发明创造名称：玉米胚芽中提取超氧化物歧化酶的加工方法
外观设计名称：
决定号：192909
决定日：2019-10-22
委内编号：1F246104
优先权日：
申请（专利）号：201410527113.7
申请日：2014-10-09
复审请求人：湖南一九生物科技有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：葛永奇
合议组组长：兰琪
参审员：曹克浩
国际分类号：C12N9/02
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在请求保护的技术方案与现有技术存在区别特征的情况下，如果现有技术整体上给出了将区别特征应用于该最接近的现有技术以解决发明实际解决的技术问题的启示，这种启示会使本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的发明，则该发明是显而易见的。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410527113.7，名称为“玉米胚芽中提取超氧化物歧化酶的加工方法”的发明专利申请。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年11月30日发出驳回决定，驳回了本发明专利申请，其理由是：
权利要求1与对比文件1（“玉米超氧化物歧化酶（SOD）提取及纯化技术的研究”，王海灵，中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑，2008年第03期，B016-228）的区别特征在于：（1）采用无水乙醇浸泡后沥干来进行脱脂；（2）粗酶液通过陶瓷膜过滤、乙醇沉淀以及重新溶解固液分离来纯化；（3）用冷冻干燥代替真空干燥；（4）用缓冻步骤替代超声破碎。对于上述区别特征（1），对比文件1公开了应当在提取SOD前对原料玉米胚芽进行脱脂处理，对比文件4（“超临界CO2流体萃取技术——工艺开发及其应用”，廖传华等，第161-162页，化学工业出版社）公开了磷脂的分离提纯方法，其中利用了卵磷脂剂型较大，通常不溶于超临界CO2流体，中性脂质在超临界CO2流体中的溶解度较大，而卵磷脂和中性脂质都可溶于乙醇的性质，分别使用了超临界CO2流体萃取和乙醇溶剂萃取去除蛋黄粉中较多的甘油三酯、胆固醇等中性脂质，在对比文件1的基础上，本领域技术人员根据对比文件4公开的内容容易想到利用无水乙醇可溶解脂质的性质采取无水乙醇浸泡后沥干的方式来对玉米胚芽粉进行脱脂，而无水乙醇浸泡的时间等具体操作都是所属技术领域的常规技术选择，没有产生预料不到的技术效果。对于上述区别特征（2）和（3），对比文件2（CN103191070A，公开日为2013年07月10日）公开了超氧化物歧化酶干粉的制备方法，包括：第一步：将玉米进行预处理得到玉米浆液；第二步：在玉米浆液中加入水溶性铜盐，保持pH值7-9，之后经固液分离，得到超氧化物歧化酶原液；第三步：将第二步所得的超氧化物歧化酶原液再经两级以上的膜过滤，依次去除分子量>12万和分子量<1万的杂质，得到超氧化物歧化酶浓缩液；第四步：向超氧化物歧化酶浓缩液中加入可与水互溶的有机物液体（优选丙酮、无水乙醇或甲醇）经分离得到沉淀物，冷冻干燥上述沉淀物；为进一步提高超氧化物歧化酶的纯度，可将上述第四步所得的干粉再次溶于水后，再加入可与水互溶的有机物液体（优选丙酮、无水乙醇或甲醇）经分离得到沉淀物，冷冻干燥上述沉淀物（参见对比文件2说明书第9-15段）；对比文件2还进一步公开了采用陶瓷膜去除分子量>12万的杂质，超滤膜去除分子量<>
驳回决定所依据的文本为申请日2014年10月09日提交的说明书摘要、说明书第1-60段、摘要附图、说明书附图以及2017年07月07日提交的权利要求第1项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 玉米胚芽中提取超氧化物歧化酶的加工方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤（1）：选取玉米胚芽并粉碎生成玉米胚芽粉，将所述玉米胚芽粉置入无水乙醇中浸泡后沥干；将所述玉米胚芽粉在有机试剂中浸泡，去除胚芽粉中的大量油脂类物质后，在粉碎的玉米胚芽中加入无水乙醇，浸泡30min左右并不断搅匀，然后沥干；
步骤（2）：将沥干后的玉米胚芽粉经固液分离处理后分离固体废渣，采集胚芽原液；将沥干后的玉米胚芽粉需先进行浸泡后再进行固液分离处理；
步骤（3）：将所述胚芽原液缓冻后澄清，采集液态超氧化物歧化酶粗酶；所述胚芽原浆缓冻过程时间控制在12小时，通过低温将更多多糖类物质析出，有效去除杂质；
步骤（4）：将所述液态超氧化物歧化酶粗酶通过陶瓷膜过滤分级过滤后生成超氧化物歧化酶浓缩液；在陶瓷膜过滤分级过滤处理中，首先将液态超氧化物歧化酶粗酶经过陶瓷膜过滤，去除分子量在25万以上的可见悬浮物和大分子杂质，得到清液；将所述清液再经过两次过滤膜，依次去除分子量＞10万和分子量＜1万的杂质，得到超氧化物歧化酶浓缩液；
步骤（5）：在所述超氧化物歧化酶浓缩液中分次按体积比加入无水乙醇，通过多次分离后获得沉淀物，该沉淀物即为超氧化物歧化酶粗产品；采用无水乙醇进行分级沉淀，去除杂质蛋白，向超氧化物歧化酶浓缩液中加入体积比为30%的无水乙醇，分离去除沉淀物，在所得溶液中继续加入体积比为3:1的无水乙醇，之后实现沉淀物分离；
步骤（6）：将所述超氧化物歧化酶粗产品溶于水后固液分离，去除不溶于水的杂质，生成液态超氧化物歧化酶，将所述液态超氧化物歧化酶冷冻干燥后获得超氧化物歧化酶干粉”。
申请人湖南一九生物科技有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年02月01日向国家知识产权局提出了复审请求，没有对申请文件进行修改。复审请求人认为：本申请方法不添加任何酸、碱、无机盐以及对身体有害的试剂，去油脂以及除杂、沉淀用的无水乙醇可以因为它的易挥发性在干燥过程中除去，无水乙醇还可以进行有效回收，在降低生产成本的同时也保证了超氧化物歧化酶干粉的品质。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年03月29日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门的前置审查意见书认为：磷酸盐缓冲液并非本申请与对比文件1的区别特征，也没有证据表明使用磷酸缓冲液会产生有害结果；对比文件1中所用原料是与本申请相同的玉米胚芽粉，没有进行沉淀的需求，相应地本领域技术人员也就没有动机将对比文件2中加入水溶性铜盐的步骤加入对比文件1，所谓的“有害”效果不存在；对比文件4和对比文件2分别给出了使用无水乙醇脱脂和沉淀杂蛋白的技术启示。因此，本领域技术人员在对比文件1-4的基础上得到本申请的技术方案是显而易见的。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理，并于2019年04月11日向复审请求人发出复审通知书，认为权利要求1相对于对比文件1-4和本领域公知常识的结合不具备创造性。
复审请求人于2019年05月17日提交了意见陈述书，同时对权利要求书作了修改，修改后的权利要求书如下：
“1. 玉米胚芽中提取超氧化物歧化酶的加工方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤(1)：选取玉米胚芽并粉碎生成玉米胚芽粉，将所述玉米胚芽粉置入无水乙醇中浸泡后沥干；将所述玉米胚芽粉在有机试剂中浸泡，去除胚芽粉中的大量油脂类物质后，在粉碎的玉米胚芽中加入无水乙醇，浸泡30min左右并不断搅匀，然后沥干；
步骤(2)：将沥干后的玉米胚芽粉经固液分离处理后分离固体废渣，采集胚芽原液；80将沥干后的玉米胚芽粉需先进行浸泡后再进行固液分离处理；
步骤(3)：将所述胚芽原液缓冻后澄清，采集液态超氧化物歧化酶粗酶；所述胚芽原浆缓冻过程时间控制在12小时，通过低温将更多多糖类物质析出，有效去除杂质；
步骤(4)：将所述液态超氧化物歧化酶粗酶通过陶瓷膜过滤分级过滤后生成超氧化物歧化酶浓缩液；在陶瓷膜过滤分级过滤处理中，首先将液态超氧化物歧化酶粗酶经过陶瓷膜过滤，去除分子量在25万以上的可见悬浮物和大分子杂质，得到清液；将所述清液再经过两次过滤膜，依次去除分子量＞10万和分子量＜1万的杂质，得到超氧化物歧化酶浓缩液；
步骤(5)：在所述超氧化物歧化酶浓缩液中分次按体积比加入无水乙醇，通过多次分离后获得沉淀物，该沉淀物即为超氧化物歧化酶粗产品；采用无水乙醇进行分级沉淀，去除杂质蛋白，向超氧化物歧化酶浓缩液中加入体积比为30％的无水乙醇，分离去除沉淀物，在所得溶液中继续加入体积比为3∶1的无水乙醇，之后实现沉淀物分离；
步骤(6)：将所述超氧化物歧化酶粗产品溶于水后固液分离，去除不溶于水的杂质，生成液态超氧化物歧化酶，将所述液态超氧化物歧化酶冷冻干燥后获得超氧化物歧化酶干粉；具体方法如下所述：
取玉米胚芽粉碎，加无水乙醇浸泡，并不断搅匀，浸泡30min后取出沥干，在处理过的玉米胚芽粉中加水，通过平板式离心机得到含有超氧化物歧化酶的胚芽原液，将上述胚芽原液在冰箱中缓冻12h后用管式离心机再一次固液分离，得到较澄清的超氧化物歧化酶粗酶液，将上步得到的超氧化物歧化酶粗酶液经一次陶瓷膜过滤和两次超滤膜过滤，陶瓷膜过滤去除分子量在25万以上的可见悬浮物和大分子杂质，使溶液更澄清，清液再经过两次超滤膜，依次去除分子量＞10万和分子量＜1万的杂质，得到8L超氧化物歧化酶浓缩液，向超氧化物歧化酶浓缩液中加入无水乙醇，离心去除沉淀物；在超氧化物歧化酶溶液中再加入无水乙醇，经分离得到沉淀物，即为超氧化物歧化酶粗产品，将上述所得的超氧化物歧化酶粗产品再次溶于水，固液分离后去除不溶于水的杂蛋白，得到超氧化物歧化酶酶液，酶液经冷冻干燥得超氧化物歧化酶干粉。”
复审请求人认为：本申请采用玉米胚芽作为原料，对比文件1和2则使用玉米或玉米浆液作为原料，本申请方法中的缓冻、冷冻干燥等操作是针对玉米胚芽作为原料时的必然选择。本申请采用玉米胚芽作为原料使得SOD的提取效率提高8-10倍，这是本申请与玉米提取的最大区别。对比文件3是基于动物源原料的提取方法，不适用于本申请的植物类原料。同时，尽管本申请的方法中使用了一些已知的技术手段，但将这些已知技术手段组合在一起使用则不是常规选择。从技术效果来看，本申请的方法实现了降低成本、节约资源、降低膜损耗、去除多糖、保障品质的效果。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本
复审请求人于2019年05月17日针对复审通知书提交了经修改的权利要求书（共1项），经核实，复审请求人在权利要求1步骤（2）中所增加的“80”属于明显笔误，同时步骤（6）后新增的特征是基于实施例1-3所进行的修改，所述修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审决定所针对的审查文本为申请日2014年10月09日提交的说明书摘要、说明书第1-60段、摘要附图、说明书附图以及2019年05月17日提交的权利要求第1项。
2、关于创造性
专利法第22条第3款，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
在请求保护的技术方案与现有技术存在区别特征的情况下，如果现有技术整体上给出了将区别特征应用于该最接近的现有技术以解决发明实际解决的技术问题的启示，这种启示会使本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的发明，则该发明是显而易见的。
本案中，权利要求1请求保护玉米胚芽中提取超氧化物歧化酶的加工方法，主要步骤包括将玉米胚芽粉于无水乙醇中浸泡去脂、固液分离以采集液态粗酶、分级过滤浓缩除杂、将浓缩液进行乙醇沉淀得粗品酶、粗品酶溶于水进行固液分离以进一步除去不溶于水的杂质、冷冻干燥液态酶得酶干粉。复审请求人在答复复审通知书时，将说明书实施例1-3内容概括后加入到权利要求书中。但这些内容与原本记载于修改前的权利要求书中的内容基本相同，仅仅明确了获取胚芽原液以及对胚芽原液进行固液分离时所用的离心机。
对比文件1公开了从玉米胚芽中提取超氧化物歧化酶的方法，包括：玉米胚芽先经过筛选、除杂、清洗、自然晾干等处理，然后用组织捣碎机捣碎；通过超临界CO2流体萃取进行脱脂处理；低温下采用超细破碎技术进行破碎处理后加入预冷的磷酸盐缓冲液，搅拌，4℃溶解4h，然后在4℃冷水浴下进行超声波破碎提取，离心取上清液（固液分离步骤），即SOD粗酶液；粗酶液通过热变性、丙酮沉淀以及葡聚糖凝胶柱层析进行纯化；浓缩；真空干燥（参见对比文件1正文第2.3.1-2.3.9节）。
即本申请与对比文件1均以玉米胚芽为原料提取SOD，均基于玉米胚芽中存在的脂质、多糖及其它杂质设计相应的除杂步骤以最终得到SOD干粉。两者的区别特征包括：（1）权利要求1采用无水乙醇浸泡后沥干来进行脱脂，而对比文件1采用超临界CO2流体萃取脱脂；（2）权利要求1的细胞破壁采用缓冻方法，而且用于缓冻破壁的不是玉米胚芽，而是在玉米胚芽尚未经细胞破壁处理前直接进行固液分离而得到的胚芽原液,而对比文件1的固液分离提取粗酶液是在超声破碎进行细胞破壁的情况下实施；（3）权利要求1的粗酶液通过陶瓷膜过滤、乙醇沉淀以及重新溶解于水进行固液分离来纯化，对比文件1通过离心实现固液分离纯化；（4）权利要求1用冷冻干燥代替对比文件1的真空干燥。
根据说明书第0031-0038段的记载，本申请的目的是提供成本低、节约资源、降低膜损耗、去除多糖、保障产品品质的酶产品。然而，合议组认为：
首先，对于本申请的SOD提取方法本身，已知SOD酶为细胞内酶，对其提取必须经过破壁处理（参见对比文件1试验方法之2.3.5.1节），而权利要求1的步骤2在未经细胞破壁处理的情况下直接进行固液分离得到胚芽原液（实施例2和3将玉米胚芽粉置于水中后离心进行固液分离），之后再进行后续的提纯步骤。该事先未经破壁处理的所谓胚芽原液中所含SOD有限，因此利用本申请的方法所得SOD产量有限，本申请说明书亦未证明该方法所得SOD产量可观。
其次，针对权利要求1与对比文件1的区别特征，其中，对于区别特征（1），对比文件1进一步公开了由于玉米胚中的脂肪含量较高，同时还含有其它的杂质和色素物质等，特别是大量的脂肪存在时，它将影响SOD的提纯效果，因此应当在提取SOD前对原料玉米胚芽进行脱脂处理（参见对比文件1正文第2.3.3.3节）；对比文件4公开了磷脂的分离提纯方法，其中利用了卵磷脂剂型较大，通常不溶于超临界CO2流体，中性脂质在超临界CO2流体中的溶解度较大，而卵磷脂和中性脂质都可溶于乙醇的性质，分别使用了超临界CO2流体萃取和乙醇溶剂萃取去除蛋黄粉中较多的甘油三酯、胆固醇等中性脂质（参见对比文件4第161-162页第7.6节）。因此，在对比文件1提出了玉米胚芽提取SOD工艺中需要脱脂这一技术问题的情况下，本领域技术人员根据对比文件4公开的内容，容易想到利用无水乙醇可溶解脂质的性质采取无水乙醇浸泡后沥干的方式来对玉米胚芽粉进行脱脂，而无水乙醇浸泡的时间、使用合适的离心机得到胚芽原液等具体操作都是所属技术领域的常规技术选择。对于上述区别特征（2），缓冻与超声破碎均为破碎细胞的惯用手段，对所属技术领域的技术人员来说容易根据需要进行选择，而缓冻时间以及使用合适的离心机进行固液分离等具体操作都是所属技术领域的常规选择。对于上述区别特征（3）和（4），对比文件2公开了超氧化物歧化酶干粉的制备方法，包括：第一步：将玉米进行预处理得到玉米浆液；第二步：在玉米浆液中加入水溶性铜盐，保持pH值7-9，之后经固液分离，得到超氧化物歧化酶原液；第三步：将第二步所得的超氧化物歧化酶原液再经两级以上的膜过滤，依次去除分子量>12万和分子量<1万的杂质，得到超氧化物歧化酶浓缩液；第四步：向超氧化物歧化酶浓缩液中加入可与水互溶的有机物液体（优选丙酮、无水乙醇或甲醇）经分离得到沉淀物，冷冻干燥上述沉淀物；为进一步提高超氧化物歧化酶的纯度，可将上述第四步所得的干粉再次溶于水后，再加入可与水互溶的有机物液体（优选丙酮、无水乙醇或甲醇）经分离得到沉淀物，冷冻干燥上述沉淀物（参见对比文件2说明书第9-15段）；对比文件2进一步还公开了采用陶瓷膜去除分子量>12万的杂质，超滤膜去除分子量<>
最后，从本申请的方法所获得的技术效果来看，对比文件1和本申请均使用玉米胚芽作为制备SOD的原料，本发明“减低成本，节约资源”的技术效果与对比文件1相同；对比文件1的方法中使用超临界CO2流体萃取进行了脱脂，与本发明采用的无水乙醇浸泡的方法起到同样的技术效果，因此本发明“降低膜损耗”的技术效果与对比文件1相同；对比文件1的方法中使用超声破碎细胞，与本发明采用的缓冻法起到同样的技术效果，因此本发明“去除多糖”的技术效果与对比文件1相同；对比文件1的方法中使用的试剂与本申请基本相同，同样不添加对身体有害的试剂，因此本发明“品质保障”的技术效果与对比文件1相同。从终产品的产量上来看，本发明的SOD产品的产量也相当有限。因此，本发明的技术方案未取得任何预料不到的技术效果。
因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2-4以及所属技术领域的常规技术得出权利要求1所要求保护的技术方案，对所属技术领域的技术人员来说是显而易见的，并且也未产生预料不到的技术效果，因而权利要求1所要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对于复审请求人陈述的意见，合议组认为：（1）对比文件1同样使用玉米胚芽作为提取SOD的原料，从原料的角度来看，相对于对比文件1本申请对SOD的提取效率并不会大幅提高，同时，如前所述，本申请在提取SOD这种细胞内酶时未经破壁处理，最终所得SOD产量必然有限，本申请说明书亦未证明该方法所得SOD产量可观，因此，本申请的方法在SOD产率上并不会高于对比文件1。（2）尽管对比文件3是基于动物源原料的提取方法，但动物源原料中同样存在大分子杂质，在这个意义上，同样都是提取SOD，本领域技术人员能够想到将对比文件3中公开的膜分离方法除盐和杂蛋白的技术内容用于对比文件1中从而得到本申请方法中的相应步骤。（3）尽管将一些已知的技术手段组合在一起得到的本申请提取的方法整体上未被某一对比文件所完全公开，但基于提取SOD的原料即玉米胚芽中所含各种不同物理化学性质的杂质等，在现有技术的教导下，本领域技术人员容易想到将一些已知的技术手段组合在一起得到与本申请的方法步骤整体类似的提取方法，而且，如前所述，从技术效果来看，本申请的提取方法在降低成本、节约资源、降低膜损耗、去除多糖、保障品质等方面并未取得任何预料不到的技术效果。综上所述，复审请求人陈述的意见没有说服力。
基于上述事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年11月30日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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