发明创造名称：经血间充质干细胞的培养方法
外观设计名称：
决定号：199545
决定日：2019-12-02
委内编号：1F254154
优先权日：
申请（专利）号：201410836460.8
申请日：2014-12-29
复审请求人：深圳市北科生物科技有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：张弛
合议组组长：马振莲
参审员：王翔宇
国际分类号：C12N5/0775
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：如果权利要求请求保护的发明相对于最接近的现有技术存在区别特征，而现有技术整体上没有给出将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其实际存在的技术问题的技术启示，并且该区别特征的引入使得发明的技术方案产生了有益的技术效果，则不能得出该权利要求不具备创造性的结论。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410836460.8，名称为“经血间充质干细胞的培养方法”的发明专利申请。申请人为深圳市北科生物科技有限公司。本申请的申请日为2014年12月29日，公开日为2015年04月29日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年03月20日以权利要求1-5不具有专利法第22条第3款规定的创造性为由，驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的审查文本为：2014年12月29日申请日提交的说明书第1-7页（即第1-47段）、说明书附图第1-7页（即图1-图11）、说明书摘要、摘要附图，以及2017年10月26日提交的权利要求第1-5项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种制备经血间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）使用月亮杯采集女性经期中第二天或第三天的经血作为原料；将采集到的经血倒入装有保存液的无菌容器中，4℃保存；
2）48h内将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，将经血和保存液充分混匀，转移至离心管中，首次离心为800-1000g/5-15min，除去上清；加入清洗液，充分混匀，再次离心为300-700g/5-15min，除去上清；
3）差异离心后，加入1%-6%羟乙基淀粉，充分混匀后，静止10-60分钟，取得经血中的经血干细胞；
4）使用无血清培养基培养经血间充质干细胞，其中P0代经血间充质干细胞长满至80%密度后，使用胰酶消化，消化时间为3-5min，P0代之后，细胞在传代操作后48-72h内一固定时间点进行传代，要求传代时细胞密度80%-90%以上，传代后细胞按3-8×103个/cm2密度接种，培养过程中注意观察培养基PH值变化，一旦变黄添加新鲜培养基并去除培养器皿中等量旧培养基，细胞从P0代传代，传至P1～P30中间的任何一代次；
5）P0～P30代蜕膜间充质干细胞的冻存：每106-107细胞加入1ml冻存液，放入冻存盒，转入-80℃冰箱，12～24h 后转入-196℃液氮或气氮中保存备用；所述步骤1）中，保存液采用的抗生素浓度为终浓度为0.5-3%的青霉素和链霉素以及终浓度为1-10ug/ml的两性霉素B与生理盐水充分混匀；
所述步骤4）传代培养为：在原代细胞融合达85%～90%，进行传代培养，传代细胞密度为3-8×103个/cm2；
所述的差异离心为首次离心为800-1000g/5-15min，除去上清，加入含有抗生素的生理盐水充分混匀，再次离心为300-700g/5-15min，除去上清。
所述步骤4）冷冻保存的方法为：
1A）配制保护剂浓度为终浓度2倍、终体积一半的冻存液，即10%DMSO 培养基，往培养基中添加DMSO时，需沿着管壁缓缓加入，置于冷藏冰箱10min以上；
2A）消化：观察需冻存的细胞融合达85%～90%后，每个培养容器按比例加入胰酶消化细胞，轻轻摇动培养容器，使消化液流遍所有细胞表面，消化时间为3～5min ；同时在倒置显微镜镜下观察到细胞大部分由梭形变为圆形，消化结束后向每个培养容器中加入培养基适量，反复吹打容器底或摇动容器至细胞大部分脱落,移入离心管中，原培养容器中加入4～5ml预冷生理盐水冲洗容器壁，洗涤液合并加入离心管中，用预冷生理盐水定容，离心洗涤；
3A）细胞计数：将洗涤后的离心管中加入1～2ml培养基，用枪头轻轻吹打混匀，合并5～ 10个离心管中的细胞悬液至离心管中，用塑料吸管轻轻吹打混匀，取细胞悬液计数，并计算细胞活率；
4A）根据细胞计数结果，在离心管中加入一定量培养基，使管内细胞密度为冻存终密度的2倍；
5A）向细胞悬液中沿管壁缓缓加入与管内已加入专用培养基等体积的细胞冻存液，轻轻吹打混匀，使细胞密度范围在0.5～1×103/ml；
6A）将细胞悬液分装于冻存管内，并冻存管上做好标记；
7A）将需冻存的细胞置于装有异丙醇的冻存盒中，于-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐；其中，所述的步骤1A）和步骤2A）中的保存液为0.9%生理盐水；所述的步骤4A）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF-BB、bFGF、(TGF)-β1、EGF和Transferrin ；其中，PDGF-BB含量为50～100ng/mL；bFGF含量为0～50ng/mL；(TGF)-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30 ng/mL；Transferrin含量为2.0～4.5mg/mL；所述的步骤6A）中的蜕膜间充质干细胞冻存液由基础液、渗透性冷冻保护剂，所说的渗透性冷冻保护剂浓度为1-1.4mol/所说的基础液为培养液DMEM/F12；所说的渗透性冷冻保护剂为二甲基亚砜。
2. 如权利要求1所述的经血间充质干细胞的培养方法，其特征是：所述步骤1）中，获取经血干细胞的方法为对经血进行差异离心充分洗涤并除菌，再用羟乙基淀粉获得经血中的干细胞。
3. 如权利要求2所述的经血间充质干细胞的培养方法，其特征是：所述的差异离心为首次离心为800-1000g/5-15min，除去上清，加入含有抗生素的生理盐水充分混匀，再次离心为300-700g/5-15min，除去上清。
4. 如权利要求1所述的经血间充质干细胞的培养方法，其特征是：所述步骤3）中，原代培养的方法为，将重悬的经血干细胞分装到培养瓶中，添加无血清培养基，置于二氧化碳恒温恒湿培养箱培养，培养条件恒温为37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2%；每隔2-3天换液一次。
5. 根据权利要求1 所述的制备经血间充质干细胞的方法，其特征在于：所述的步骤1A）和步骤2A）中的保存液还含有抗生素，所说的抗生素为青霉素、链霉素、两性霉素B。”
驳回决定中引用以下对比文件：
对比文件1：CN103305461 A，公开日：2013年09月18日。
驳回决定认为：（1）权利要求1请求保护一种制备经血间充质干细胞的方法。对比文件1（参见权利要求书、说明书第2页、实施例1-3）公开了一种制备间充质干细胞的方法。权利要求1与对比文件1相比的区别特征在于：限定了采集经血的方法；差异离心的转速不同，离心的具体步骤；差异离心后还加入羟乙基淀粉，混匀后静止10-60分钟，取得经血干细胞；限定了传代的接种密度；限定了在-80℃冰箱12-24h后转入液氮，以及细胞冻存的具体步骤；限定了抗生素的选择和浓度，并与生理盐水混匀；限定了保存液、无血清培养基、细胞冻存液的配方组成。权利要求1实际解决的技术问题是：获得通过经血制备间充质干细胞的具体方法。然而，采用无菌容器以及容器的具体选择均是本领域的常规技术；通过差异离心分离间充质干细胞的具体转速和步骤是通过有限实验可获得的且分离的效果是可以预期的；羟乙基淀粉是常规的红细胞去除方法，具体沉淀方法是通过常规实验可以获得的；分离传代速度和冻存时间以及冻存方法等常规实验操作的具体步骤均是有限实验可获得的；选择PBS或生理盐水作为保存液是常规选择，抗生素的种类和浓度是有限实验可获得；使用无血清培养基并添加所述因子以及细胞冻存保护剂的配方均是本领域常规技术，其各自含量是通过有限实验可以确定的。因此，在对比文件1的基础上，结合本领域常规技术和有限实验获得权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备创造性。权利要求2-5的附加技术特征或者被对比文件1公开，或者是本领域的常规实验手段，因此，权利要求2-5也不具备创造性。（2）对于申请人的意见陈述，审查员认为：两性霉素B是本领域常见抗生素，没有证据表明两性霉素B优于其他抗生素；根据不同沉降速度对不同成分进行分离是本领域常规技术且离心后能够降低污染水平是可以预期的；HES是常规分离红细胞的方法，本领域技术人员有动机选择该方法去除红细胞并减少污染；为了维持干细胞的多能性，提高实际应用的安全性，通常会采用无血清培养基，而采用无血清培养基培养传代后能够维持干细胞干性是可以预期的。
申请人深圳市北科生物科技有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年06月19日向国家知识产权局提出了复审请求，但未提交修改的申请文件。复审请求人认为：（1）本申请的保存液的成分以及差异离心的转速和步骤与对比文件1不同，能够最大量的获得经血原干细胞，且差异分离和HES可以降低污染水平；（2）对比文件1未公开两性霉素B，本申请验证得到了三项抗生素使用时的配比，达到了较好的实施效果；（3）本申请的培养基不含胎牛血清，含有多种细胞因子，可以减少动物源成分的使用，以及采用了不同的分离传代速度，使细胞从P0代传代到P30代且维持性能稳定，而对比文件1细胞的增殖和干性会下降，存在易衰老等问题；（4）由10%DMSO和培养基组成的冻存保护液并非是有限实验可获得的。因此，权利要求1-5具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年06月25日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，本申请未记载申请人所称发明点相关的比较实验，无法确定所做选择带来了预料不到的技术效果，在此基础上，离心步骤、抗生素的选择、培养基的组成、细胞冻存步骤均属于常规技术，效果可以预期，因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
复审请求人在提出复审请求时未提交修改的申请文件，因此，本复审请求审查决定所针对的文本同驳回决定所依据的文本，即，2014年12月29日申请日提交的说明书第1-7页（即第1-47段）、说明书附图第1-7页（即图1-图11）、说明书摘要、摘要附图，以及2017年10月26日提交的权利要求第1-5项。
（二）专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果权利要求请求保护的发明相对于最接近的现有技术存在区别特征，而现有技术整体上没有给出将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其实际存在的技术问题的技术启示，并且该区别特征的引入使得发明的技术方案产生了有益的技术效果，则不能得出该权利要求不具备创造性的结论。
本案中，权利要求1请求保护一种制备经血间充质干细胞的方法。对比文件1（参见权利要求1-5、说明书第22-23段）公开了一种制备间充质干细胞的方法，包括：（1）月经产物采集：收集月经开始第2-3天的月经产物，将月经产物加入样本采集管内，样本采集管内的采集液为100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的pH 7.0-7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）及肝素，样本采集管可在0-12℃存放36小时；（2）使用Ⅳ胶原酶进行月经产物预处理；（3）分离间充质干细胞：将孵育后的液体用100μm细胞筛网过滤，收集滤液，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心收集单个核细胞的方法，制备获得原代月经产物来源间充质干细胞；（4）扩增间充质干细胞：取原代月经产物来源间充质干细胞与培养液混匀，接种至细胞培养瓶，接种后24小时更换培养液，以后每3天更换一次培养液；细胞贴满培养瓶底80%以上时，吸弃培养瓶内旧培养液，吸取pH 7.0-7.4的磷酸盐缓冲液反复浸洗培养瓶底部贴壁细胞，吸弃洗涤液；加入0.125%-0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，静置1-3min，加入等体积的胎牛血清，再加入pH 7.0-7.4的磷酸盐缓冲液制备细胞悬液；转移细胞悬液至离心管内，室温下离心，1000转/分钟，离心5分钟；弃去离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀中加入培养液重悬；分装细胞悬液至若干个细胞培养瓶，各瓶补加培养液；待细胞铺满瓶底80%以上时，按照上述方法继续传代，即为扩增月经产物来源间充质干细胞；（5）冻存间充质干细胞：取经扩增的月经产物来源间充质干细胞，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，静置1-3min，加入等体积的胎牛血清，再加入pH 7.0-7.4的磷酸盐缓冲液制备细胞悬液；转移细胞悬液至离心管内，室温下离心洗涤1-2次，1000转/分钟，离心5分钟；弃去离心后上清液，保留细胞沉淀，沉淀细胞即为待冻存的月经产物来源间充质干细胞；将0-4℃冷藏后的细胞冻存保护液与待冻存的月经产物来源间充质干细胞混合，使细胞密度为1-3×106/ml，将混合细胞后的冻存保护液分装至冻存管，分装完成后，将冻存管置于冻存盒中，在0-5℃冷藏20-40分钟，在零下80℃冷冻4-6小时，最后放入零下196℃保存，即得。其中扩增间充质干细胞时细胞接种密度优化为2×104/cm2，接种液体量为15mL。冻存间充质干细胞时细胞冻存密度为1.5×106/ml，装量为1.5mL。冻存保护液为冻存保护液为胎牛血清（FBS）与二甲基亚砜（DMSO）混合液，体积比为9:1。培养液为体积比为9:1的DMEM/F12和胎牛血清（FBS）。权利要求1与对比文件1相比的区别特征在于：（1）权利要求1限定了经血采集步骤使用的容器、保存液和保存温度；（2）权利要求1中使用差异离心和羟乙基淀粉沉淀的方式取得经血干细胞，而对比文件1采用胶原酶解、细胞筛网过滤、淋巴细胞分离液密度梯度离心的方式取得经血干细胞；（3）权利要求1限定了采用无血清培养基进行培养和培养基组成、传代培养的时间点、接种细胞密度、培养基更换时机；（4）权利要求1中冷冻保存液为10%DMSO 培养基，而对比文件1中为10%DMS0 胎牛血清，且权利要求1限定了具体的保护液配制步骤；权利要求1限定的冻存的消化步骤与对比文件1略有不同；权利要求1的冻存步骤不包括0-5℃保存，且-80℃保存时间不同；权利要求1还限定了细胞计数、调整管内细胞密度、冻存管标记等步骤。权利要求1实际解决的技术问题是：提供一种使用无血清培养基制备经血间充质干细胞的方法。
尽管其他区别特征或者是本领域的常规实验手段，或者是在对比文件1的基础上可以常规调整确定的，其相应的效果也均是可以预料到的，也没有证据表明本申请相对于对比文件1在污染率等方面有何预料不到的技术效果。但是，对比文件1所使用的培养基为9:1的DMEM/F12和胎牛血清FBS，而本申请的培养基为DMEM/F12的无血清培养基。本领域技术人员知晓，血清中存在大量的细胞因子和生长因子用以支撑细胞的生存和增殖，且对于不同种类的细胞，生长增殖所需的细胞因子和生长因子的种类和浓度不同。在没有现有技术证据和公知常识性证据足以证明采用哪些种类和浓度的细胞因子和生长因子可以用以支撑经血干细胞的生长和增殖的基础上，本领域技术人员没有动机去除对比文件1的培养基中含有的胎牛血清，也无法预期采用权利要求1中限定的培养基是否能够培养获得经血干细胞。因而，在对比文件1的基础上，结合本领域的常规技术手段和有限实验无法显而易见地获得权利要求1请求保护的技术方案，且本申请说明书中记载了采用无血清培养基能够培养获得经血干细胞并稳定培养至P10代的有益效果，因此，权利要求1相对于对比文件1和常规实验手段的结合具备专利法第22条第3款规定的创造性。
在权利要求1具备创造性的基础上，直接或间接引用权利要求1的从属权利要求2-5也具备专利法第22条第3款规定的创造性。
驳回决定和前置审查意见书中认为：为了避免动物源成分，使用无血清培养基，并添加TGF/PDGF/EGF等细胞生长因子是本领域的常规技术，其含量也是本领域技术人员根据有限实验即可确定的。本领域技术人员为了维持干细胞的多能性，提高实际应用的安全性，通常会采用无血清培养基对其进行培养，采用无血清培养基培养传代后能够维持干细胞干性也是本领域技术人员能够预期的。由于本申请说明书中未记载比较实验，培养基的组成是本领域的常规技术，且效果可以预期。
对此，合议组认为：首先，为避免血清中动物源成分复杂和各批次之间稳定性不足等已知缺陷，而尝试采用成分确定的无血清培养基是本领域普遍存在的技术追求，且权利要求1中所列细胞因子均为本领域细胞培养时常规可选用的细胞因子种类。但是，现有技术已知的可用于细胞培养的众多细胞因子中，何种具体种类和浓度的细胞因子可用以培养特定种类的细胞，例如经血干细胞，并非本领域的常规技术和公知常识，在没有现有技术证据或公知常识性证据足以证明权利要求1中所限定的细胞因子足以支撑经血干细胞的生长、增殖和干性维持等性能的基础上，本领域技术人员无法显而易见地获得可用于经血干细胞的培养和冻存的无血清培养基。其次，本申请实施例中已经记载了所使用的无血清培养基可以培养经血干细胞至P10代，并维持其表面标记、生长曲线、端粒酶、致癌基因和抑癌基因等生理生化状态与P2代或P5代等代次近似，即能够实现经血干细胞培养和维持的有益的技术效果。最后，在本领域技术人员无法显而易见地获得请求保护的技术方案所使用的培养基且本申请已经证实了所使用的无血清培养基可以实现培养经血干细胞的技术效果的前提下，无需依赖比较实验结果就能确定权利要求1-5是具备创造性的。因此，驳回决定和前置审查意见的理由不成立。
基于上述理由，本案合议组作出以下审查决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2018年03月20日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审请求审查决定所针对文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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