发明创造名称：来自患者的诱导性多能干细胞的心肌细胞及其使用方法
外观设计名称：
决定号：197659
决定日：2019-12-02
委内编号：1F238297
优先权日：2011-07-21
申请（专利）号：201280045656.4
申请日：2012-07-20
复审请求人：小利兰·斯坦福大学托管委员会
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：彭郁葱
合议组组长：邢维玲
参审员：王慧
国际分类号：C12Q1/02，C12N5/074
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求与作为最接近现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，这些区别技术特征或者是本领域普通技术人员根据该对比文件公开的内容有动机改进的，或者是本领域技术人员的常规技术手段，并且该申请的说明书中给出的内容不足以证明该申请的技术方案取得了预料不到的技术效果，则所要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201280045656.4，名称为“来自患者的诱导性多能干细胞的心肌细胞及其使用方法”的发明专利申请。申请人为小利兰·斯坦福大学托管委员会。本申请的申请日为2012年07月20日，优先权日为2011年07月21日，公开日为2014年08月13日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年08月09日发出驳回决定，以权利要求1-19不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为：2014年03月19日本申请进入中国国家阶段时提交的说明书第1-62页（即第1-257段）、说明书附图、说明书摘要；2016年06月02日提交的说明书核苷酸和氨基酸序列表；2017年02月21日提交的权利要求第1-19项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种候选试剂的心脏病相关筛选的方法，所述方法包括：将所述候选试剂与一种或一组分化自诱导性人多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞接触，所述iPS细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因，其中经分离的群或组的心肌细胞内的细胞显示出扩张型心肌病(DCM)表型；和测定所述试剂对于形态学参数、遗传参数或功能性参数的影响。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变选自：心脏肌钙蛋白T(TNNT2)；肌球蛋白重链(MYH7)；原肌球蛋白1(TPM1)；肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)；5'-AMP-活化的蛋白激酶亚基γ-2(PRKAG2)；3型肌钙蛋白I(TNNI3)；肌联蛋白(TTN)；肌球蛋白，轻链2(MYL2)；肌动蛋白，α心肌1(ACTC1)；电压门控性钾通道，KQT-样亚家族，成员1(KCNQ1)；斑菲素蛋白2(PKP2)或心脏LIM蛋白(CSRP3)。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变是TNNT2R173W。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，相对于正常心肌细胞，所述DCM心肌细胞具有响应正性肌力压力的初始正性变时作用，之后变为以衰竭为特征的负性作用。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，一组心肌细胞包含具有不同基因型的至少两种心肌细胞。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，一组心肌细胞包含在不同环境条件下的心肌细胞。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，一种或多种所述环境条件包含采用β-肾上腺素激动剂的刺激。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述试剂的影响的测定包括单细胞分析。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述单细胞分析包括原子力显微镜、微电极阵列记录、膜片钳、单细胞PCR和钙成像中的一种或多种。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述候选试剂是候选药物。
11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述候选试剂是遗传物质。
12. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DCM表型是选自下组的一种或多种表型：(a)相对于从源自正常对象的诱导性多能干细胞产生的心肌细胞(“正常iPSC-CM”)，响应正性肌力压力的初始正性变时作用，之后变为以衰竭为特征的负性作用；(b)与正常iPSC-CM相比降低的肌力活力；(c)与正常iPSC-CM相比降低的变时作用；(d)与正常iPSC-CM相比降低的收缩力；(e)与正常iPSC-CM的基因表达谱相比不同的基因表达谱；(f)比正常iPSC-CM显示出的钙瞬变小的钙瞬变；(g)与正常iPSC-CM相比更弱的抗机械刺激的能力；(h)响应去甲肾上腺素刺激的自发收缩停止；(i)与正常iPSC-CM相比肌节α-辅肌动蛋白的更高频率点状分布；和(j)与正常iPSC-CM相比响应收缩刺激的恶化的肌节组织性。
13. 一种分化自诱导性人多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞的经分离的群或组，所述iPS细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因，其中经分离的群或组的心肌细胞内的细胞显示出扩张型心肌病(DCM)的表型。
14. 如权利要求13所述的分化自诱导性人多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞的经分离的群或组，其特征在于，所述突变是选自下组的基因中的突变：心脏肌钙蛋白T(TNNT2)；肌球蛋白重链(MYH7)；原肌球蛋白1(TPM1)； 肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)；5'-AMP-活化的蛋白激酶亚基γ-2(PRKAG2)；3型肌钙蛋白I(TNNI3)；肌联蛋白(TTN)；肌球蛋白，轻链2(MYL2)；肌动蛋白，α心肌1(ACTC1)；电压门控性钾通道，KQT-样亚家族，成员1(KCNQ1)；斑菲素蛋白2(PKP2)或心脏LIM蛋白(CSRP3)。
15. 如权利要求14所述的经分离的群，其特征在于，所述突变是TNNT2R173W。
16. 如权利要求14所述的经分离的群，其特征在于，相对于正常心肌细胞，所述DCM心肌细胞具有响应正性肌力压力的初始正性变时作用，之后变为以衰竭为特征的负性作用。
17. 如权利要求13所述的经分离的群，其特征在于，一组心肌细胞包含具有不同基因型的心肌细胞。
18. 如权利要求13所述的组，其特征在于，一组心肌细胞包含在不同环境条件下的心肌细胞。
19. 如权利要求18所述的组，其特征在于，一种或多种所述环境条件包括采用β-肾上腺素激动剂的刺激。”
驳回决定中引用了如下对比文件：
对比文件1：US20090227469A1，公开日期2009年09月10日；
对比文件3：“Development of a high resolution melting method for the detection of genetic variations in hypertrophic cardiomyopathy”，Gilles Millat 等，Clinica Chimica Acta，第411卷1983-1991页，公开日期2010年12月14日。
驳回决定指出：权利要求 1与对比文件1的区别在于：权利要求1限定了经分离的群或组的心肌细胞内的细胞显示出扩张型心肌病(DCM)表型，还限定了iPS细胞中包含的基因的特点和测定参数。然而，对比文件1还给出了制备含有突变的LQTS有关的基因的iPS细胞的技术启示。另外，TNNT2突变是本领域已知的DCM致病原因之一，对比文件3公开了TNNT2 R173W（突变）。在对比文件1和3的教导下，本领域技术人员可以根据所要筛选的试剂的作用来制备相应的模型心肌细胞。因此，权利要求1不具备创造性。权利要求13与对比文件1的区别在于：本申请的经分离的群或组的心肌细胞内的细胞显示出扩张型心肌病(DCM)的表型。对比文件1给出了制备含有突变的LQTS有关的基因的iPS细胞的技术启示，对比文件3公开了TNNT2 R173W（突变）。在对比文件1和3的教导下，本领域技术人员可以根据所要筛选的试剂的作用来制备相应的模型心肌细胞，因此权利要求13不具备创造性。从属权利要求2-12、14-19的附加技术特或者被对比文件1、3公开，或者属于常规技术手段，因此也不具备创造性。在答复申请人意见陈述部分，驳回决定引用了如下公知常识证据：
公知常识证据1：郭航远编著，《新编心肌病学》，“第一章 扩张型心肌病 上篇”，第105页末段、第107页第2段，浙江大学出版社，公开日期2007年07月31日。
申请人小利兰·斯坦福大学托管委员会（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年11月22日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书全文替换页（共3页18项）以及附件1-4，相对于驳回决定针对的文本，将原权利要求12的附加技术特征合并入权利要求1，删除原权利要求12，适应性修改权利要求的编号和引用关系。复审请求人提交的附件1-4如下：
附件1：EXHIBIT A；
附件2：EXHIBIT B；
附件3：EXHIBIT C；
附件4：EXHIBIT D。
结合上述附件，复审请求人认为：本申请的关键点在于可通过iPS技术从患者细胞生成相关的DCM疾病模型，并且从中衍生的心肌细胞可用于筛选试验，并且权利要求1已经包括特定的DCM模型表型。二者的差异使得难以基于对比文件1的长QT综合征的证据得出关于本申请DCM的结论，因此分化的心肌细胞中DCM相关的特定表型在对比文件1的启示下不是显而易见的，对比文件3并没有弥补对比文件1的缺陷。附件1（即吴博士的专家陈述）认为，原代患者细胞无法在培养中长时间存活且无法在培养中搏动，从而无法提供合适的DCM体外模型，而附件2显示了在权利要求的细胞中超过80%的细胞展示出强健的搏动。附件3表明，尽管具有相同的与DCM相关的基因组突变（即TNNT2基因的外显子12中携带导致R173W的常染色体显性点突变），但不同DCM患者个体展示出不同程度的临床症状。相反，衍生自上述不同患者的iPSC-CM心肌细胞全部显示出降低的搏动率，受损的收缩，和异常肌节α-辅肌动蛋白分布，这说明分化自iPS细胞的心肌细胞提供哪一种相关表型不是显而易见的，不能事先预测哪种表型可能在体外表达。而本申请实施例1证明了权利要求的细胞在一定程度上在形态上和功能上重现了DCM疾病表征，并因此可用作探索分子和细胞机制以及优化特定疾病的治疗的可用平台。因此，本申请具备创造性。
复审请求时新修改的权利要求1如下：
“1. 一种候选试剂的心脏病相关筛选的方法，所述方法包括：将所述候选试剂与一种或一组分化自诱导性人多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞接触，所述iPS细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因，其中经分离的群或组的心肌细胞内的细胞显示出扩张型心肌病(DCM)表型；和测定所述试剂对于形态学参数、遗传参数或功能性参数的影响，其中所述DCM表型是选自下组的一种或多种表型：(a)相对于从源自正常对象的诱导性多能干细胞产生的心肌细胞(“正常iPSC-CM”)，响应正性肌力压力的初始正性变时作用，之后变为以衰竭为特征的负性作用；(b)与正常iPSC-CM相比降低的肌力活力；(c)与正常iPSC-CM相比降低的变时作用；(d)与正常iPSC-CM相比降低的收缩力；(e)与正常iPSC-CM的基因表达谱相比不同的基因表达谱；(f)比正常iPSC-CM显示出的钙瞬变小的钙瞬变；(g)与正常iPSC-CM相比更弱的抗机械刺激的能力；(h)响应去甲肾上腺素刺激的自发收缩停止；(i)与正常iPSC-CM相比肌节α-辅肌动蛋白的更高频率点状分布；和(j)与正常iPSC-CM相比响应收缩刺激的恶化的肌节组织性。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年12月22日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年05月06日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1限定了iPS细胞中包含编码心脏病相关突变的一种或多种基因，并表现出扩张型心肌病(DCM)的具体表型，以及限定了具体测定参数和具体表型特点。然而，对比文件1还给出了可用含有心脏病相关突变基因的分化自iPS细胞的心肌细胞模型来评价心脏病治疗药物的技术启示。DCM是最常见的心力衰竭病因之一，而且本领域技术人员公知有多种基因及其突变形式与DCM相关（例如参见公知常识性证据1第105页末段至第110页末段），为了治疗该病，本领域技术人员有动机筛选与DCM有关的药物，对比文件1公开了在野生型和心脏病心肌细胞模型中测量正性肌力压力，其余指标都与DCM的临床表现即心室收缩功能以及心力衰竭有关，因此权利要求1不具备创造性。权利要求12与对比文件1的区别在于：本申请的经分离的群或组的心肌细胞内的细胞显示出扩张型心肌病(DCM)的表型。基于上述相同的理由，权利要求12也不具备创造性，从属权利要求2-11、13-18的附加技术特征或者被对比文件1公开，或者属于本领域常规技术手段，因此也不具备创造性。
复审请求人于2019年08月19日提交了意见陈述书，未修改申请文件，提交了附件5-6如下：
附件5：Elena Matsa等，Human stem cells for modeling heart disease and for durg discovery, www.ScienceTranslationMedicine.org, 第6卷,第239期，第1-7页， 2014年06月04日。
附件6：Nazish Sayed等，Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells， Journal of the American college of cardiology ,第67卷，第18期，第2161-76页，2016年05月10日。
结合上述附件，复审请求人认为：对比文件1涉及长QT综合征和LQT突变，LQT突变（例如，细胞表面上的钠、钙、钾通道）涉及细胞电生理学(即，电导)，可能导致电导异常和心脏猝死。而本申请涉及扩张型心肌病(DCM)，与收缩蛋白和核膜蛋白有关，二者涉及不同的靶基因座，由于不同的突变和由此导致的不同疾病病理学，是不同的疾病，基于LQT突变的发现对于DCM突变而言没有启示。因此，本申请具备创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审程序中，复审请求人在提出复审请求时提交了权利要求书全文替换页（共3页18项），经审查，所作修改符合专利法第33条以及专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审请求审查决定所针对的文本为： 2014年03月19日本申请进入中国国家阶段时提交的说明书第1-62页（即第1-257段）、说明书附图、说明书摘要；2016年06月02日提交的说明书核苷酸和氨基酸序列表；2017年11月22日提交的权利要求第1-18项。
专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果一项权利要求与作为最接近现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，这些区别技术特征或者是本领域普通技术人员根据该对比文件公开的内容有动机改进的，或者是本领域技术人员的常规技术手段，并且该申请的说明书中给出的内容不足以证明该申请的技术方案取得了预料不到的技术效果，则所要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
权利要求1请求保护一种候选试剂的心脏病相关筛选的方法，所述方法包括：将所述候选试剂与一种或一组分化自诱导性人多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞接触，所述iPS细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因，其中经分离的群或组的心肌细胞内的细胞显示出扩张型心肌病(DCM)表型；和测定所述试剂对于形态学参数、遗传参数或功能性参数的影响，并限定了所述DCM表型。
对比文件1（US20090227469A1，公开日期2009年09月10日）公开了一种确定化合物是否具有在个体中引起LQTS潜力的方法，其包括将测试化合物与一组心肌细胞在体外接触，并确定测试化合物对心肌细胞QT间期的效果，所述心肌细胞可诱导自iPS细胞（参见对比文件1权利要求12-13）。权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1限定了iPS细胞中包含编码心脏病相关突变的一种或多种基因，并表现出扩张型心肌病(DCM)的具体表型，以及限定了具体测定参数和具体表型特点。基于以上述区别技术特征可以确定权利要求1实际解决的技术问题是提供DCM心肌细胞模型，以针对该模型进行候选试剂的筛选。
对于上述区别技术特征，对比文件1公开了iPS细胞包含编码可以调节QT间期的多肽的基因（参见对比文件1说明书第0035段），与LQTS有关的基因可以是突变的（参见对比文件1说明书第0017段），等位基因可以是包含突变的基因（参见对比文件1说明书第0019段）；对比文件1还公开了LQTS相关的参数如测量细胞的电活性等（参见对比文件1说明书第0129-0130段）。可见，对比文件1公开了制备含有突变的LQTS有关的基因的iPS细胞分化的心肌细胞，给出了可用含有心脏病相关突变基因的分化自iPS细胞的心肌细胞模型来评价心脏病治疗药物的技术启示。由于DCM是最常见的心力衰竭病因之一，而且本领域技术人员公知有多种基因及其突变形式与DCM相关（例如参见公知常识性证据1：郭航远编著，《新编心肌病学》，“第一章 扩张型心肌病 上篇”，第105页末段至第110页末段，浙江大学出版社，公开日期2007年07月31日），为了治疗该病，本领域技术人员有动机筛选与DCM有关的药物，因此结合对比文件1的启示容易想到从DCM患者获得含有DCM相关突变基因的体细胞，诱导为iPS并进一步分化为心肌细胞，而DCM心肌细胞模型的具体表型与正常细胞诱导的iPS细胞分化的心肌细胞的差异则可通过观察和测定获得。对比文件1公开了在野生型和心脏病心肌细胞模型中测量正性肌力压力（其由β-肾上腺素激动剂处理引起）（参见对比文件1说明书第0061、0087、0090段），此外DCM是扩张型心脏病，临床表现包括心室收缩功能减退和心力衰竭，而肌力、收缩力、肌电传导能力的改变都与心室收缩功能以及心力衰竭有关，本领域技术人员能够经过常规技术手段测定得到上述相关指标。因此，在对比文件1的基础上，结合本领域公知常识得到权利要求1的技术方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求2-11直接或间接地引用权利要求1，其中：
从属权利要求2-3限定了突变蛋白以及具体的突变位点，由于本领域公知有多种基因及其突变形式与DCM相关，因此，可以通过常规方法测定所选择的DCM患者的突变基因及突变位点；
权利要求4限定了所述DCM心肌细胞的特点，对比文件1公开了在野生型和心脏病模型心肌细胞中测量正性肌力压力（其由β-肾上腺素激动剂处理引起）（参见对比文件1说明书第0061、0087、0090段），而其变化特点是可以通过测定获得的；
权利要求5限定了心肌细胞具有不同基因型，对比文件1公开了一组心肌细胞包括约5-10种不同的心肌细胞，所述心肌细胞来自不同HLA单体型的个体（参见对比文件1说明书第0096-0097段）；
权利要求6限定了心肌细胞包含在不同环境下的心肌细胞，对比文件1公开了检测β-肾上腺素激动剂、β-肾上腺素拮抗剂或胆碱能受体激动剂（相当于不同环境）使用后的反应，还公开了心肌细胞可以来自不同人群（参见对比文件1说明书第0061、0095-0096段）；
权利要求7限定了环境条件，对比文件1公开了检测β-肾上腺素激动剂使用后的反应（参见对比文件1说明书第0061段）；
权利要求8限定了对所述试剂的影响的测定包括单细胞分析，对比文件1公开了测量单个细胞的电活性（参见对比文件1说明书第0149段）；
权利要求9限定了单细胞分析种类，对比文件1公开了微电极阵列、膜片钳等（参见对比文件1说明书第0149段），其余限定也是对单细胞特性进行分析的常规方法；
权利要求10和11限定了候选试剂种类，对比文件1公开了候选试剂包括多种化学类别的无机或有机分子，也可以是生物分子如肽、嘌呤、嘧啶等（参见对比文件1说明书第0176-0177段）；
因此，在权利要求1不具有创造性的情况下，从属权利要求2-11也不具有专利法第22条第3款所规定的创造性。
权利要求12请求保护一种分化自诱导性人多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞的经分离的群或组，所述iPS细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因，其中经分离的群或组的心肌细胞内的细胞显示出扩张型心肌病(DCM)的表型。对比文件1公开了包含编码与LQTS的一个或多个症状有关的突变多肽的基因的iPS细胞，其用于分化为心肌细胞（参见对比文件1说明书第0041-0042、0048、0060段）。权利要求12与对比文件1的区别在于：本申请的经分离的群或组的心肌细胞内的细胞显示出扩张型心肌病(DCM)的表型。基于以上区别技术特征可以确定权利要求12实际解决的技术问题是提供具有另外的表型的心肌细胞。对于上述区别技术特征，对比文件1公开了制备含有突变的LQTS有关的基因的iPS细胞分化的心肌细胞，给出了可用含有心脏病相关突变基因的分化自iPS细胞的心肌细胞用于评价心脏病治疗药物的技术启示。由于DCM是最常见的心力衰竭病因之一，而且本领域技术人员已经公知有许多基因与DCM相关（例如参见公知常识性证据1第105页末段至第110页末段），因此在对比文件1的基础上结合上述公知常识容易想到从DCM患者获得含有DCM相关突变基因的体细胞诱导为iPS并分化为心肌细胞以用于DCM药物筛选。因而，在对比文件1的基础上，结合本领域公知常识得到权利要求12的技术方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求12不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求13-18直接或间接引用权利要求12，其附加技术特征内容与权利要求2-7附加技术特征的内容相同，基于与权利要求2-7评述部分相同的理由，在权利要求12不具有创造性的情况下，权利要求13-18的技术方案对于本领域技术人员来说是显而易见的，不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具有专利法第22条第3款所规定的创造性。
对复审请求人相关意见的评述
复审请求人认为，对比文件1涉及长QT综合征和LQT突变，本申请涉及扩张型心肌病(DCM)，二者涉及心肌细胞不同位置处的不同靶标(核纤层上的蛋白质或细胞膜上的离子通道)，涉及不同的靶基因座，由于不同的突变和由此导致的不同疾病病理学，二者是不同的疾病，基于LQT突变的发现对于DCM突变而言没有启示。
对此，合议组认为，长QT综合征和扩张型心肌病(DCM)是不同的疾病是本领域技术人员已经普遍知晓的常识。然而，对比文件1给出了建立心肌细胞模型并利用其来测试化合物功能的教导，其实施例1公开了自经历LQTS的个体分离体细胞诱导为iPSC，继而分化为心肌细胞并用于药物筛选的过程，在其教导下，本领域技术人员有动机自经历其它心脏病，例如引起心力衰竭的扩张型心肌病(DCM)个体分离细胞诱导为iPSC，制备相应的心肌细胞模型，以筛选相应的候选试剂，二者属于不同的病症不会妨碍本领域技术人员进行上述尝试。并且本领域公知有多种基因及其突变形式与DCM相关，可以常规选择带有突变的DCM患者细胞。对于长QT综合征和/或DCM，其表征手段均是常规的，本领域技术人员可以对相同的特征采用相同的指标进行表征，同时针对其独特性而采用特有的指标进行细胞表型的描述和表征。因此，复审请求人的意见陈述不具有说服力。
基于上述事实和理由，合议组作出如下复审请求审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年08月09日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，请求人可自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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