发明创造名称：酶方法
外观设计名称：
决定号：195559
决定日：2019-11-14
委内编号：1F297919
优先权日：2011-12-29
申请（专利）号：201280069777.2
申请日：2012-12-28
复审请求人：牛津纳米孔技术公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：杨莹跃
合议组组长：孙俊荣
参审员：曹克浩
国际分类号：C12Q1/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：在确定发明实际解决的技术问题时，应当结合区别技术特征，说明书中所证实的技术效果以及现有技术的整体状况综合考虑。而在判断技术启示时，应当以前述所确定的技术问题为出发点，考察现有技术所公开的技术内容是否能够解决上述技术问题，如果这些现有技术所针对的并非上述技术问题，则不应当认为现有技术已经给出了相应的技术启示。
全文：
本复审请求涉及申请号为201280069777.2，名称为“酶方法”的发明专利申请。申请人为牛津纳米孔技术公司。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年05月02日发出驳回决定，以本申请权利要求1-23、25-39不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：2016年05月20日提交的权利要求1-39，2014年08月14日提交的说明书第1-305段（即第1-95页），说明书附图1-12，说明书摘要以及说明书核苷酸和氨基酸序列表。
驳回决定所针对的独立权利要求如下：
“1. 一种表征目标多核苷酸的方法，包括:
(a)将目标多核苷酸与跨膜孔和RecD解旋酶接触，使得所述目标多核苷酸移动穿过所述孔并且使所述RecD解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动；以及
(b)随着所述多核苷酸相对所述孔移动获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸，
其中所述方法使用至少0.3M的盐浓度进行实施。”
“25. 一种形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括在孔和RecD解旋酶之间形成复合体并由此形成用于表征目标多核苷酸的传感器，其中所述方法使用至少0.3M的盐浓度进行实施。”
“29. RecD解旋酶在至少0.3M的盐浓度下在控制目标多核苷酸穿过孔的移动中的应用。”
“30. 一种用于在至少0.3M的盐浓度下表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)RecD解旋酶。”
“32. 一种用于在至少0.3M的盐浓度下表征样本中的目标多核苷酸的分析装置，包括多个孔和多个RecD解旋酶。”
“34. 一种用于表征目标多核苷酸的方法，包括：
(a)将目标多核苷酸与RecD解旋酶接触使得所述RecD解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动，以及
(b))随着所述RecD解旋酶控制所述目标多核苷酸的运动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸，
其中所述方法使用至少0.3M的盐浓度进行实施。”
“36. RecD解旋酶在至少0.3M的盐浓度下在表征目标多核苷酸的过程中控制目标多核苷酸的运动中的应用。”
“37. RecD解旋酶在至少0.3M的盐浓度下在对目标多核苷酸的部分或全部进行测序的过程中控制目标多核苷酸的运动中的应用。”
“38. 一种用于在至少0.3M的盐浓度下表征样本中的目标多核苷酸的分析装置，其特征在于所述分析装置包括RecD解旋酶。”
“39. 一种用于在至少0.3M的盐浓度下表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)用于表征目标多核苷酸的分析装置和(b)RecD解旋酶。”
驳回决定认为，权利要求1与对比文件1（WO2006/028508 A2，公开日为2006年03月16日）的区别技术特征在于：1）权利要求1限定了解旋酶的具体种类；2）权利要求1限定了所述方法使用至少0.3M的盐浓度进行实施。基于上述区别特征，权利要求1相对于对比文件1实际解决的技术问题是提供一种更稳定的解旋酶。对比文件1还公开了一些解旋酶的具体种类，例如e-coli噬菌体T7 gp4和T4 gp41基因蛋白等。此外，对比文件2（WO2010004265A1，公开日期为2010年01月14日）公开了一种包含跨膜蛋白孔亚单位和控制核苷酸的酶结构，给出了可以使用在高盐浓度下保持活性或增加活性的酶，酶优选解旋酶。因此，本领域技术人员在对比文件1公开的基础上，有动机在检测方法中增加盐浓度，并选择盐的具体浓度和种类。至于RecD解旋酶，本领域技术人员根据普通的技术知识可对所有现有技术中已知的解旋酶进行常规的选择，并通过有限的实验对所选解旋酶的效果进行验证即可确定，期间无需付出创造性劳动，且其效果也是能够合理预期的。因此，权利要求1请求保护的技术方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款的规定。基于类似的理由，其他独立权利要求也不具备创造性。其他的从属权利要求的附加技术特征已被对比文件1或2公开，或者是本领域的普通技术知识，在其所引用的权利要求不具备创造性的基础上，上述权利要求也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年08月17日向国家知识产权局提出了复审请求，但未修改权利要求书。
复审请求人认为：为了使本发明的方法能够在至少0.3M的盐浓度下进行，分子马达必须能够在高盐浓度下发挥功能。而多篇现有技术文献（参见Morris et al.（2001），Dou et al.（2004），Lohman和Bjornson（1996），Byrd和Raney（2015），Jezewska和Wlodzimierz（2000），Graham et al.（2010），Lee et al.（2012）和Dostalet al.（2011））披露，在升高的盐浓度下解旋酶并不发挥作用，据此本领域技术人员将认为解旋酶在高盐浓度下不具有残留活性，因此将不会选择使用任何类型的解旋酶。本申请发现了RecD解旋酶可以在高盐浓度下发挥功能，而这种性质并不是根据现有技术显而易见的。
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年09月08日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为请求人的意见陈述没有说服力，因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2018年11月12日向复审请求人发出复审通知书，指出：（1）权利要求1请求保护的技术方案与对比文件2相比的区别特征在于：限定了该方法使用的盐浓度为至少0.3M且具体选择了RecD解旋酶。本申请说明书中记载的结果仅证明了解旋酶RecD Nth和Dth在高达400mM盐浓度时仍能够基本保持其活性，能以预期的方式控制DNA链。但是盐浓度的进一步提高（例如高于400mM）会显著地抑制RecD解旋酶的活性，而本申请并未提供实验数据证明在400mM以上的盐浓度时，使用RecD解旋酶时是否仍能在维持其活性基本不受影响的基础上实现预期的技术效果，因此，权利要求1实际解决的技术问题仅在于如何通过提高盐浓度而提高所述方法的信噪比。对此，对比文件2已经明确给出了提高盐浓度可提高检测方法的信噪比的技术启示，而RecD解旋酶是本领域中公知和常规的解旋酶，本申请权利要求1请求保护范围内的技术方案并未均产生了预料不到的技术效果，因此，权利要求1不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。基于类似的理由，其他独立权利要求也不具备创造性。其他的从属权利要求的附加技术特征已被对比文件1或2公开，或者是本领域的普通技术知识，在其所引用的权利要求不具备创造性的基础上，上述权利要求也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（2）对于复审请求人的意见，合议组认为，基于说明书中记载的结果，本领域技术人员无法确认在盐离子浓度超过400mM时，本申请的技术方案是否仍能够在基本维持解旋酶活性的情况下提高检测的信噪比。复审请求人提供的现有技术文献仅能表明在高盐浓度下，多种解旋酶的活性会受到抑制，但这并不能说明所有的解旋酶在较高的盐浓度下均完全丧失了酶活从而完全无法行使功能，即在一定的高盐浓度下，即便解旋酶不能完全维持其在最适条件下的酶活，也不至于会完全丧失其活性，而可能仍保留有部分的活性，因此本申请所证实的在盐离子浓度为1.0M时酶仍具有残留活性的效果并非预料不到的技术效果。
复审请求人2019年06月14日提交了意见陈述书和修改的权利要求书（共7页39项），所作修改为将权利要求1、25、29、30、32、34、36-39中的“至少0.3M”修改为“0.3M-1.0M”，将权利要求24中的“至少1.0M”修改为“0.3M-0.4M”。同时，复审请求人还提交了一份证明文件（Dr James Graham的声明，英文复印件共6页）。
复审请求人于2019年11月11日再次提交了意见陈述书和新修改的权利要求书全文替换页（共7页38项），其中所作修改为将原权利要求1、25、29、30、32、34、36-39中的盐离子浓度进一步限定为“0.3-0.4M”，删除了权利要求24并相应调整了权利要求编号。
复审请求人认为：在修改后的权利要求书中，将酶具体限定为RecD解旋酶，将盐浓度具体限定为0.3M-0.4M。对于修改后的技术方案，本申请实施例证明了RecD解旋酶在0.4M时酶活基本与0.1M时相似，由此可知，RecD解旋酶在0.3M-0.4M的盐浓度下，既能维持酶活基本不变，又能产生高盐浓度下的较高信噪比。对比文件2虽然提及了150mM至500mM的盐浓度范围，但并没有给出哪种具体的酶能够在具体的0.3M-0.4M高盐浓度范围下酶活基本不变的技术启示，而根据现有技术文献的记载，解旋酶通常会在高盐浓度下酶活降低。因此本申请具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人于2019年11月11日提交了新修改的权利要求书全文替换页（共7页38项），经审查，上述修改符合专利法第33条和实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审决定针对的文本是：2014年08月14日国际申请进入中国国家阶段时提交的中文译文的说明书第1-305段、说明书附图1-12、说明书摘要、说明书序列表第1-280页，以及2019年11月11日提交的权利要求第1-38项。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
在确定发明实际解决的技术问题时，应当结合区别技术特征，说明书中所证实的技术效果以及现有技术的整体状况综合考虑。而在判断技术启示时，应当以前述所确定的技术问题为出发点，考察现有技术所公开的技术内容是否能够解决上述技术问题，如果这些现有技术所针对的并非上述技术问题，则不应当认为现有技术已经给出了相应的技术启示。
修改后的权利要求1请求保护一种表征目标多核苷酸的方法，包括: (a)将目标多核苷酸与跨膜孔和RecD解旋酶接触，使得所述目标多核苷酸移动穿过所述孔并且使所述RecD解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动；以及(b)随着所述多核苷酸相对所述孔移动获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征并由此表征所述目标多核苷酸，其中所述方法在0.3-0.4M的盐浓度下实施。
对比文件1公开了一种涉及分析检测目标多核苷酸的方法，具体包括将目标多核苷酸引入到具有纳米孔装置的纳米孔分析系统中，以使目标多核苷酸相对于纳米孔的装置移动，产生一个75-2000Hz的信号，然后检测该与目标多核苷酸相对于纳米孔装置移动相关的信号，以检测多核苷酸的单体依赖性特征。所述的单体依赖性特征包括核酸的确证，或者多聚核苷酸中核酸的数目。所述的纳米孔分析系统进一步包括驱动多肽相对于纳米孔装置移动的分子马达，在某些实施例中，所述分子马达是DNA聚合酶、核酸外切酶、解旋酶（参见对比文件1说明书第3页第18-26行，第4页第5-11行）。对比文件2公开了一种酶-孔构建体及其用于测序核酸序列的方法，具体公开了一种测序靶核酸序列的方法，包括（a）使所述靶序列与本发明的孔接触从而使所述酶将所述靶序列推过或拉过所述孔，所述靶序列中核苷酸的一部分与孔相互作用；和（b）测量在每个相互作用过程中通过所述孔的电流并且从确定所述靶序列的序列。其中，所述的孔包含本发明的构建体，而该构建体包含跨膜蛋白孔亚基和核酸操作酶（参见说明书第2页第15-28行，第4页第10-15行）。同时，对比文件2进一步公开了核酸操作酶的可选择范围和实施相关方法的条件：所述酶必需在于辨别核苷酸相适应的缓冲条件下操作所述核酸。所述酶优选地在远高于正常生理水平例如100mM-500mM的盐浓度下至少具有剩余活性（参见说明书第24页第20-27行）。优选的能够将所述靶核酸序列推过或拉过所述孔的酶包括……解螺旋酶……，所述解螺旋酶优选酶分类（EC）组3.6.1.-和2.7.7.-的任一组的成员（参见说明书第22页第25-30行，第28页最后一段，第43页14-21行）。所述方法可在存在任一碱土金属盐酸盐的条件下进行。所述盐的浓度一般是0.1-2.5M……。高的盐浓度可提供高的信噪比……。然而，优选使用更低的盐浓度从而使所述酶能够工作。所述盐的浓度优选是150-500mM……（参见说明书第41页16-26行）。驳回决定针对修改前的权利要求书认为，在对比文件1公开的方法的基础上，结合对比文件2给出的采用高盐浓度的技术启示能够显而易见地得出本申请所要求保护的技术方案。
对于修改后的权利要求1，合议组认为：本申请说明书中记载，“本发明人出乎意料的发现RecD解旋酶具有出乎意料的高的盐耐受性，因此本发明方法能够在高的盐浓度下实施。……。因为测量信号依赖于盐浓度，因此有利的是使用高的盐浓度以提高获得信号的强度。高的盐浓度提供了高信噪比，并使得在正常电流波动的背景下，代表核苷酸存在的电流能被识别。对于链测序，超过100mM的盐浓度是理想的，例如超过400mM，600mM或800mM的盐浓度。本发明人出乎意料的发现RecD解旋酶能在非常高的盐浓度例如1M下有效发挥作用”、“因为测量信号依赖于离子的浓度，因此使用高浓度的离子盐以提高获得的信号的强度是有利的。对于纳米孔测序，超过100mM KCl的盐浓度是理想的，并且400mM KCl或更大的盐浓度是优选的”（参见说明书第0057、0276段）。同时，说明书中进一步记载“然而，很多酶（包括一些解旋酶和DNA马达蛋白）不能耐受高的盐条件”、“当解旋酶在解链模式下操作时，其作用类似闸（brake），防止目标序列在施加的电压的影响下太快穿过所述孔。这是非常重要的……”、“没有解旋酶连接的DNA短暂地与所述纳米孔相互作用产生短期的电流模块（<1秒）。有解旋酶连接并活动（即在atp酶作用下沿着dna链移动）的dna产生电流逐步变化的长特征模块水平”（参见说明书第0061、0272、0277段）。根据上述记载可知，对于本申请所涉及的技术方案，虽然在高浓度的盐离子条件下能够提高信号强度 噪比，但同时也会抑制解旋酶的活性，而解旋酶的活性将会影响dna穿过纳米孔的速度，因此，一般情况下可能需要在信噪比或信号强度与尽量控制dna穿过纳米孔的速度之间进行取舍。然而，本申请则“出乎意料的”发现了recd能够耐受一定程度的高盐活性。对此，说明书实施例2中使用荧光分析检测酶活性来阐述recd解旋酶的盐耐受性，其结果显示，相对于100mm盐离子浓度，两种recd解旋酶（recd="" nth和dth）在400mm盐离子浓度下的酶活基本上维持不变（参见图4b）；实施例1中使用不同的trai解旋酶（属于recd解旋酶）在400mm="">
对比文件2中虽然指出了较高的盐浓度可提供高的信噪比，并提供了优选的盐离子浓度范围为150mM-500mM，也列举了酶可以选自解旋酶，但其同时指出 “然而，优选使用更低的盐浓度从而使得所述酶能够工作”、“所述酶优选在远高于正常生理水平，例如100mM至500mM的盐浓度下至少具有剩余活性”，“所述酶优选进行修饰以提高其在高盐浓度下的活性”（参见说明书第24页第23-26行、第41页20-25行），上述记载表明对比文件2中暗示了其需要在信噪比或信号强度与解旋酶的酶活之间进行取舍，为了提高信噪比或信号强度而提高盐浓度至100mM-500mM时，只能通过牺牲酶的部分活性（“具有剩余活性”），或者通过对酶进行一些修饰来提高其高盐耐受性，可见，对比文件2没有意识到在高盐浓度下所选择的酶还能够基本维持其基本酶活不变，遑论给出选择RecD酶能够在上述高盐浓度下可维持其基本酶活的教导，且也没有证据证明本领域公知常识中存在相应的教导。
从另一角度来看，一般而言，酶的活性会受多种因素的影响，例如pH值、温度、盐离子浓度等，只有在其最适条件下，酶才有可能发挥其最大的活性。对于盐离子浓度而言，不同种类的酶通常都会有一个相对最适的浓度范围，超出这个范围均可能影响酶的活性。具体到本申请中所涉及的解旋酶，复审请求人提供的多篇现有技术文献显示，在采用解旋酶进行酶促反应时，其所使用的盐浓度范围一般都在50mM-150mM之间，其中，Shou-Xing Dou（2004）在其报道中以RecQ解旋酶为例进一步研究了NaCl浓度对RecQ-DNA复合物形成及其稳定性的影响，结果表明盐离子浓度的提高会显著抑制RecQ-DNA复合物的形成及其稳定性，抑制酶活。然而，本申请证实了在远超其一般所使用的盐离子浓度条件下（400mM），RecD解旋酶的酶活还能基本上保持不变，可以认为该效果已经超出了本领域技术人员所能合理预期的范围，即可以认为本申请的技术方案在一定程度上产生了预料不到的技术效果。
综上所述，在对比文件1和对比文件2公开技术内容的基础上，本领域技术人员并不能显而易见得出本申请权利要求1所要求保护的技术方案，权利要求1符合专利法第22条第3款的规定。
基于类似的理由，权利要求2-38也具备创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
基于以上事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2017年05月02日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审决定所确定的文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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