发明创造名称：改进复合基质中微生物的分析的方法
外观设计名称：
决定号：193601
决定日：2019-10-29
委内编号：1F244876
优先权日：2013-03-13
申请（专利）号：201380076383.4
申请日：2013-04-04
复审请求人：贝克顿·迪金森公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：曹克浩
合议组组长：韩世炜
参审员：吴文英
国际分类号：C12Q1/00，C12Q1/68，G01N33/48
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：当涉及检测样品中活微生物的本发明相对于最接近现有技术的主要区别特征在于使用特定树脂除去杂质颗粒和背景信号降低分子减少非活微生物的干扰时，如果相近技术领域的现有技术公开该树脂除去杂质颗粒，同时本发明仅用功能特征限定该分子，那么本领域技术人员根据除去杂质颗粒的普遍检测需求，易于想到使用上述区别特征引入最接近现有技术，并根据保留活微生物活性的需要进行合理调整分离步骤，从而得到本发明的方法，致使本发明相对于现有技术的结合不具备显而易见性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380076383.4、名称为“改进复合基质中微生物的分析的方法”的发明专利申请。
经实质审查，针对申请人于2015年11月06日提交的说明书第1-76段、说明书附图、说明书摘要、摘要附图；2017年8月9日提交的权利要求第1-16项，国家知识产权局原审查部门于2017年11月16日以权利要求1-12不符合专利法第22条第3款规定为由驳回了本申请。
驳回决定认为：（1）权利要求1请求保护一种分析分离的生物或环境样品中至少一种目标微生物存在与否的方法，对比文件1（“A Flow Cytometry Method for Rapid Detection and Enumeration of Total Bacteria in Milk”，THUSITHA S. GUNASEKERA 等，《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》，第66卷第3期，第1228-1232页，2000年03月31日）公开了一种使用流式细胞仪快速检测和计算牛奶（食物产品的下位概念）中总细菌（目标微生物、目标颗粒的下位概念）的方法（参见对比文件1第1228页右栏第2段-第1229页右栏第2段），二者的区别技术特征在于：权利要求1使用树脂来移除树脂中的非目标颗粒，而对比文件1采用酶水解的方式来排除影响流式细胞仪荧光响应的物质。针对上述区别特征，本领域公知，水解法属于化学方法，可能会对于目标微生物造成一定的损失而造成对于检测结果的影响。因此本领域技术人员出于丰富现有技术的目的，有动机使用现有技术中其它除去蛋白和脂类的方法来替换对比文件1中的酶解和离心方法。同时，对比文件2（CN 101713713A，公开日为2010年5月26日，参见对比文件2权利要求14-16）给出了利用树脂吸附法来除去牛奶中的脂类和蛋白质的启示。因此，本领域技术人员也容易想到结合对比文件2中所披露的树脂吸附法来预处理流式细胞仪进样前的样品。因此，权利要求1相对于对比文件1结合对比文件2不具备专利法第22条第3款规定的创造性。基于相同或相似的理由，从属权利要求2-5、权利要求6-7、权利要求8-12也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（2）在其他说明部分中，驳回决定认为，虽然权利要求13-16进一步限定了树脂与样品混合的时间以及树脂样品分离转速，但是上述技术参数都是本领域技术人员根据常规的参数和干扰物质与树脂结合特点就能够选择出的，因而在所引用的权利要求不具备创造性时，权利要求13-16也不具备创造性。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 分析分离的生物或环境样品中至少一种目标微生物存在与否的方法，其包括：
获得用于测试所述至少一种目标微生物存在与否的样品，其中所述样品源自食物产品、化妆品、土壤样品或水，并且其中所述样品包括具有目标颗粒和非目标颗粒的复合基质；
制备用于测试所述至少一种目标微生物存在与否的样品；
将所述样品与选择以结合至所述样品中的非目标颗粒的树脂组合，其中所述树脂选自疏水树脂、多芳香树脂、多孔树脂和非官能聚合物树脂吸附剂；
从所述样品移除所述树脂，所述树脂随其携带所述非目标颗粒；
从所述样品移除所述树脂后，将所述样品与核酸染色剂组合，其中所述核酸染色剂穿透并标记所述目标微生物；和
使用流式细胞仪分析所制备的样品。
2. 权利要求1所述的方法，其中所述食物产品选自肉、牛奶、蛋、黄油和水。
3. 权利要求1所述的方法，其中所述样品和树脂在室温下孵育。
4. 权利要求1所述的方法，其中所述核酸染色剂标记是荧光标记。
5. 权利要求1所述的方法，其进一步包括向所述生物样品添加荧光淬灭剂。
6. 确定样品中活微生物存在与否或量的分离的生物或环境样品的测定，其包括：
获得用于测定目标活微生物存在与否的样品，其中所述样品源自食物产品、化妆品、土壤样品或水，并且其中所述样品包括具有目标颗粒和非目标颗粒的复合基质；
通过向所述生物样品添加树脂制备用于测定目标活微生物存在与 否的样品，选择所述树脂以结合所述样品中的非目标颗粒，其中所述树脂选自疏水树脂、多芳香树脂、多孔树脂和非官能聚合物树脂吸附剂；
从所述样品移除所述树脂，所述树脂随其携带非目标颗粒；
向所述样品添加背景信号降低物质，所述背景信号降低物质包括将结合至所述样品中的非目标颗粒的分子；
向所述样品添加渗透并标记活细胞的核酸染色剂；和
使用流式细胞仪分析所制备的生物样品；
其中所述背景信号降低分子不显著地渗透所述目标活微生物并以与所述核酸染色剂类似的方式和类似的效率结合至所述非目标颗粒，并且
其中顺序地或同时地添加所述核酸染色剂与所述背景信号降低分子。
7. 权利要求6所述的测定，其中所述核酸染色剂标记是荧光标记。
8. 确定样品中活微生物存在与否或量的分离的生物或环境样品的测定，其包括：
获得用于测定目标活微生物存在与否的样品，其中所述样品源自食物产品、化妆品、土壤样品或水，并且其中所述样品包括具有目标颗粒和非目标颗粒的复合基质；
通过向所述生物样品添加树脂制备用于测定目标活微生物存在与否的样品，选择所述树脂以结合所述样品中的非目标颗粒，其中所述树脂选自疏水树脂、多芳香树脂、多孔树脂和非官能聚合物树脂吸附剂；
从所述样品移除所述树脂，所述树脂随其携带非目标颗粒；
向所述样品添加渗透并标记活细胞的核酸染色剂；和
使用流式细胞仪分析所制备的生物样品；
其中所述核酸染色剂包括共价地连接至荧光淬灭剂的结合域，所述荧光淬灭剂通过光谱重叠猝灭所述核酸染料的荧光信号，所述背景信号降低分子以与所述核酸染色剂类似的方式和类似的效率结合至所 述非目标颗粒，并且所述背景信号降低分子不渗透目标活微生物，并且
其中顺序地或同时地添加所述核酸染色剂与所述背景信号降低分子。
9. 权利要求8所述的测定，其中所述核酸染色剂标记是荧光标记。
10. 权利要求1所述的方法，其中所述食物产品是肉。
11. 权利要求6所述的测定，其中所述食物产品是肉。
12. 权利要求8所述的测定，其中所述食物产品是肉。
13. 权利要求1所述的方法，其中在从所述样品移除所述树脂之前，所述树脂与所述样品组合1小时或更少。
14. 权利要求13所述的方法，其中当所组合的树脂和样品以25rpm旋转时，所述样品与所述树脂组合少于三十分钟。
15. 权利要求6或8所述的测定，其中在所述树脂被添加到所述样品之后，在从所述样品移除所述树脂之前，所述树脂与样品组合1小时或更少。
16. 权利要求15所述的测定，其中当所组合的树脂和样品以25rpm旋转时，所述样品与所述树脂组合少于三十分钟。”
申请人贝克顿?迪金森公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年02月12日向国家知识产权局提出了复审请求，但未提交修改的申请文本。
复审请求人认为：
对比文件1既没有公开通过树脂去除非目标颗粒，也没有公开使用背景信号降低物质与树脂组合以除去非目标颗粒。对比文件2的目的是检测食品中的有害物质（农药、杀虫剂等有害化合物），同时其教导通过高速离心去除非目标颗粒。相反，本发明的目的是检测微生物，并且不通过离心来分离样品和树脂，这样可以防止伤害待检微生物。由此可见，本申请方法相对于对比文件1和2具有创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年03月13日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为请求人的意见不具备说服力，故坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理，并于2019年03月19日发出复审通知书，指出：
（1）权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：权利要求1使用组合树脂通过吸附除去干扰FCM检测微生物的非目标颗粒，而对比文件1采用酶水解离心的方式来排除干扰FCM检测微生物的非目标颗粒（如蛋白质、脂肪）。基于所述区别技术特征可确定权利要求1实际解决的技术问题是提供另外一种去除干扰物质的预处理方法，从而进行FCM检测分离的生物或环境样品的微生物。
然而，对比文件2公开了为了检测奶制品的有害物质（如农药、杀虫剂等有害化合物）而对奶制品进行预处理的方法（参见对比文件2的权利要求14-16），包括在预处理样品中加入组合树脂（如苯乙烯-二乙烯苯共聚物树脂、苯乙烯-二乙烯苯共聚物季铵盐树脂和含有苯肼官能团的苯乙烯-二乙烯苯共聚物载体）以除去干扰检测的杂质（如蛋白质、糖类、纤维以及脂肪和其它亲脂性物质），即教导了如何通过组合树脂来除去与本发明类似的干扰杂质。鉴于除去干扰杂质属于FCM法检测食品等微生物的普遍需要，因此本领域技术人员易于想到将对比文件2公开的通过组合树脂来除去与本发明类似的干扰杂质的步骤，用于替换对比文件1的酶法离心去除干扰杂质的步骤，从而得到本发明的技术方案，这是显而易见的，其技术效果也是可以预料得到的，致使权利要求1不具备创造性。基于相同或相似的理由，从属权利要求2-5以及权利要求6-7也不具备创造性。
（2）权利要求8请求保护确定样品中活微生物存在与否或量的分离的生物或环境样品的测定的方法，其与权利要求1相比，主要不同在于限定了“所述核酸染色剂用于渗透和标记活细胞”、限定了“核酸染色剂共价连接荧光淬灭剂”、限定“背景信号降低物质不渗透活细胞”等步骤。如前所述，由于对比文件1所公开的用于被死细胞吸收并产生荧光来区分死细胞和活细胞的碘化丙锭（PI），实质上相当于所述荧光淬灭剂和/或背景信号降低分子，将染色剂与荧光淬灭剂共价连接也属于本领域的常规选择。因此，基于权利要求1相对于对比文件1和2不具备创造性的相似理由，权利要求8也不具备创造性。同理，从属权利要求9-12进一步限定核酸染色剂类型以及食物类型，所述权利要求也不具备创造性。
（3）从属权利要求13-16进一步限定树脂处理样品的组合时间、转速及分离时间的技术参数，但上述参数都是本领域技术人员根据常规的参数和干扰物质与树脂结合特点就能够选择出的，因而在所引用的权利要求不具备创造性时，所述权利要求也不具备创造性。
针对复审通知书，复审请求人于2019年07月01日提交了意见陈述书，并提交修改的申请文本，其中限定权利要求1-16的样品为“生物或环境样品”、限定权利要求1的树脂是“XAD-4”，并修改了权利要求6和8的测定步骤。
修改的权利要求书如下：
“1. 分析分离的生物或环境样品中至少一种目标微生物存在与否的方法，其包括：
获得用于测试所述至少一种目标微生物存在与否的生物或环境样品，其中所述生物或环境样品源自食物产品、化妆品、土壤样品或水，并且其中所述生物或环境样品包括具有目标颗粒和非目标颗粒的复合基质；
制备用于测试所述至少一种目标微生物存在与否的生物或环境样品；
将所述生物或环境样品与选择以结合至所述生物或环境样品中的非目标颗粒的树脂组合，其中所述树脂是XAD-4；
从所述生物或环境样品移除所述树脂，所述树脂随其携带所述非目标颗粒；
从所述生物或环境样品移除所述树脂后，将所述生物或环境样品与核酸染色剂组合，其中所述核酸染色剂穿透并标记所述目标微生物；和
使用流式细胞仪分析包括所述标记的目标微生物的所染色的样品。
2. 权利要求1所述的方法，其中所述食物产品选自肉、牛奶、蛋、黄油和水。
3. 权利要求1所述的方法，其中所述生物或环境样品和树脂在室温下孵育。
4. 权利要求1所述的方法，其中所述核酸染色剂标记是荧光标记。
5. 权利要求1所述的方法，其进一步包括向所述生物或环境样品添加荧光淬灭剂。
6. 确定生物或环境样品中活微生物存在与否或量的分离的生物或环境样品的测定，其包括：
获得用于测定目标活微生物存在与否的生物或环境样品，其中所述生物或环境样品源自食物产品、化妆品、土壤样品或水，并且其中所述生物或环境样品包括具有目标颗粒和非目标颗粒的复合基质；
通过向所述生物或环境样品添加树脂制备用于测定目标活微生物存在与否的所述生物或环境样品，选择所述树脂以结合所述生物或环境样品中的非目标颗粒，其中所述树脂选自疏水树脂、多芳香树脂、多孔树脂和非官能聚合物树脂吸附剂；
从所述生物或环境样品移除所述树脂，所述树脂随其携带非目标颗粒；
向所述生物或环境样品添加过量的背景信号降低分子，所述分子不渗透所述生物或环境样品中的活微生物并结合在已经移除所述树脂之后依然与所述生物或环境样品结合的非目标颗粒，其中所述背景信号降低分子与剩余非目标颗粒的结合性质和核酸染色剂与所述非目标颗粒的结合性质类似；
向所述生物或环境样品添加渗透并标记活细胞但是被阻止标记至少一些所述非目标颗粒的所述核酸染色剂；和
使用流式细胞仪分析所制备的生物或环境样品；
其中顺序地或同时地添加所述核酸染色剂与所述背景信号降低分子。
7. 权利要求6所述的测定，其中所述核酸染色剂标记是荧光标记。
8. 确定生物或环境样品中活微生物存在与否或量的分离的所述生物或环境样品的测定，其包括：
获得用于测定目标活微生物存在与否的生物或环境样品，其中所述生物或环境样品源自食物产品、化妆品、土壤样品或水，并且其中所述生物或环境样品包括具有目标颗粒和非目标颗粒的复合基质；
通过向所述生物或环境样品添加树脂制备用于测定目标活微生物存在与否的生物或环境样品，选择所述树脂以结合所述生物或环境样品中的非目标颗粒，其中所述树脂选自疏水树脂、多芳香树脂、多孔 树脂和非官能聚合物树脂吸附剂；
从所述生物或环境样品移除所述树脂，所述树脂随其携带非目标颗粒；
向所述生物或环境样品添加背景信号降低物质，所述背景信号降低物质包括将结合至所述生物或环境样品中的非目标颗粒的分子；
向所述生物或环境样品添加渗透并标记活细胞的核酸染色剂；和
使用流式细胞仪分析所制备的生物或环境样品；
其中所述核酸染色剂包括共价地连接至荧光淬灭剂的结合域，所述荧光淬灭剂通过光谱重叠猝灭所述核酸染色剂的荧光信号，所述背景信号降低分子以与所述核酸染色剂类似的方式和类似的效率结合至所述非目标颗粒，并且所述背景信号降低分子不渗透目标活微生物，并且
其中顺序地或同时地添加所述核酸染色剂与所述背景信号降低分子。
9. 权利要求8所述的测定，其中所述核酸染色剂标记是荧光标记。
10. 权利要求1所述的方法，其中所述食物产品是肉。
11. 权利要求6所述的测定，其中所述食物产品是肉。
12. 权利要求8所述的测定，其中所述食物产品是肉。
13. 权利要求1所述的方法，其中在从所述生物或环境样品移除所述树脂之前，所述树脂与所述生物或环境样品组合1小时或更少。
14. 权利要求13所述的方法，其中当所组合的树脂和生物或环境样品以25rpm旋转时，所述生物或环境样品与所述树脂组合少于三十分钟。
15. 权利要求6或8所述的测定，其中在所述树脂被添加到所述生物或环境样品之后，在从所述样品移除所述树脂之前，所述树脂与生物或环境样品组合1小时或更少。
16. 权利要求15所述的测定，其中当所组合的树脂和生物或环境样品以25rpm旋转时，所述生物或环境样品与所述树脂组合少于三十分钟。”
复审请求人认为：
（1）本发明相对于对比文件1解决的技术问题除了“如何除去样品中的影响检测的物质”，还有“同时保留待检微生物的生存力”，即对比文件1未能提供上述两个问题的解决方案。对比文件2旨在使用一种树脂除去亲脂性物质，然后用另一种树脂除去糖类，其中为了除去上述物质还要使用多种添加剂。对此，修改的权利要求明确使用XAD-4树脂，并且试验结果表明该树脂处理的样品相比没有经过处理的样品，荧光强度显著增加（参见说明书第0067-0069段、0071和0074段）。因此，对比文件1结合对比文件2无法得出权利要求1-5及其从属权利要求10、13-14的技术方案。
（2）对比文件1的PI具有橙色/红色荧光，其区别于穿透活细菌的绿色荧光，其不同于本发明的“不渗透活细胞，且以活微生物染色相同的效率结合非目标颗粒，以防止染色剂被非目标分子吸收”的背景信号降低分子。此外，该降低分子具有与其连接的淬灭剂，其消除来自非目标颗粒的信号。这两者都不同于对比文件1。因此，使用背景信号降低分子的权利要求6和8相对于对比文件1和2具有创造性。
（3）权利要求14和16使用以低速（例如25rpm）旋转样品以分离树脂和样品，该速度并非离心，但能保留样品中微生物生存力的活力。对比文件2是检测样品中的有害物质而不是本发明的待检微生物，没有启示使用要求保护的树脂从样品中吸收复合基质并使用保留微生物活力的非离心技术，以将它们与样品分离。另外，权利要求13-16限定了分离之前树脂和样品组合的时间间隔小于1小时以及具体条件，而对比文件1-2也未公开上述条件。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
复审请求人在答复复审通知书时提交了修改的权利要求书，经审查，该修改符合专利法第33条和实施细则第61条第1款的规定，因此本复审决定所针对的文本为：复审请求人2015年11月6日提交的说明书第1-76段、说明书附图、说明书摘要、摘要附图；2019年07月01日提交的权利要求第1-16项。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
当涉及检测样品中活微生物的本发明相对于最接近现有技术的主要区别特征在于使用特定树脂除去杂质颗粒和背景信号降低分子减少非活微生物的干扰时，如果相近技术领域的现有技术公开该树脂除去杂质颗粒，同时本发明仅用功能特征限定该分子，那么本领域技术人员根据除去杂质颗粒的普遍检测需求，易于想到使用上述区别特征引入最接近现有技术，并根据保留活微生物活性的需要进行合理调整分离步骤，从而得到本发明的方法，致使本发明相对于现有技术的结合不具备显而易见性。
本案中，权利要求1要求保护一种分析分离的生物或环境样品中至少一种目标微生物存在与否的方法，其主要步骤包括：获得并制备包含目标颗粒（即目标微生物）、非目标颗粒的生物或环境样品，将样品通过XAD-4树脂以吸附并除去非目标颗粒，将含有目标颗粒的纯化样品进行核酸染色，最后通过流式细胞仪进行分析样品。根据本申请说明书第0015-0018段的记载，本发明是基于现有的鉴定食物和水中微生物的流式细胞术（FCM）难以克服非目标颗粒的缺点，而对现有技术（FCM法）进行的改进。由于所述组合树脂的功能属于本领域普遍知晓的知识，结合本申请的复合基质类型（如食物产品、化妆品、土壤样品），本领域技术人员可以推导这些组合树脂所吸附并除去的非目标颗粒包括蛋白质、脂肪、多糖以及不溶性颗粒等。
对比文件1公开了一种使用FCM检测牛奶（即食物产品的下位概念）中总细菌（目标微生物、目标颗粒的下位概念）的方法（参见对比文件1摘要，第1228页右栏第2段-第1229页右栏第2段）：使用50μlsavinase酶处理100μl生牛乳样品，离心除去脂质和消化后的蛋白（非目标颗粒的下位概念），将细菌层重悬（即制备用于测试所述至少一种目标微生物存在与否的样品），与SYTO BC染料（核酸染色剂的下位概念）以及PI混合，温孵。染色后的样品进样至流式细胞仪检测细菌含量（分析步骤）。权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：权利要求1使用XAD-4树脂通过吸附除去干扰FCM检测微生物的非目标颗粒，而对比文件1采用酶水解离心的方式来排除干扰FCM检测微生物的非目标颗粒（如蛋白质、脂肪）。基于所述区别技术特征可确定权利要求1实际解决的技术问题是提供另外一种去除干扰物质的预处理方法，从而进行FCM检测分离的生物或环境样品的微生物。
然而，对比文件2公开了为了检测奶制品的有害物质（如农药、杀虫剂等有害化合物）而对奶制品进行预处理的方法（参见对比文件2的权利要求14-16，说明书第0024-0030段），包括在预处理样品中加入组合树脂（如苯乙烯-二乙烯苯共聚物树脂，即本发明的XAD-4树脂，与离子交换树脂等进行组合）以除去干扰检测的杂质（如蛋白质、糖类、纤维以及脂肪和其它亲脂性物质），即教导了如何通过组合树脂来除去与本发明类似的干扰杂质。鉴于除去干扰杂质属于FCM法检测食品等微生物的普遍需要，并且XAD-4树脂商业上常用于吸附亲脂性物质、有机物和分子量较小的杂质，因此本领域技术人员根据对比文件2给出的包含XAD-4树脂在内的组合树脂来除去与本发明类似的干扰杂质的启示，通过简单摸索即容易单独选择XAD-4树脂用于替换对比文件1的酶法离心去除干扰杂质的步骤，从而得到本发明的技术方案，这是显而易见的，其技术效果也是可以预料得到的，致使权利要求1相对于对比文件1结合对比文件2不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求2-4进一步限定所述食品产品的种类、样品与树脂的孵育步骤、荧光标记，然而这些附加特征或是被对比文件1-2公开（例如对比文件1公开的SYTO BC染料为荧光标记，对比文件2的权利要求14公开了样品与树脂在室温混合均匀，实施例46-47公开了样品与树脂的水浴温育），或是属于与待检牛奶具有相同检测需要的食品（如肉、蛋、黄油和水）。因此，在所引用的权利要求1不具备创造性的基础上，上述权利要求也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求5进一步限定添加荧光淬灭剂。根据本申请说明书第0051-0052段的记载，“所述淬灭剂在帮助区分目标微生物的检测信号与背景信号的染色过程期间，通过减少不期望的信号的荧光强度增强对比（如硝嗪黄）。其中，该淬灭剂不渗透活细胞，可以结合非目的颗粒（如死细胞），从而降低由结合至非目标颗粒的核酸染色剂发射的荧光的强度”。对比文件1公开了加入碘化丙锭（PI）和SYTO BC染料对子样品进行双重染色来确定细菌培养物的存活率，其中PI通常被完整的质膜排除（即PI不能渗透活细胞），因此，PI的吸收（橙色/红色荧光）表明细胞死亡（参见对比文件1第1229页）。由此可见，对比文件1公开的PI实质上发挥与荧光淬灭剂的功能。因此，在所引用的权利要求1不具备创造性的基础上，上述权利要求也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求6请求保护确定样品中活微生物存在与否或量的生物或环境样品的测定，其与权利要求1与对比文件1的区别相比，权利要求6与对比文件1的区别特征在于权利要求6限定除去干扰FCM检测微生物的非目标颗粒，而对比文件1采用酶水解离心的方式来排除干扰FCM检测微生物的非目标颗粒，权利要求6还增加了添加背景信号降低分子的步骤，以及限定了背景信号降低分子和核酸染色剂的功能。如上所述对比文件2给出了采用XAD-4树脂等去除与本发明类似的干扰杂质；对于背景信号降低分子，由于本申请说明书既未例举背景信号降低分子，也未公开所述分子能够降低背景信号强度的试验数据，因此本领域技术人员认为所述背景信号降低分子包括任何能够降低背景信号强度的分子。在这种情况下，对比文件1（参见第1229页）所公开的用于被死细胞吸收并产生荧光来区分死细胞和活细胞的碘化丙锭（PI），实质上就相当于所述背景信号降低分子。因此，权利要求6也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。同理，进一步限定核酸染色剂标记是荧光标记的从属权利要求7也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求8请求保护确定样品中活微生物存在与否或量的分离的生物或环境样品的测定的方法，其与权利要求1与对比文件1的区别相比，权利要求8与对比文件1的区别特征在于权利要求8限定除去干扰FCM检测微生物的非目标颗粒，而对比文件1采用酶水解离心的方式来排除干扰FCM检测微生物的非目标颗粒，权利要求8还限定了“所述核酸染色剂用于渗透和标记活细胞”、限定了“核酸染色剂共价连接荧光淬灭剂”、限定“背景信号降低物质不渗透活细胞”等步骤。如上所述，对比文件2给出了采用XAD-4树脂等去除与本发明类似的干扰杂质；对于核酸染色剂和背景信号降低分子，如前所述，由于对比文件1所公开的用于被死细胞吸收并产生荧光来区分死细胞和活细胞的碘化丙锭（PI），实质上相当于所述荧光淬灭剂和/或背景信号降低分子，将染色剂与荧光淬灭剂共价连接也属于本领域的常规选择。因此，权利要求8也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。同理，从属权利要求9-12进一步限定核酸染色剂类型以及食物类型，所述权利要求也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求13-16进一步限定树脂处理样品的组合时间、转速及分离时间的技术参数，但上述参数都是本领域技术人员根据常规的参数和干扰物质与树脂结合特点就能够选择出的，因而在所引用的权利要求不具备创造性时，所述权利要求也不具备创造性。
（三）关于复审请求人的意见
复审请求人认为：
（1）本发明相对于对比文件1解决的技术问题除了“如何除去样品中的影响检测的物质”，还有“同时保留待检微生物的生存力”，即对比文件1未能提供上述两个问题的解决方案。对比文件2旨在使用一种树脂除去亲脂性物质，然后用另一种树脂除去糖类，其中为了除去上述物质还要使用多种添加剂。对此，修改的权利要求明确使用XAD-4树脂，并且试验结果表明该树脂处理的样品相比没有经过处理的样品，荧光强度显著增加（参见说明书第0067-0069段、0071和0074段）。因此，对比文件1结合对比文件2无法得出权利要求1-5及其从属权利要求10、13-14的技术方案。
（2）对比文件1的PI具有橙色/红色荧光，其区别于穿透活细菌的绿色荧光，其不同于本发明的“不渗透活细胞，且以活微生物染色相同的效率结合非目标颗粒，以防止染色剂被非目标分子吸收”的背景信号降低分子。此外，该降低分子具有与其连接的淬灭剂，其消除来自非目标颗粒的信号。这两者都不同于对比文件1。因此，使用背景信号降低分子的权利要求6和8相对于对比文件1和2具有创造性。
（3）权利要求14和16使用以低速（例如25rpm）旋转样品以分离树脂和样品，该速度并非离心，但能保留样品中微生物生存力的活力。对比文件2是检测样品中的有害物质而不是本发明的待检微生物，没有启示使用要求保护的树脂从样品中吸收复合基质并使用保留微生物活力的非离心技术，以将它们与样品分离。另外，权利要求13-16限定了分离之前树脂和样品组合的时间间隔小于1小时以及具体条件，而对比文件1-2也未公开上述条件。
针对复审请求人的意见，合议组认为：
（1）虽然对比文件1与本申请的主要区别在于通过特定XAD-4树脂去除非目标颗粒，但如前所述，如何除去干扰杂质属于FCM法检测食品等微生物的普遍需要。在这种检测需要的驱动下，本领域技术人员易于从相同或相近的领域出发，去寻找更简便的去除待检食品（如牛奶）中非目标颗粒的方法。因此，在对比文件2教导利用XAD-4树脂去除相同待检食品中的相同的非目标颗粒的情况下，本领域技术人员易于想到将对比文件2公开的该特征替换对比文件1的酶法降解离心去除非目标颗粒的方法，从而得到本发明的方法，这是显而易见的。在这种情况下，本申请即使试验证明该树脂处理的样品相比没有经过处理的样品，荧光强度显著增加，这也是本领域技术人员进行上述替换后能够预期的技术效果；
（2）如前所述，由于本申请使用功能特征限定所述背景信号降低分子，其既未例举背景信号降低分子，也未公开所述分子能够降低背景信号强度的试验数据，因此对于权利要求中所包含的功能性限定的技术特征，应当理解为覆盖了所有能够实现所述功能的实施方式，即只要能实现降低背景信号分子都属于所述背景信号降低分子的范围。在这种情况下，虽然对比文件1中能穿透死细胞的PI具有橙色/红色荧光，其区别于能穿透活细菌的SYTO BC染料（即核酸染色剂）并产生绿色荧光，但该PI同样不会渗透活细菌并实现降低背景信号分子的目的，即相当于本申请所述的背景信号降低分子。至于本申请与背景信号降低分子连接的淬灭剂，由于本申请说明书第0051-0052段限定了“该淬灭剂不渗透活细胞，可以结合非目的颗粒（如死细胞），从而降低由结合至非目标颗粒的核酸染色剂发射的荧光的强度”，如上所述，对比文件1公开的PI也发挥与淬灭剂的功能，即实质上PI相当于所述荧光淬灭剂和/或背景信号降低分子，即使出于强化降低非目标分子信号的目的，而将PI与其他的淬灭剂进行共价连接，这既是易于想到的，同时属于本领域的常规选择连接，并不会给使用背景信号降低分子的权利要求6和8及其从属权利要求带来预料不到的技术效果。
（3）虽然对比文件2的检测目的不同于本发明，且使用了不利于待检微生物的高速离心步骤，但对比文件1才是本发明的最接近现有技术，本领域技术人员根据对比文件1的检测目的显然不会考虑引入不利于待检微生物的高速离心步骤。相反，能够根据本领域公知常识来选择低速离心收集微生物，从而维持微生物的活力。至于本申请限定的分离之前树脂和样品组合的时间间隔小于1小时以及具体条件，本领域技术人员可以根据促进树脂和样品组合的目的即可通过常规技术手段确定得出，并不会带来预料不到的技术效果。
综上所述，复审请求人的意见不具备说服力。
根据以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年11月16日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人自收到本决定之日起三个月内可以向北京知识产权法院起诉。
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