发明创造名称：一种测定血清中抗核抗体的试剂盒及其制备方法
外观设计名称：
决定号：196775
决定日：2019-11-19
委内编号：1F263129
优先权日：
申请（专利）号：201710947220.9
申请日：2017-10-12
复审请求人：上海川至生物技术有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：李鹏飞
合议组组长：袁野
参审员：李文斐
国际分类号：G01N33/68，G01N33/543，G01N33/544，G01N33/531
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求请求保护的技术方案与最接近的现有技术公开的技术方案之间具有区别技术特征，该区别技术特征的一部分被其它对比文件公开，且其在该对比文件中的作用与其在本申请中的作用相同，另一部分属于本领域的惯用技术手段，则该权利要求请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201710947220.9、名称为“一种测定血清中抗核抗体的试剂盒及其制备方法”的发明专利申请（下称本申请），申请人为上海川至生物技术有限公司。本申请的申请日为2017年10月12日，公开日为2018年02月23日。
国家知识产权局专利实质审查部门以本申请权利要求1-8不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由，于2018年07月30日驳回了本申请。
驳回决定中引用了如下对比文件：
对比文件1：CN 104749375A，公开日为2015年07月01日；
对比文件2：US 4636479A， 公开日为1987年01月13日。
驳回决定所针对的文本为：2018年06月25日提交的权利要求第1-8项；2017年10月31日提交的说明书第1-15页；申请日2017年10月12日提交说明书附图第1-2页、说明书摘要及摘要附图。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：包括R1试剂、R2试剂和校准品；
所述R1试剂包含缓冲液、电解质、表面活性剂、稳定剂、反应增强剂、防腐剂；
所述R2试剂包含缓冲液、电解质、表面活性剂、稳定剂、防腐剂和包被ANA抗原的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒；
所述校准品包含缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂和抗核抗体(ANA)；所述R2试剂中的ANA抗原采用纯化抗原组合，或者采用Hep-2细胞匀浆提取物和纯化抗原组合的混合物；所述R2试剂中的纯化抗原组合包含Sm、Sm/RNP、SSA/Ro、SSB/La四种抗原；所述ANA抗原通过碳二亚胺反应共价结合到所述胶乳颗粒上。
2. 根据权利要求1所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：所述R1试剂、R2试剂及校准品中的缓冲液选用Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或PIPES缓冲液；
所述R1试剂、R2试剂中的电解质为无机盐，选用氯化钠、氯化镁或氯化钾中的任一种或多种；
所述R1试剂、R2试剂及校准品中的表面活性剂为Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、TritonX-100、Span40、Span80中的任一种或多种；
所述R1试剂、R2试剂及校准品中的稳定剂为蛋白质、金属螯合剂、混悬剂和抗氧化剂中的任一种或多种；
所述R1试剂中所使用的反应增强剂是聚乙二醇4000～600000、聚凝胺、葡聚糖的任一种或多种；
所述R1试剂、R2试剂及校准品中的防腐剂是叠氮钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、Proclin300、Proclin500中的任一种或多种。
3. 根据权利要求2所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：所述R1试剂、R2试剂及校准品所用稳定剂中的蛋白质为小牛血清、牛血清白蛋白或明胶；金属螯合剂为含有氨基二乙酸基团的螯合剂EDTA、EGTA、 EDTP、DTPA中的任一种或几种；混悬剂为蔗糖、麦芽糖、乳糖、乙二醇、丙三醇中的任一种或多种。
4. 根据权利要求1所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：所述致敏聚苯乙烯胶乳颗粒表面通过交联剂修饰；其中致敏聚苯乙烯胶乳颗粒采用羧基化或氨基化的聚苯乙烯胶乳颗粒；对于羧基化的胶乳颗粒，交联剂采用碳二亚胺；对于氨基化的胶乳颗粒，交联剂采用戊二醛或N-羟基琥珀酰亚胺；且所述胶乳颗粒的直径为70～400nm、浓度为0.1％～0.5％。
5. 根据权利要求1所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：所述R2试剂中的ANA抗原是通过对羊源、兔源、牛源、鼠源或人源天然抗原的纯化、基因重组表达再纯化，或是经体外细胞培养再纯化。
6. 根据权利要求1所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：所述R2试剂中采用的纯化抗原组合还包括dsDNA、ssDNA、组蛋白、Nucleosome(核小体)、U1-snRNP、Scl-70、Jo-1、Rib-P、PCNA、CENPB、AMA-M2抗原中的任一种或几种。
7. 根据权利要求1所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：R1试剂、R2试剂和校准品，其中，
所述R1试剂包含：2％～8％的聚乙二醇6000、3％～8％的氯化镁、0.5％～2％的Tween20、0.01％～0.1％的TritonX-100、0.1％～0.5％的牛血清白蛋白、0.02％～0.08％的EDTA、0.01％～0.05％的防腐剂、其余为pH7.0-8.0的30～100mmol的Tris缓冲液；
所述R2试剂包含直径为70-400nm、浓度为0.1％～0.5％的包被有ANA抗原的致敏胶乳颗粒，0.1％-0.5％的牛血清白蛋白，0.5％-2％的Tween20，0.01％-0.1％的TritonX-100，0.01％-0.05％的叠氮钠，其余为pH7.0-8.0的30～100mmol的Tris缓冲液；
所述校准品包含0-200RU/ml的抗核抗体，0.1％-0.5％的牛血清白蛋白，0.5％-2％的Tween20，0.01％-0.1％的TritonX-100，0.01％-0.05％的叠氮钠，其余为pH7.0-8.0的30～100mM的Tris缓冲液。
8. 如权利要求1-7任一项所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒的制备 方法，包括如下步骤：
(1)R1试剂的制备：
在pH7.5缓冲液中依次加入反应增强剂、电解质、表面活性剂、防腐剂，低速搅拌混合均匀；完成后2～8℃保存；得无色或微黄色透明液体的R1试剂；
(2)R2试剂的制备：
S1、胶乳活化：取适量胶乳，用10倍于胶乳体积、pH为7.5的缓冲液清洗，再用缓冲液稀释至4倍体积，接着加入1倍胶乳体积的1％的碳二亚胺EDC均匀振摇活化，活化时间为30min～1h；
S2、抗原标记：活化好的胶乳中加入ANA抗原,加入比例为每毫升活化胶乳0.5～6mg抗核抗体,于37℃轻微均匀振摇2小时，再加入一倍体积的封闭缓冲液于室温均匀摇晃2小时；
封闭缓冲液包括如下成分：蛋白质，PH7.5缓冲液，甘氨酸，表面活性剂；
S3、清洗复溶：标记并封闭好的胶乳离心30min，弃去上清，再用pH7.5的缓冲液清洗复溶，重复3次，最后用胶乳贮存缓冲液稀释复溶至5倍胶乳体积，得到的胶乳原液于2～8℃保存待用；
胶乳贮存缓冲液包括如下成分：PH7.5缓冲液，蛋白质，表面活性剂，防腐剂；
S4、确定稀释比例：取胶乳原液小样稀释后进行测试，根据试样的结果确定稀释比例，基本控制胶乳浓度在0.1％～0.5％之间；
S5、R2试剂的配制：取胶乳原液，根据试样确定的稀释比例加入胶乳贮存缓冲液，低速搅拌至全部混匀，2～8℃保存，制备好的R2试剂为乳白色液体；
(3)校准品的制备：
在pH7.5缓冲液中依次加入蛋白质、表面活性剂、防腐剂于适当容器中，低速搅拌至全部溶解，再加蒸馏水定容至所需体积，室温混合25-40分钟，用0.45μm孔径滤器过滤，即制备完成校准品缓冲液；
根据需制备的校准品浓度及体积，计算所需抗核抗体的量，加入相应校准品缓冲液中，低速搅拌均匀，即得到相应浓度的液态校准品，液态校准品为无色至微黄色液体。”
驳回决定具体指出：1、权利要求1请求保护一种测定血清中抗核抗体的试剂盒，其与对比文件1的区别技术特征为：（1）被测物不同，因此试剂中包被以及校准品中的相应配体不同；（2）所述ANA抗原通过碳二亚胺反应共价结合到胶乳颗粒上，第二试剂包含稳定剂。关于上述区别技术特征（1），对比文件1与权利要求1请求保护的试剂盒均采用胶乳增强免疫比浊法，在此基础上，当需要检测ANA时，本领域技术人员容易想到将ANA抗原包被于致敏聚苯乙烯胶乳颗粒上，同时将校准品中的标准抗体替换为ANA。区别技术特征（2）部分被对比文件1和2公开，部分属于本领域的常规手段。所以，对于本领域的技术人员而言，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的公知常识得到权利要求1的技术方案是显而易见的。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、权利要求2-7的附加技术特征或者被对比文件1公开，或者被对比文件2公开，或者属于本领域的公知常识。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求2-7也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。3、权利要求8请求保护如权利要求1-7任一项所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒的制备方法，参见前面的评述可知，权利要求1-7不具备创造性，对比文件1进一步公开了试剂盒中各试剂的配制方法，而针对不同的配体，对实验参数例如时间、体积等进行调整以选择最佳的实验条件是本领域技术人员的常规手段。所以，对于本领域的技术人员而言，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的公知常识得到权利要求8的技术方案是显而易见的。因此，权利要求8不具备专利法第22条第3款规定的创造性。4、在其他说明部分指出：将权利要求2中记载的“Proclin950”修改为“Proclin500”，该修改超出了原说明书和权利要求书记载的范围，不符合专利法第33条的规定。
申请人上海川至生物技术有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年09月28日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书的全文修改替换页。具体修改涉及：1）删除权利要求1中的技术特征“所述ANA抗原通过碳二亚胺反应共价结合到所述胶乳颗粒上”，将权利要求4的附加技术特征加入权利要求1中，同时删除权利要求4；2）将权利要求2记载的“Proclin500”修改为“Proclin950”；3）适应性修改部分权利要求的编号及引用关系。
提出复审请求时提交的权利要求书如下：
“1. 一种测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：包括R1试剂、R2试剂和校准品；
所述R1试剂包含缓冲液、电解质、表面活性剂、稳定剂、反应增强剂、防腐剂；
所述R2试剂包含缓冲液、电解质、表面活性剂、稳定剂、防腐剂和包被ANA抗原的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒；
所述校准品包含缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂和抗核抗体(ANA)；
所述R2试剂中的ANA抗原采用纯化抗原组合，或者采用Hep-2细胞匀浆提取物和纯化抗原组合的混合物；
所述R2试剂中的纯化抗原组合包含Sm、Sm/RNP、SSA/Ro、SSB/La四种抗原；
所述致敏聚苯乙烯胶乳颗粒表面通过交联剂修饰；其中致敏聚苯乙烯胶乳颗粒采用羧基化或氨基化的聚苯乙烯胶乳颗粒；对于羧基化的胶乳颗粒，交联剂采用碳二亚胺；对于氨基化的胶乳颗粒，交联剂采用戊二醛或N-羟基琥珀酰亚胺；且所述胶乳颗粒的直径为70～400nm、浓度为0.1％～0.5％。
2. 根据权利要求1所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：所述R1试剂、R2试剂及校准品中的缓冲液选用Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或PIPES缓冲液；
所述R1试剂、R2试剂中的电解质为无机盐，选用氯化钠、氯化镁或氯化钾中的任一种或多种；
所述R1试剂、R2试剂及校准品中的表面活性剂为Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、TritonX-100、Span40、Span80中的任一种或多种；
所述R1试剂、R2试剂及校准品中的稳定剂为蛋白质、金属螯合剂、混悬剂和抗氧化剂中的任一种或多种；
所述R1试剂中所使用的反应增强剂是聚乙二醇4000～600000、聚凝胺、葡聚糖的任一种或多种；
所述R1试剂、R2试剂及校准品中的防腐剂是叠氮钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、Proclin300、Proclin950中的任一种或多种。
3. 根据权利要求2所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：所述R1试剂、R2试剂及校准品所用稳定剂中的蛋白质为小牛血清、牛血清白蛋白或明胶；金属螯合剂为含有氨基二乙酸基团的螯合剂EDTA、EGTA、EDTP、DTPA中的任一种或几种；混悬剂为蔗糖、麦芽糖、乳糖、乙二醇、丙三醇中的任一种或多种。
4. 根据权利要求1所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：所述R2试剂中的ANA抗原是通过对羊源、兔源、牛源、鼠源或人源天然抗原的纯化、基因重组表达再纯化，或是经体外细胞培养再纯化。
5. 根据权利要求1所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：所述R2试剂中采用的纯化抗原组合还包括dsDNA、ssDNA、组蛋白、Nucleosome(核小体)、U1-snRNP、Scl-70、Jo-1、Rib-P、PCNA、CENPB、AMA-M2抗原中的任一种或几种。
6. 根据权利要求1所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：R1试剂、R2试剂和校准品，其中，
所述R1试剂包含：2％～8％的聚乙二醇6000、3％～8％的氯化镁、0.5％～2％的Tween20、0.01％～0.1％的TritonX-100、0.1％～0.5％的牛血清白蛋白、0.02％～0.08％的EDTA、0.01％～0.05％的防腐剂、其余为pH7.0-8.0的30～100mmol的Tris缓冲液；
所述R2试剂包含直径为70-400nm、浓度为0.1％～0.5％的包被有ANA抗原的致敏胶乳颗粒，0.1％-0.5％的牛血清白蛋白，0.5％-2％的Tween20，0.01％-0.1％的TritonX-100，0.01％-0.05％的叠氮钠，其余为pH7.0-8.0的30～100mmol的Tris缓冲液；
所述校准品包含0-200RU/ml的抗核抗体，0.1％-0.5％的牛血清白蛋白，0.5％-2％的Tween20，0.01％-0.1％的TritonX-100，0.01％-0.05％的叠氮钠，其余为pH7.0-8.0的30～100mM的Tris缓冲液。
7. 如权利要求1-6任一项所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)R1试剂的制备：
在pH7.5缓冲液中依次加入反应增强剂、电解质、表面活性剂、防腐剂，低速搅拌混合均匀；完成后2～8℃保存；得无色或微黄色透明液体的R1试剂；
(2)R2试剂的制备：
S1、胶乳活化：取适量胶乳，用10倍于胶乳体积、pH为7.5的缓冲液清洗，再用缓冲液稀释至4倍体积，接着加入1倍胶乳体积的1％的碳二亚胺EDC均匀振摇活化，活化时间为30min～1h；
S2、抗原标记：活化好的胶乳中加入ANA抗原，加入比例为每毫升活化胶乳0.5～6mg抗核抗体，于37℃轻微均匀振摇2小时，再加入一倍体积的封闭缓冲液于室温均匀摇晃2小时；
封闭缓冲液包括如下成分：蛋白质，PH7.5缓冲液，甘氨酸，表面活性剂；
S3、清洗复溶：标记并封闭好的胶乳离心30min，弃去上清，再用pH7.5的缓冲液清洗复溶，重复3次，最后用胶乳贮存缓冲液稀释复溶至5倍胶乳体积，得到的胶乳原液于2～8℃保存待用；
胶乳贮存缓冲液包括如下成分：PH7.5缓冲液，蛋白质，表面活性剂，防腐剂；
S4、确定稀释比例：取胶乳原液小样稀释后进行测试，根据试样的结果确定稀释比例，基本控制胶乳浓度在0.1％～0.5％之间；
S5、R2试剂的配制：取胶乳原液，根据试样确定的稀释比例加入胶乳贮存缓冲液，低速搅拌至全部混匀，2～8℃保存，制备好的R2试剂为乳白色液体；
(3)校准品的制备：
在pH7.5缓冲液中依次加入蛋白质、表面活性剂、防腐剂于适当容器中，低速搅拌至全部溶解，再加蒸馏水定容至所需体积，室温混合25-40分钟，用0.45μm孔径滤器过滤，即制备完成校准品缓冲液；
根据需制备的校准品浓度及体积，计算所需抗核抗体的量，加入相应校准品缓冲液中，低速搅拌均匀，即得到相应浓度的液态校准品，液态校准品为无色至微黄色液体。”
复审请求人认为：1、修改后权利要求1与对比文件1的区别至少有：1）权利要求1中的被测物为ANA抗体，对比文件1中的被测物为C肽；2）R2试剂中的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒包被的纯化抗原组合包含Sm、Sm/RNP、SSA/Ro、SSB/La四种抗原，对比文件1中第二试剂中的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒仅包被有C肽抗体；3）权利要求1限定了致敏聚苯乙烯胶乳颗粒采用羧基化或氨基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，对于羧基化的胶乳颗粒，交联剂采用碳二亚胺；对于氨基化的胶乳颗粒，交联剂采用戊二醛或N-羟基琥珀酰亚胺，且胶乳颗粒的直径为70～400nm、浓度为0.1％～0.5％。基于上述区别，权利要求1实际要解决的技术问题是：提供一种测定血清中抗核抗体的试剂盒，以快速、准确测定血清中抗核抗体的含量；
2、对比文件2公开了使用增强胶乳凝集法检测ANA的方法，但其抗原与胶乳微球的结合方式与权利要求1中所述的抗原通过碳二亚胺或戊二醛或N-羟基琥珀酰亚胺反应共价结合到胶乳微球的羧基或氨基的结合方式不同。本领域公知，不同的抗原或抗体的特性不同，其以物理吸附或共价结合的方式偶联到胶乳颗粒表面所需的条件不同。虽然通过碳二亚胺或戊二醛或N-羟基琥珀酰亚胺反应将抗原或抗体以共价结合的形式包被到羧基化或氨基化的胶乳颗粒表面是本领域的常规技术手段，但在该方法中，均是将一种抗原或抗体与胶体金颗粒、胶乳颗粒或荧光微球偶联，现有技术中没有关于将两种或多种不同抗原或抗体以共价结合的方式偶联到同一微球载体上的记载；
3、本申请中的试剂盒可定量检测血清中的ANA含量，适用于普通生化仪，操作简单，检测时间不超过10分钟，对浓度为51.2RU/mL的校准品进行检测，相对偏差为0.85%，准确度好，样本浓度在20.0-100.0RU/mL范围内时，CV≦5%，重复性好。即本申请取得了预料不到的技术效果。因此，本申请具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年10月25日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年07月31日向复审请求人发出复审通知书，指出：1、权利要求1请求保护一种测定血清中抗核抗体的试剂盒，其与对比文件1的区别技术特征在于：权利要求1请求保护的是一种测定血清中抗核抗体的试剂盒，相应的，所述R2试剂中的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒包被ANA抗原；校准品中还包括抗核抗体；所述R2试剂中的ANA抗原采用纯化抗原组合，或者采用Hep-2细胞匀浆提取物和纯化抗原组合的混合物；所述R2试剂中的纯化抗原组合包含Sm、Sm/RNP、SSA/Ro、SSB/La四种抗原。上述区别技术特征部分被对比文件2公开，部分属于本领域的公知常识。所以，对于本领域的技术人员而言，在对比文件1的基础上结合本领域的公知常识得到权利要求1的技术方案是显而易见的。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、权利要求2-6的附加技术特征或者被对比文件1公开，或者被对比文件2公开，或者属于本领域的公知常识。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求2-6也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。3、权利要求7请求保护如权利要求1-6任一项所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒的制备方法，参见前面的评述可知，权利要求1-6不具备创造性，对比文件1进一步公开了试剂盒中各试剂的配制方法，当在对比文件2的技术启示下，将致敏聚苯乙烯胶乳颗粒表面包被的抗人C肽抗体替换为ANA抗原时，针对不同的配体，对实验参数例如时间、体积等进行调整以选择最佳的实验条件是本领域技术人员普通实验手段。所以，对于本领域的技术人员而言，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的公知常识得到权利要求7的技术方案是显而易见的。因此，权利要求7不具备专利法第22条第3款规定的创造性。4、合议组针对复审请求人的意见陈述进行了答复。
针对上述复审通知书，复审请求人于2019年09月11日提交了意见陈述书，未对申请文件进行修改，仅在意见陈述书中陈述了本申请具备创造性的理由。
复审请求人认为：本申请权利要求1与对比文件1的区别技术特征至少包括：（1）本申请的被测物为ANA抗体，对比文件1中的被测物为C肽；（2）本申请所述的R2试剂中的ANA抗原采用纯化抗原组合，或者采用Hep-2细胞匀浆提取物和纯化抗原组合的混合物，纯化抗原组合包含Sm、Sm/RNP、SSA/Ro、SSB/La四种抗原，对比文件1中所述第二试剂中的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒仅包被有C肽抗体。基于上述区别技术特征，本申请权利要求1实际要解决的技术问题是：提供一种测定血清中抗核抗体的试剂盒，能够满足临床上对ANA的检测需求，可以在各级医疗机构普遍配备的生化分析仪上实现ANA快速、准确的定量测量。关于上述区别技术特征，首先，本申请与对比文件1所检测的对象并不相同，不同的抗原或抗体的特性是不同的，例如分子量、等电点、氨基酸残基种类和分子构象等，而不同蛋白各自的性质决定了其检测方法不同。尽管胶乳增强免疫比浊法是本领域的常规技术手段，其检测原理已知，但由于不同蛋白包被时所利用的检测条件不同，所以，每种标志物的检测方法都是不通用的，必然需要付出创造性的劳动。其次，对比文件2虽然公开了将ANA抗原包被于胶乳颗粒上，使用胶乳凝集法检测抗核抗体，并且可将检测试剂形成试剂盒，但对比文件2是在胶乳微球上包被小牛胸腺染色质，即对比文件2中形成胶乳凝集的关键因素是样本中的ANA与小牛胸腺染色质中的特异性抗原结合，其中的小牛胸腺染色质是形成胶乳凝集不可缺少的因素。另外，对比文件2所述的ANA检测方法，其灵敏度和特异性都非常低，实际上并不能满足临床上对ANA的检测需求，无法解决本申请的技术问题。再次，尽管本申请中的Hep-2、Sm、Sm/RNP、SSA/Ro、SSB/La等均是本领域的常规抗原，但由于每种抗原在检测时与抗体的反应性均不相同，何种抗原适合于共价偶联到胶乳颗粒上，并能符合临床检测ANA的要求，本领域技术人员基于对比文件1-2不能显而易见地得到，其也不是本领域的常规选择。并且，本申请的ANA检测法实现了快速化、自动化、定量化检测，且灵敏度高、稳定性强，具有有益的技术效果。因此，本申请的权利要求具备创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以做出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人在提出复审请求时提交了权利要求书的全文修改替换页，经审查，该修改符合专利法第33条的规定。本复审请求审查决定所针对的文本为：2018年09月28日提交的权利要求第1-7项；2017年10月31日提交的说明书第1-15页；申请日2017年10月12日提交说明书附图第1-2页、说明书摘要及摘要附图。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果权利要求请求保护的技术方案与最接近的现有技术公开的技术方案之间具有区别技术特征，该区别技术特征的一部分被其它对比文件公开，且其在该对比文件中的作用与其在本申请中的作用相同，另一部分属于本领域的惯用技术手段，则该权利要求请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，不具备创造性。
具体到本案：
1）权利要求1请求保护一种测定血清中抗核抗体的试剂盒，对比文件1公开了一种测定血清中C肽含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，具体公开了以下技术特征（参见说明书第[0004]-[0047]段）：所述试剂盒包括第一试剂（相当于R1试剂）、第二试剂（相当于R2试剂）和校准品；所述第一试剂包含缓冲液、电解质、表面活性剂、稳定剂、反应增强剂以及防腐剂，所述第二试剂包含缓冲液、电解质、表面活性剂、防腐剂以及包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，所述校准品包含缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂和人C肽蛋白（参见说明书第[0007]-[0010]段）；致敏聚苯乙烯胶乳颗粒是通过交联剂将胶乳颗粒表面基团活化后再进行抗人C肽抗体的包被（即致敏聚苯乙烯胶乳颗粒表面经过交联剂修饰），羧基化的胶乳颗粒通过碳二亚胺（EDC或EDAC）进行活化，氨基化的胶乳颗粒通过戊二醛进行活化（参见说明书第[0017]段）；其中，第二试剂中包含0.2%的牛血清白蛋白（相当于稳定剂，即第二试剂中可以包含稳定剂）、0.01%的叠氮钠，包被有抗人C肽抗体的致敏胶乳颗粒的直径为180nm左右（落入权利要求1所限定的70-400nm的范围），浓度为0.3%-0.5%（落入权利要求1所限定的0.1%-0.5%的范围）。
权利要求1与对比文件1的区别技术特征为：权利要求1请求保护的是一种测定血清中抗核抗体（以下也称ANA）的试剂盒，相应的，所述R2试剂中的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒包被ANA抗原；校准品中还包括抗核抗体；所述R2试剂中的ANA抗原采用纯化抗原组合，或者采用Hep-2细胞匀浆提取物和纯化抗原组合的混合物；所述R2试剂中的纯化抗原组合包含Sm、Sm/RNP、SSA/Ro、SSB/La四种抗原。
基于上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题是：提供一种快速、简便的检测抗核抗体（ANA）的方法。对比文件2公开了一种增强凝集法及试剂盒，具体公开了以下特征（参见说明书第21栏第25行-第22栏第5行）：利用增强胶乳颗粒凝集法检测抗核抗体（ANA），其中ANA胶乳颗粒为包被小牛胸腺染色质（包含ANA抗原）的胶乳颗粒，将50μl的1:4稀释的阳性对照ANA血清与50μl的ANA胶乳颗粒在载玻片上温育2分钟，之后肉眼检查凝集，并且，可将检测试剂形成为试剂盒的形式（参见说明书第22栏第65-68行）。由此可见，对比文件2公开了将ANA抗原包被于胶乳颗粒上，使用胶乳凝集法检测抗核抗体（ANA），并且，可将检测试剂形成为试剂盒，即对比文件2给出了使用试剂盒快速检测血清中ANA抗体的技术启示，在该技术启示下，本领域技术人员有动机将对比文件1公开的包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒改进为包被ANA抗原的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，相应的，将校准品中的人C肽蛋白替换为抗核抗体（ANA）。另外，ANA抗原是本领域公知的抗原，其来源及种类均属于本领域的公知常识。根据实际检测需要，选择Hep-2、Sm、Sm/RNP、SSA/Ro、SSB/La等抗原或其组合仅仅是本领域技术人员的常规选择。
所以，对于本领域的技术人员而言，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的公知常识得到权利要求1的技术方案是显而易见的。因此，权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
此外，“N-羟基琥珀酰亚胺”是本领域常用的氨基化交联剂，所以，权利要求1中交联剂采用“N-羟基琥珀酰亚胺”的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2）权利要求2-3对其所引用的权利要求作了进一步限定。对比文件1公开了以下技术特征（参见说明书第[0013]-[0016]段）：所述第一试剂、第二试剂以及校准品中所含的缓冲液独立地为选自Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸盐缓冲液及PIPES缓冲液中的一种；所述第一试剂、第二试剂中所含有的电解质为无机盐，所述无机盐为氯化钠、氯化镁；所述第一试剂、第二试剂以及校准品中所含的表面活性剂独立地为选自Tween20、Tween40、Tween60、TritonX-100、Span40及Span80中的一种或多种的组合；所述第一试剂、校准品中所含的稳定剂独立地为选自蛋白质、金属螯合剂、混悬剂及抗氧化剂中的一种或多种的组合，所述蛋白质为小牛血清、牛血清白蛋白或明胶，所述金属螯合剂为EDTA、EGTA、EDTP或DTPA，所述混悬剂为蔗糖、麦芽糖、乳糖、乙二醇或丙三醇；所述的反应增强剂为选自聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、 聚乙二醇6000、聚乙二醇8000及聚凝胺中的一种或多种的组合；所述第一试剂、校准品中所含的防腐剂独立地为选自叠氮钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠及Proclin300中的一种或多种的组合，第二试剂中的防腐剂为叠氮钠。另外，对于对比文件1未公开的上述权利要求中的部分技术方案：表面活性剂为Tween80、反应增强剂为葡聚糖、电解质为氯化钾等，均属于本领域的常规选择。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，上述权利要求2-3也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3）权利要求4-5对其所引用的权利要求作了进一步限定。对比文件2公开了ANA胶乳颗粒为包被小牛胸腺染色质的胶乳颗粒（参见对比文件2说明书第21栏第61-63行）。此外，上述权利要求所限定的抗原来源及具体种类均为常规的ANA的抗原来源和种类，本领域技术人员可以根据实际检测需要选择合适的ANA抗原。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，上述权利要求4-5也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
4）权利要求6对权利要求1作了进一步限定。对比文件1进一步公开了以下特征（参见说明书第[0031]-[0052]段）：第一试剂包含4%的聚乙二醇6000、5%的氯化镁、1%的Tween20、0.05%的TritonX-100、0.2%的牛血清白蛋白、0.04%的EDTA、0.01%的叠氮钠以及pH7.5 40mM的Tris缓冲液；第二试剂包含直径为180nm左右、浓度为0.3%-0.5%的包被有抗人C肽抗体的致敏胶乳颗粒、0.2%的牛血清白蛋白、1%的Tween20、0.05%的TritonX-100、0.01%的叠氮钠以及pH7.5 40mM的Tris缓冲液；校准品包含20ng/ml的C肽蛋白标准品、0.2%的牛血清白蛋白、1%的Tween20、0.05%的TritonX-100、0.01%的叠氮钠以及pH7.5 40mM的Tris缓冲液。由此可见，权利要求6的大部分技术特征已经被对比文件1公开，而校准品中的ANA浓度是本领域技术人员经过有限次实验容易确定的。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，该权利要求也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
5）权利要求7请求保护权利要求1-6任一项所述的测定血清中抗核抗体的试剂盒的制备方法，参见前述评述可知，权利要求1-6已经不具备创造性。对比文件1进一步公开了如下技术特征（参见说明书第[0031]-[0052]段）：
第一试剂的制备方法：按顺序依次加入Tris缓冲液、聚乙二醇6000、氯化镁、Tween20、TritonX-100、牛血清白蛋白、EDTA、叠氮钠于适当容器中，低速搅拌至全部溶解，调节pH至7.5，再加蒸馏水定容至所需体积，室温混合约30分钟，用0.45μm孔径滤器过滤，完成后2～8℃保存，第一试剂为无色或微黄色透明液体；
第二试剂的制备方法：
a)、胶乳活化：取适量胶乳，用10倍于胶乳体积的40mM Tris缓冲液（pH7.5）清洗，再用0.04M Tris缓冲液稀释至4倍体积，加入1倍胶乳体积的1�C均匀振摇活化，活化时间为30min；
b）、抗体标记：活化好的胶乳中加入C肽抗体（加入比例为每ml胶乳2～6mg抗体）于37℃轻微均匀振摇2小时，再加入二分之一体积的封闭缓冲液于室温均匀摇晃2小时，其中封闭缓冲液主要成分及浓度为：0.2%的牛血清白蛋白，40mM pH7.5的Tris，0.5%的甘氨酸，1%的Tween20（即表面活性剂）；
c）、清洗复溶：标记并封闭好的胶乳于20000rpm的条件下离心20min，弃去上清，再用0.04M Tris缓冲液（pH7.5）清洗复溶，重复3次，最后用胶乳贮存缓冲液稀释复溶至4倍胶乳体积，得到的胶乳原液于2～8℃保存待用，胶乳贮存缓冲液主要成分及浓度为：40mM pH7.5的Tris，0.2%的牛血清白蛋白，1%的Tween20，0.05%的TritonX-100，0.01%的叠氮钠（即防腐剂）；
d）、确定稀释比例：取胶乳原液小样进行测试，根据试样的结果确定稀释比例，优选控制胶乳浓度在0.3%～0.5%之间；
e）、R2配制：取胶乳原液，根据确定的稀释比例加入胶乳贮存缓冲液，低速搅拌至全部混匀，2～8℃保存，制备好的第二试剂为乳白色液体；
校准品的制备方法：按顺序依次加入C肽蛋白纯品、Tris缓冲液、牛血清白蛋白、Tween20、TritonX-100、叠氮钠于适当容器中，低速搅拌至全部溶解，调节pH至7.5，再加蒸馏水定容至所需体积，室温混合约30分钟，用0.45μm孔径滤器过滤，即制备完成最高浓度校准品，系列校准品可由最高浓度校准品通过倍比稀释得到，校准品为微黄色透明液体。
可见，对比文件1公开了试剂盒中各试剂的配制方法，当在对比文件2的技术启示下，将致敏聚苯乙烯胶乳颗粒表面包被的抗人C肽抗体替换为ANA抗原时，针对不同的配体，对实验参数例如时间、体积等进行调整以选择最佳的实验条件是本领域技术人员普通实验手段。
所以，对于本领域的技术人员而言，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的公知常识得到权利要求7的技术方案是显而易见的。因此，权利要求7不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、针对复审请求人提出的陈述意见的答复
针对复审请求人在答复复审通知书时的意见陈述，合议组认为：
首先，对比文件1公开的用于检测C肽的试剂盒中所包含的试剂，除了活性成分（即用于与抗体发生特异反应的成分）不同外，其它成分及检测原理均相同，且对比文件1的检测方法同样具有可在一般医疗机构都具有的生化分析仪上使用、灵敏度高、稳定性好、特异性强等优点（参见对比文件1说明书第[0004]段）。即本申请相对于对比文件1的主要改进就在于将聚苯乙烯胶乳颗粒表面包被的活性物质由抗人C肽抗体替换为ANA抗原，由此得到一种检测血清中抗核抗体的试剂盒。
其次，对比文件2公开了一种增强凝集法及试剂盒，具体公开了使用胶乳凝集法检测抗核抗体（ANA），并且，可将检测试剂形成为试剂盒，并将ANA抗原包被于胶乳颗粒上，即对比文件2给出了使用试剂盒快速检测血清中ANA抗体的技术启示，在该技术启示下，本领域技术人员有动机将对比文件1公开的包被抗人C肽抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒替换为包被ANA抗原的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，相应的，将校准品中的人C肽蛋白替换为抗核抗体（ANA），从而得到能检测血清中抗核抗体的试剂盒。
再次，ANA抗原是本领域公知的抗原，其来源及种类均属于本领域的公知常识。并且，在试剂盒领域，在聚苯乙烯胶乳颗粒表面偶联多种抗原/抗体，利用特异性反应，检测多种抗体/抗原的方法早已广泛使用。根据实际检测需要，选择Hep-2、Sm、Sm/RNP、SSA/Ro、SSB/La等抗原或其组合仅仅是本领域技术人员的常规选择，本领域技术人员无需付出创造性的劳动。
最后，简化操作、提高检测准确性、重复性是本领域的普遍需求。当在对比文件2的启示下，将对比文件1的试剂盒改进成本申请所述的试剂盒时，基于本领域的普遍需求，本领域技术人员有动机对试剂的浓度等进行微调，使其达到检测准确性高、重复性好等效果。
综上所述，复审请求人的意见陈述不具说服力，因此，合议组不予支持。
基于上述事实和理由，合议组依法作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年07月30对本申请做出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本复审请求审查决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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