发明创造名称：脐带来源间充质干细胞的培养方法及用途
外观设计名称：
决定号：192913
决定日：2019-10-21
委内编号：1F247319
优先权日：
申请（专利）号：201510095140.6
申请日：2015-03-03
复审请求人：吉林省拓华生物科技有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：葛永奇
合议组组长：曹克浩
参审员：兰琪
国际分类号：C12N5/775,A61K35/28,A61P37/08,A61P7/04,C12M1/24,C12M1/02
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果发明是所属技术领域的技术人员在现有技术的基础上仅仅通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验可以得到的，则该发明是显而易见的。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510095140.6，名称为“脐带来源间充质干细胞的培养方法及用途”的发明专利申请。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年01月11日发出驳回决定，驳回了本发明专利申请，其理由是：1、权利要求1的脐带源间充质干细胞培养方法与对比文件1（人脐带源间充质干细胞的培养及生物学性状，毕薇薇等，《中国现代医学杂志》，第19卷第10期，公开日于2009年05月31日）公开的方法相比，区别在于：前者步骤2在10ml小烧杯中进行，后者在培养皿中；前者利用巴氏吸管将细胞转移至培养瓶中进行初始组织细胞培养，后者在培养皿中进行；前者进一步限定了利用含5％的血清替代物的α-MEM培养基悬浮脐带组织或培养细胞；前者还限定了利用不锈钢搅拌棒混匀剪碎脐带组织以及用其平头侧摆成芯片点阵形状的步骤4和6，并限定了不锈钢搅拌棒的结构特点；步骤8限定了Tryple解离酶的使用，以及培养瓶的型号为T182。然而，（1）所述间充质干细胞分离或培养过程中所使用的器皿类型及其规格是根据实验需求或条件的不同容易进行的常规选择；（2）Tryple解离酶与胰酶是本领域用于细胞或组织消化的常规替换物质；（3）对比文件2（CN104212764 A，公开日于2014年12月17日）教导了可以利用市售的不含动物成分的血清替代物作为培养基中的营养物质替代动物源血清的使用，本领域技术人员也熟知α-MEM是适于间充质干细胞培养的可选基础培养基类型之一，而血清替代物在培养基中的加入浓度亦是根据实验效果的不同易于进行调整的，在此基础上，利用上述培养基悬浮组织或细胞亦是容易想到的；（4）对比文件3（人脐带间充质干细胞体外成骨及其免疫学特征，《中国组织工程研究与临床康复》，第13卷，第36期，公开日：2009年09月03日）公开了脐带组织碎块在培养器皿中的摆放方式，而摆放的工具如带有平头的不锈钢棒的长度、直径、两侧的结构特点亦是本领域技术人员结合实验需求的不同容易做出的常规调整或选择，而利用不锈钢棒将剪碎组织进行混匀、用塑料巴氏吸管将其吸取至培养瓶中进行培养亦属于本领域的常规技术手段。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2、3容易获得权利要求1的技术方案，权利要求1不具备创造性。在此基础上，从属权利要求2-4也不具备创造性。2、权利要求5要求保护获得的间充质干细胞的制药用途，对比文件4（脐带间充质干细胞治疗难治性原发性血小板减少性紫癜近期疗效，徐淑芬等，《中国现代医学杂志》，第24卷第33期，公开日2014年11月30日）公开了脐带间充质干细胞用于治疗紫癜的用途，且案例证实上述治疗方案取得了满意的效果，因此，在对比文件4的教导下，本领域技术人员容易想到将分离得到的脐带间充质干细胞用于治疗紫癜，并得到权利要求5限定的制药用途，因此权利要求5不具备创造性，在此基础上，从属权利要求6也不具备创造性。3、权利要求7-8要求保护所述装置，然而，结合权利要求1－3的评述，所述工具或器皿是本领域人员根据实验需求或实验条件的不同容易进行选择的，所述吸管的口径亦是根据待吸取的组织或细胞量容易作出调整的，因此权利要求7－8也不具备创造性。
驳回决定所依据的文本为申请日2015年03月03日提交的说明书摘要、说明书附图，2015年04月22日提交的说明书第1-56段，以及2017年09月22日提交的权利要求第1-8项。
驳回决定所针对的部分权利要求如下：
“1. 一种无动物成分的脐带源间充质干细胞的培养方法，其包括如下步骤：
1)获得脐带组织，洗净，并剥离脐动脉和脐静脉；
2)在小烧杯中将来自步骤1)的脐带组织剪细成泥状；
3)用含5％血清替代物的α-MEM培养基悬浮剪碎的脐带组织，离心后去上清；
4)使用不锈钢搅拌棒将剪碎的脐带组织混合均匀；
5)用塑料巴氏吸管将步骤4)中混合均匀的脐带组织吸取至细胞培养瓶中；
6)用不锈钢搅拌棒的平头一侧，力度较轻地将脐带组织摆成芯片点阵形状；
7)加入含5％血清替代物的α-MEM培养基，培养；
8)用TrypLE解离酶消化细胞、传代到T182的培养瓶中，获得P1代脐带源间充质干细胞；
其中，所述小烧杯是10mL烧杯；
所述不锈钢搅拌棒一侧为圆柱状、另一侧制成扁平状，其直径为3-5mm，其长度为20-30cm。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述塑料巴氏吸管的开口直径为3-5mm。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述塑料巴氏吸管的开口直径为4mm。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其进一步包括传代所获得的P1代脐带源间充质干细胞的步骤。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法获得的无动物成分的脐带源间充质干细胞在制备用于治疗过敏性紫癜的药物中的用途。
6. 根据权利要求5所述的用途，其中所述脐带源间充质干细胞是P4代脐带源间充质干细胞。
7. 一种用于从脐带组织分离脐带源间充质干细胞的装置，其包括10mL烧杯、不锈钢搅拌棒和塑料巴氏吸管，其中所述不锈钢搅拌棒一侧为圆柱状、另一侧制成扁平状，其直径为3-5mm，长度为20-30cm；所述塑料巴氏吸管的开口直径为3-5mm。
8. 根据权利要求7所述的用于从脐带组织分离脐带源间充质干细胞的装置，其中所述塑料巴氏吸管的开口直径为4mm。”
申请人吉林省拓华生物科技有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年02月09日向国家知识产权局提出了复审请求，同时修改了权利要求书，修改后的权利要求书如下：
“1. 一种无动物成分的脐带源间充质干细胞的培养方法，其包括如下步骤：
1)获得脐带组织，洗净，并剥离脐动脉和脐静脉；
2)在小烧杯中将来自步骤1)的脐带组织剪细成泥状；
3)用含5％血清替代物的α-MEM培养基悬浮剪碎的脐带组织，离心后去上清；所述血清替代物为Helios UltraGROTM；
4)使用不锈钢搅拌棒将剪碎的脐带组织混合均匀；
5)用塑料巴氏吸管将步骤4)中混合均匀的脐带组织吸取至细胞培养瓶中；
6)用不锈钢搅拌棒的平头一侧，力度较轻地将脐带组织摆成芯片点阵形状，每个点间隔6mm；
7)加入含5％血清替代物的α-MEM培养基，倒置培养24h后正置，轻轻将瓶中培养基晃动至平铺整个瓶底，继续在培养箱中培养；
8)用TrypLE解离酶消化细胞、传代到T182的培养瓶中，获得P1代脐带源间充质干细胞；
其中，所述小烧杯是10mL烧杯；
所述不锈钢搅拌棒一侧为圆柱状、另一侧制成扁平状，其直径为3-5mm，其长度为20-30cm，所述塑料巴氏吸管的开口直径为3-5mm。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述塑料巴氏吸管的开口直径为4mm。
3. 根据权利要求1-2任一项所述的方法，其进一步包括传代所获得的P1代脐带源间充质干细胞的步骤。”
复审请求人认为：修改后的权利要求1要求保护的技术方案所能达到的技术效果至少包括培养方法简单方便，污染几率小，培养得到的脐带源间充质干细胞无动物成分，无免疫原性，应用于治疗过敏性紫癜更加安全有效。具体而言，本申请中所使用的含5%血清替代物的α-MEM培养基为脐带组织提供了与培养过程相同的预环境，使脐带组织细胞更快地适应后续的培养；先倒置培养24h，细胞贴壁游走，固定于培养瓶壁，再正置培养，使得培养瓶中贴壁细胞分布更加均匀，细胞扩增效率更高，正置培养时脐带组织与培养液充分接触，点与点之间的间隔6mm，但点状脐带组织本身所占面积很小，使细胞可贴壁面积更大，换液过程中不会造成细胞的大量损失，并且有利于细胞之间相互促进生长；专门设计的搅拌棒既可用于搅拌，又方便了芯片点阵形状的摆放，减少了污染几率；吸管的口径是充分考虑对细胞的影响和操作的简便性所设计的，并非显而易见的。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月12日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：（1）利用与培养基成分相同的溶液对细胞进行悬浮或洗涤属于本领域的处理组织细胞的常规操作，且对比文件2披露了利用包含基础培养基与血清替代物的培养基培养脐带间充质干细胞的方法，本领域技术人员据此有动机选择其他市售的适于该细胞培养的血清替代物产品，并通过有限的实验确定其培养效果和加入比例，而血清替代物较之血清能够避免动物成分给细胞培养过程带来的不良影响亦是本领域技术人员熟知的常识。（2）本领域技术人员不能合理预期本申请的脐带组织摆放方式能够使得细胞贴壁面积更大且避免大量细胞损失，而且推测本申请中剪成泥状的组织细胞要比对比文件中剪成块状的组织细胞产生更多的机械损伤。（3）对于搅拌棒和吸管，本领域技术人员能够根据实验需求选择合适的实验工具，也具备对工具进行简单设计或改造的能力。（4）对比文件3公开了先将组织碎块倒置培养，再正置培养的方法，而倒置培养的时间则是本领域技术人员能够根据实验效果的不同容易做出的选择，权利要求的技术方案亦未因这种选择或调整而产生任何意料不到的技术效果。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理，并于2019年04月09日向复审请求人发出复审通知书，认为权利要求1-3相对于对比文件1-3和本领域公知常识的结合不具备创造性。
针对复审通知书，复审请求人于2019年04月25日提交意见陈述书，但未提交修改的申请文件。
请求人认为：（1）本申请中α-MEM培养基与血清替代物的选择及其配比是经过大量的筛选试验得到的，采用该操作为脐带组织提供了与培养过程相同的预环境，使脐带组织细胞更快地适应后续的培养，而现有技术中没有公开也没有教导使用含血清替代物Helios UltraGROTM的α-MEM培养基洗涤脐带组织。（2）本申请中泥状脐带组织被摆放成点状，使细胞可贴壁面积更大，换液过程中不会造成细胞的大量损失，并且细胞之间可相互促进生长，而该操作并非本领域技术人员的常规选择。（3）本申请中使用培养瓶培养细胞，培养瓶培养不易染菌，但操作更为繁琐，操作不当常导致染菌， 因此，本申请中设计特殊的器械即具有特定构造的搅拌棒和具有特定口径的吸管对于避免染菌是十分关键的。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
(一)审查文件
复审请求人在2018年02月09日提出复审请求时提交了权利要求书的全文修改替换页（共3项），经审查，该修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定，因此本复审决定所依据的审查文本为申请日2015年03月03日提交的说明书摘要、说明书附图，2015年04月22日提交的说明书第1-56段；2018年02月09日提交的权利要求第1-3项。
(二)关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果发明是所属技术领域的技术人员在现有技术的基础上仅仅通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验可以得到的，则该发明是显而易见的。
1、权利要求1要求保护一种无动物成分的脐带源间充质干细胞的培养方法，其主要步骤包括：预处理脐带组织（如剥离脉管、剪成泥状），用无血清（即血清替代物为Helios UltraGROTM）的α-MEM培养基悬浮泥状脐带组织，使用特殊器械将脐带组织进行混匀（不锈钢搅拌棒）、移取（塑料巴氏吸管）并点样（不锈钢搅拌棒）至培养瓶中，加入上述培养基进行培养，酶解消化细胞以进行传代。
根据本申请说明书第0003-0004段的记载，本发明为了避免动物血清成分所带来的病毒感染危险和克服酶消化法的步骤繁琐、污染几率大的缺陷，提供一种不含动物成分、易操作的、能普遍应用的、成本较低的可用于临床试验治疗的脐带源间充质干细胞的培养方法。因此，权利要求1的主要技术构思在于通过使用含有血清替代物的α-MEM培养基并配合特殊器械来辅助细胞培养和酶解消化，从而培养脐带源间充质干细胞。
对比文件1同样公开了人脐带源间充质干细胞的分离及培养方法，具体包括下述步骤：取健康胎儿脐带，PBS洗涤后剪成4cm左右小段，纵向剖开，去除血管后剪成小片。将几片脐带组织放在直径3.5 cm的小培养皿里剪碎成泥状后转入离心管中，加PBS，1200r/min，10 min，洗涤3遍。洗涤完毕将沉淀用少量培养基浸润混匀后，种到培养皿中于5%二氧化碳培养箱内培养。……到第13天细胞长满皿底，此时用PBS 冲掉组织块，0.25%胰酶消化贴壁细胞，进行传代，种到培养瓶内于5%二氧化碳培养箱继续培养，此时记为P1 代（参见对比文件1摘要，第1.2.1节）。整体上，对比文件1的主要技术构思在于使用α-MEM培养基并进行细胞培养和酶解消化，从而培养脐带源间充质干细胞。
权利要求1与对比文件1的区别特征在于：(1)权利要求1的α-MEM培养基含有5％的血清替代物（Helios UltraGROTM），对比文件1的α-MEM培养基不含血清或其替代物；（2）二者在脐带组织预处理、培养方式、酶类型及其相应操作参数有所不同，如权利要求1的脐带组织在培养瓶中摆成点阵状，并先倒置培养后正置培养，以及使用Tryple解离酶（一种商用胰酶替代物），而对比文件1并未公开脐带组织的摆放方式和倒置-正置培养方式，其使用胰酶。（3）权利要求1具体限定了培养过程中所使用的特殊器械，例如小烧杯、吸管、搅拌棒、培养瓶等器械器材及其具体规格、型号。
基于以上区别特征结合本申请的发明目的，本申请实际解决的技术问题是：通过引入血清替代成分以及特殊器械，从而提供一种改进的脐带源间充质干细胞的培养方法。
对于区别特征（1），对比文件2公开了脐带间充质干细胞的分离方法，所述培养该间充质干细胞的完全培养基是一种无血清培养基，其由基础培养基和血清替代物及谷胺酰胺组成（参见说明书实施例1－3）。Helios UltraGROTM则为一种市售的血清替代物，并且本领域公知Helios UltraGROTM因含有类似于动物血清中的生长因子、激素、粘附因子、必需营养物质而广泛作为血清替代物而用于无血清培养基以培养动物细胞，并且利用与培养基成分相同的溶液对细胞进行悬浮或洗涤的预处理以使细胞更快适应培养液环境亦是本领域技术人员熟知的操作。因此，在对比文件2的教导下，本领域技术人员结合公知常识容易想到利用市售的不含动物成分的特定血清替代物作为培养基中的营养物质替代动物源血清的使用，以避免动物成分给细胞培养过程带来的不良影响，而血清替代物在培养基中的加入浓度亦是根据实验效果的不同需求易于进行调整的，也没有证据表明该血清替代物及其浓度的选择取得了何种意料不到的技术效果。
对于区别特征（2），对比文件3公开了脐带间充质干细胞的分离培养方法，并公开了将剪碎至1cm3的脐带组织碎块，间隔1cm2均匀摆放，倒置于37℃培养箱中，1h后取出，沿皿壁缓慢加入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM完全培养基，完全覆盖脐带组织块，而后置于培养箱中培养的步骤（参见第7030页左栏最后1段－右栏1段）。即对比文件3公开了将脐带组织摆成点阵状，并采取了先倒置培养再正置培养的培养步骤，至于点阵状脐带组织的间隔、倒置培养的时间等则是本领域技术人员根据对实验效果的要求所能够做出的常规选择。此外，Tryple解离酶属于公知的商用胰酶替代物，同胰酶一样也是本领域用于细胞或组织消化的常规替换物质，本领域技术人员有能力选择适合的消化酶。
对于区别特征（3），根据本申请说明书第0033段的记载，所述间充质干细胞分离或培养过程中所使用的特殊器械，其主要目的在于便于吸取、转移细胞以及减少污染，而这种目的属于细胞培养中普遍存在的需求，本领域技术人员易于根据实验需求或条件的不同进行常规选择。
因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2、3和本领域常规技术手段，容易获得权利要求1的技术方案，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2、权利要求2引用权利要求1，并对所述方法中巴氏吸管的开口直径作出进一步限定，然而所述吸管的口径是根据待吸取的组织量易于作出的调整，且其并未能使所述技术方案取得任何意料不到的技术效果。在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求2亦不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、权利要求3进一步引用在前权利要求，然而，对比文件1还披露了传代所收获的P1代脐带源间充质干细胞，进而获得P2代细胞或更多代细胞的步骤（参见第1.2.1节）。由此可见权利要求3的附加技术特征已经被对比文件1公开，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求3亦不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）关于复审请求人的意见
合议组认为，如前所详述的，本申请对于培养基成分、脐带组织块的点阵间隔、具体培养过程、以及所用器械器皿及其具体规格的设计和选择所取得的效果，或是在现有技术的基础上的常规选择或替换，或是根据试验目的和条件有动机且能够合理调整而获得的，所得技术效果并未超出本领域技术人员的合理预期，因此，复审请求人陈述的意见不具备说服力。
基于上述事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年01月11日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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