为正己烷；所述第一溶剂和第二溶剂各自独立地为体积比为3:1的乙腈和甲苯混合物；所述固相萃取柱为Carb柱；所述有机氯类化合物包括六六六同系物、滴滴涕同系物、滴滴伊、林丹、甲氧滴滴涕、艾氏剂、狄氏剂、灭蚁灵、环氧七氯、五氯苯甲醚、百菌清、α-硫丹、β-硫丹。
2. 根据权利要求1所述的皮革中有机氯类化合物的检测方法，其特征在于，所述浓缩温度为30～40℃；所述超声波提取的时间为2～50分钟；所述振荡的时间为2～50分钟；所述离心分离的时间为1～5分钟。
3. 根据权利要求1所述的皮革中有机氯类化合物的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中检测使用的气相色谱-质谱联用技术中的工作条件如下：
进样口温度：270℃；
载气：氮气，纯度≥99.999％，
流速：1.2mL/min；
进样量:1μL；
进样方式：无分流进样，1.5min后打开阀；
色谱柱升温程序：初始温度50℃保持2min，以30℃/min程序升温至185℃保持1min，再以4℃/min升温至240℃，然后20℃/min程序升温至270℃保持5min；280℃后运行2min；
质谱条件：
接口温度：280℃；
电离方式：EI；
离子源温度：230℃；
扫描方式：SIM；
溶剂延迟：8min。”
驳回决定认为：（一）权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1的区别技术特征在于：（1）样品为皮革；（2）残渣再次进行提取、离心，取上层清液，将上层清液合并后浓缩；残余物用第一溶剂溶解后作为提取液；用第二溶剂预淋洗固相萃取柱后，将提取液注入，再用第二溶剂进行洗脱，收集全部洗脱液并浓缩，加入第三溶剂溶解并过有机滤膜，所得样品液待用；提取剂为体积比为1:1的正己烷和乙酸乙酯混合物；第三溶剂为正己烷；第一溶剂和第二溶剂各自独立地为体积比为3:1的乙腈和甲苯混合物；（3）超声提取，1～2min后打开阀，升温程序，质谱条件的接口温度、离子源温度、扫描模式、溶剂延迟时间；（4）色谱柱为DB-1701，30m×0.25mm,0.25μm；固相萃取柱为Carb柱。对于区别技术特征（1），对比文件2使用气相色谱-质谱联用方法检测皮革中的百菌清、α-硫丹、β-硫丹、狄氏剂等农药残留；对比文件2给出了将上述技术特征用于该对比文件1以解决其技术问题的启示。对于区别技术特征（2），对于不易提取的待测物质，或者干扰物质较多的情况下，本领域技术人员很容易想到使用多种溶剂多次进行萃取，该多次处理和萃取的过程只是一种常规技术手段。对于区别技术特征（3），对于超声提取、打开阀时间、升温程序和质谱条件的接口温度、离子源温度、扫描模式、溶剂延迟时间，这些参数条件均属于色谱分析领域的普通技术人员在合理范围内可以进行设定的常规参数条件，该常规参数条件的设定过程只是一种常规技术手段。对于区别技术特征（4），在色谱分析领域，对于有机氯农药的检测，选用DB-1701和Carb柱也是在合理范围内很容易确定的常规柱种类，该选择过程只是一种常规技术手段。由此可知，在对比文件1的基础上结合对比文件2和常规技术手段得到权利要求1的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的。因此权利要求1不具备创造性。（二）对于从属权利要求2-3的附加技术特征，这些常规参数条件的设定过程只是常规技术手段，因此从属权利要求2-3也不具备创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2019年04月26日向国家知识产权局提出了复审请求，并提交了修改后的权利要求书，共两项权利要求，其中，复审请求人删除了原权利要求3，根据说明书第38-50段的记载内容将其限定在权利要求1中，权利要求2不变。
修改后权利要求1如下：
“1. 皮革中有机氯类化合物的检测方法，其特征在于，具体检测步骤为：
1)样品液的制备：称取样品，置于离心管中，加入提取剂，振荡后，超声提取，离心分离，取上层清液；残渣再次进行提取、离心，取上层清液，将上层清液合并后浓缩；残余物用第一溶剂溶解后作为提取液；
用第二溶剂预淋洗固相萃取柱后，将提取液注入，再用第二溶剂进行洗脱，收集全部洗脱液并浓缩，加入第三溶剂溶解并过有机滤膜，所得样品液待用；
2)检测：运用气相色谱-质谱联用技术对步骤1)制备的样品液中所提取的有机氯类化合物进行检测，气相色谱-质谱工作条件如下：
进样口温度：270℃；
载气：氮气，纯度≥99.999％，
流速：1.2mL/min；
进样量:1μL；
进样方式：无分流进样，1.5min后打开阀；
色谱柱升温程序：初始温度50℃保持2min，以30℃/min程序升温至185℃保持1min，再以4℃/min升温至240℃，然后20℃/min程序升温至270℃保持5min；280℃后运行2min；
质谱条件：
接口温度：280℃；
电离方式：EI；
离子源温度：230℃；
扫描方式：SIM；
溶剂延迟：8min；
所述步骤2)中检测使用的气相色谱-质谱联用技术中的色谱柱为DB-1701，30m×0.25mm,0.25μm；所述提取剂为体积比为1:1的正己烷和乙酸乙酯混合物；所述第三溶剂为正己烷；所述第一溶剂和第二溶剂各自独立地为体积比为3:1的乙腈和甲苯混合物；所述固相萃取柱为Carb柱；所述有机氯类化合物包括六六六同系物、滴滴涕同系物、滴滴伊、林丹、甲氧滴滴涕、艾氏剂、狄氏剂、灭蚁灵、环氧七氯、五氯苯甲醚、百菌清、α-硫丹、β-硫丹。”
复审请求人认为：（1）本申请相对于对比文件1的区别在于，①本申请检测的为皮革中有机氯类化合物，②限定了具体的检测方法，③具体限定了提取溶剂组成, ④具体限定了采用的色谱柱型号，⑤具体限定了有机氯类化合物的种类。（2）对于区别技术特征①，本申请检测目标载体是皮革，对比文件1为大豆，两者的检测领域不同，用于植物提取检测的方法是难以应用于动物领域，对比文件1对本申请没有技术启示。对比文件2的检测目标为皮革，对比文件2的农药提取和检测难度高于对比文件1，对比文件2皮革中的残留农药不能采用对比文件1的方法进行检测。（3）对于区别技术特征②，本申请与对比文件1的升温方式不同，对比文件1的升温方式不适用于本申请，对比文件1的进样口温度等检测参数应用到本申请无法实现检测任务。（4）对于区别技术特征③，对比文件1没有公开本申请采用涡旋振荡、超声波提取和有机溶剂相结合的提取方法，萃取溶液的组成和使用顺序并非现有技术的常规调整可以得到。（5）对于区别技术特征④，本申请采用的固相萃取柱和色谱柱能最大限度并且准确地同时检测出19种皮革中的有机氯类化合物，对比文件1采用的萃取柱和色谱柱不能达到此效果。对比文件3的检测对象为水中的有机氯类化合物，干扰较少，大豆含有的干扰成分远多于水，采用对比文件3的色谱柱会使检测结果不准确或直接无法检测，采用Carb并非常规技术调整可以得到。（6）对于区别技术特征⑤，对比文件1的检测物质中并不包含本申请的五氯苯甲醚等物质，本申请与对比文件1的检测物质并不同，没有证据表明采用对比文件1的检测方法能够对本申请的19中有机氯类化合物进行检测。因而权利要求1-2具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年04月30日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：对比文件1-3检测均为生物样品，对比文件2公开了样品为皮革，样品种类不同影响的是前处理步骤的适应性调整，对于常规样品种类提取参数条件的调整是可预见的，提取之后的样品溶液对比文件1给出了相应的检测方法的技术启示。对比文件1检测物质种类复杂但包含了有机氯类化合物，将检测更复杂的方案调整为检测更少量的物质对于本领域技术人员来说是可以预见的，可以应用于皮革样品中有机氯化合物的检测。对比文件1-3均属于色谱分析领域，基于对样品性质和待测成分色谱属性的判断，是可以结合进行检测的。因此本申请不具备创造性。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）关于审查文本
在复审程序中，复审请求人于2019年04月26日提交了权利要求的修改替换页，该修改符合细则第61条和专利法第33条的有关规定。因此，本复审请求审查决定以申请日2017年07月18日提交的说明书第1-127段、说明书附图图1-4、说明书摘要、摘要附图以及2019年04月26日提交的权利要求第1-2项为基础作出。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型有实质性特点和进步。
如果权利要求与最接近的现有技术之间存在区别技术特征，该区别技术特征未被其他现有技术公开，并且没有证据证明该区别技术特征是本技术领域的公知常识，则该权利要求相对于上述现有技术具备创造性。
具体到本案，
权利要求1要求保护一种皮革中有机氯类化合物的检测方法。对比文件1公开了一种大豆中多种农药残留的通用快速检测方法，并具体公开了以下的技术特征（参见对比文件1的说明书第[0039]-[0101]段）：该方法可以同时检测大豆中306种农药残留，包括有机氯类、有机磷类等农药，包括六六六同系物、滴滴涕同系物、滴滴伊、林丹、甲氧滴滴涕、艾氏剂、狄氏剂、灭蚁灵、环氧七氯、α-硫丹、β-硫丹。
1）样品前处理
A.提取
将大豆样品充分打碎混合均匀作为试样，称取5.00g试样于50mL离心管中，在离 心管中加入9mL水，涡旋振荡浸湿后，静置10min，在离心管中加入20mL乙腈，用高速 组织捣碎仪在15000r/min下匀浆提取1min，然后在离心管中加入1g氯化钠、1g柠檬 酸三钠二水合物、0.5g柠檬酸氢二钠盐1.5水合物、4g无水硫酸镁后振荡1min，在 4000rpm离心6min后取样品上清液备用；
B.净化
用5mL乙腈活化C18固相萃取柱后，取10mL样品上清液过C18固相萃取柱，萃取液接 收于鸡心瓶中，用3mL乙腈洗脱C18固相萃取柱，将洗脱液合并于鸡心瓶中，将鸡心瓶 置于40℃水浴中旋转浓缩得到0.5-1.5mL浓缩液，在Carbon/NH2固相萃取柱中加入 0.5-1.5cm高的无水硫酸钠，用10mL乙腈/甲苯混合液活化Carbon/NH2固相萃取柱后， 将浓缩液过Carbon/NH2固相萃取柱，并用25mL乙腈/甲苯混合液洗脱，收集于鸡心瓶中， 将鸡心瓶于40℃水浴中减压蒸发至近干后用氮气吹干，用1mL丙酮/正己烷混合液溶解 定容至1mL得到样品提取液备用；
（2）气相色谱-三重四极杆串联质谱联用测定
气相色谱-质谱工作条件如下: 色谱柱：HP-5MS，30m×0.25mm,0.25μm；色谱柱温度程序：50℃保持1min，以20℃/min升温至150℃，再以3℃/min升温至 230℃，再以10℃/min升温至300℃，保持10min；
载气：高纯氦气，纯度大于99.999%，流速1.2mL/min；进样口温度：250℃；进样量：1μL；进样方式：不分流进样；电子轰击源：EI：离子源温度：280℃；质谱接口温度：250℃。
该权利要求所要求保护的技术方案与该对比文件所公开的技术内容相比，区别技术特征在于：权利要求1检测皮革中的有机氯类化合物：包括六六六同系物、滴滴涕同系物、滴滴伊、林丹、甲氧滴滴涕、艾氏剂、狄氏剂、灭蚁灵、环氧七氯、五氯苯甲醚、百菌清、α-硫丹、β-硫丹；气相色谱-质谱联用技术：色谱柱为DB-1701, 30m×0.25mm,0.25μm；进样口温度：270℃，1.5min后打开阀；色谱柱升温程序：初始温度50℃保持2min，以30℃/min程序升温至185℃保持1min，再以4℃/min升温至240℃，然后20℃/min程序升温至270℃保持5min，280℃后运行2min；接口温度：280℃，离子源温度：230℃，溶剂延迟：8min；样品液的制备：称取样品，置于离心管中，加入提取剂，振荡后，超声提取，离心分离，取上层清液；残渣再次进行提取、离心，取上层清液，将上层清液合并后浓缩；残余物用第一溶剂溶解后作为提取液；所述固相萃取柱为Carb柱，以及采用的第一、第二和第二溶剂。
基于上述区别技术特征，该权利要求实际解决的技术问题是：如何简便、快速准确地检测皮革中的有机氯类化合物。
合议组认为，（1）本申请发明目的是提供一种皮革中有机氯类化合物的检测方法，对比文件1公开的则是一种大豆中多种农药残留的通用快速检测方法，由于检测对象不同，需要克服的背景干扰完全不同，导致权利要求1的检测方法与对比文件1样品制备方法、气相色谱条件、MS检测参数等存在较大的差别。并且对比权利要求1检测方法和对比文件1相应的技术效果可知，本申请检测皮革中有机氯类化合物的样品制备步骤相对于对比文件1操作更简便，而且本申请实施例1表5中样品加标19种有机氯类化合物的平均回收率在77.09%以上，本申请的检测结果准确可靠。（2）在对比文件1的样品制备中，大豆样品经乙腈匀浆提取、盐析离心后，采用C18固相萃取柱和Carbon/NH2固相萃取柱两次净化后，洗脱液减压蒸发用混合液溶解后得到样品提取液。而权利要求1的样品制备中，采用正己烷-乙酸乙酯混合液超声提取样品两次，采用Carb固相萃取柱净化，洗脱液浓缩后得到样品溶液。由此可知，权利要求1与对比文件1分别从背景干扰完全不同的皮革和大豆中提取有机氯类化合物农药，虽然提取的目标物大体类似，但由于包含目标物的基质相差很远，前期进行样品处理时的提取（净化）方法、提取溶剂不同，因此得到的提取液也不相同。由于气相色谱分离（GC色谱条件）与待测样品的具体成分等多种因素之间存在复杂的整体相互作用，进而又影响与气相色谱分离相联用的质谱检测（MS检测参数），由此检测方法中的样品提取步骤、气相分离步骤和MS检测步骤相互关联并相互影响，这种相互影响的复杂性决定了样品提取条件、气相分离条件和MS检测参数等的选择需要进行整体关联调整，这对本领域技术人员来说需要付出创造性的劳动，并且其技术效果是无法预期的。由此可知，对比文件1并没有给出本申请检测皮革有机氯类化合物的方法的技术启示。（3）对比文件2公开了皮革中农药残留量的测定方法，皮革样品中残留的农药经正己烷和乙腈超声提取，提取液经液液萃取、GPC净化、层析柱、SPE柱净化多种方法净化后采用气相色谱-质谱联用方法检测皮革中的农药残留，所述的农药为百菌清、α-硫丹、β-硫丹、狄氏剂等。由此可知，对比文件2的皮革样品提取方法与本申请完全不同，采用的气相-质谱条件也与本申请不同，对比文件2也未给出可以采用本申请样品制备方法以及相应的气相-质谱检测条件来简便、快速准确检测皮革中有机氯类化合物的技术启示。同样的，其他现有技术也未给出上述技术启示。（4）上述区别技术特征使得本申请皮革中有机氯类化合物的检测方法操作更简便、结果准确可靠。由本申请附图可以看出采用本申请的方法分析时间较短，分离效果良好。本领域技术人员也无法预期检测皮革有机氯类化合物时整体关联选择提取条件、气相色谱分离条件和MS检测参数等对测定结果的影响，因而上述区别技术特征不是本领域的常规选择，目前也尚无证据证明上述区别技术特征属于本领域的公知常识。
综上，本领域技术人员在对比文件1的基础上结合对比文件2和公知常识无法得出权利要求1的技术方案。且权利要求1相对于对比文件1、2和公知常识具有突出的实质性特点和显著的进步，具备专利法第22条第3款规定的创造性。
在此基础上，权利要求1的从属权利要求2也具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2、前置意见认为：对比文件1-3检测均为生物样品，对比文件2公开了样品为皮革，样品种类不同影响的是前处理步骤的适应性调整，对于常规样品种类提取参数条件的调整是可预见的，提取之后的样品溶液对比文件1给出了相应的检测方法的技术启示。对比文件1检测物质种类复杂但包含了有机氯类化合物，将检测更复杂的方案调整为检测更少量的物质对于本领域技术人员来说是可以预见的，可以应用于皮革样品中有机氯化合物的检测。对比文件1-3均属于色谱分析领域，基于对样品性质和待测成分色谱属性的判断，是可以结合进行检测的。因此本申请不具备创造性。
对此合议组认为：（1）①对比文件1公开测定的农药涵盖了有机氯类，但对比文件1公开的有机氯类农药并不包括本申请的五氯苯甲醚等。②权利要求1与对比文件1分别从背景干扰完全不同的皮革和大豆中提取有机氯类化合物农药，虽然提取的目标物部分相同，但由于包含目标物的基质相差很远，前期进行样品处理时的提取（净化）方法、提取溶剂不同，因此得到的提取液也不相同。（2）对比文件2公开皮革中农药残留量的测定方法，皮革样品中残留的农药经正己烷和乙腈超声提取，提取液经液液萃取、GPC净化、层析柱、SPE柱净化多种方法净化后采用气相色谱-质谱联用方法检测皮革中的农药残留。由此可知对比文件2的样品制备方法更加复杂，与本申请相差很大。（3）对比文件3公开的是快速测定水体中多种有机氯农药含量的方法，采用气相色谱-电子捕获方法对样品进行检测，检测的水体与皮革相差较大，样品制备方法与本申请并不相同，结合上述评述可知，由于检测方法中的样品提取步骤、气相分离步骤和MS检测步骤相互关联并相互影响，这种相互影响的复杂性决定了样品提取条件、气相分离条件和MS检测参数等的选择需要进行整体关联调整，这对本领域技术人员来说需要付出创造性的劳动。现有技术并没有给出可以采用本申请样品制备方法以及相应的气相-质谱检测条件来简便、快速准确检测皮革中有机氯类化合物的技术启示。本领域技术人员也无法预期检测皮革有机氯类化合物时整体关联选择提取条件、气相色谱分离条件和MS检测参数等对测定结果的影响，因而上述区别技术特征不是本领域的常规选择，目前也尚无证据证明上述区别技术特征属于本领域的公知常识。综上所述，权利要求1-2具备创造性。
三、决定
撤销国家知识产权局于2019年02 月15 日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本决定所针对的文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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