发明创造名称：淡紫拟青霉微菌核的发酵方法及其应用
外观设计名称：
决定号：191275
决定日：2019-09-25
委内编号：1F252933
优先权日：
申请（专利）号：201410676430.5
申请日：2014-11-21
复审请求人：重庆大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：曾繁辉
合议组组长：曾武宗
参审员：李振鹏
国际分类号：C12N1/14，A01N63/04，A01P5/00，C12R1/79
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：评价一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别技术特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中不存在这种启示，且本发明的技术方案产生了有益的技术效果，则该发明具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410676430.5，名称为“淡紫拟青霉微菌核的发酵方法及其应用”的发明专利申请。申请人为重庆大学。本申请的申请日为2014年11月21日，公开日为2015年02月18日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年12月08日发出驳回决定，以权利要求1-4不具备创造性为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为申请日2014年11月21日提交的说明书摘要、说明书第1-55段、摘要附图、说明书附图图1至图4；2017年07月07日提交的权利要求第1-4项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种淡紫拟青霉微菌核的发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)制备淡紫拟青霉孢子悬浮液：将活化的淡紫拟青霉的孢子或菌丝体接种于PDA平板培养基上，在25℃下培养8～10天，用0.1～0.5％ Tween-80将平板上的分生孢子洗下，制备成1.0×108孢子/毫升的孢子悬浮液；
2)微菌核诱导培养：将步骤1中制备的淡紫拟青霉孢子悬浮液按照5％的接种量加入诱导培养液中，25～28℃，200～250rpm振荡培养6～8天；
所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下：
KH2PO4:4.0g/L、CaCl2·2H2O:0.8g/L、MgSO4·7H2O:0.6g/L、CoCl2·6H2O：37mg/L、MnSO4·H2O:16mg/L、ZnSO4·7H2O:14mg/L；FeSO4·7H2O 0.2～0.3g/L；葡萄糖：10g/L；酵母膏：5g/L；蛋白胨：2.5g/L；pH值为5.4-6.5；
3)将步骤2)振荡培养得到的微菌核发酵液过滤，弃去上清液，得到微菌核和菌体发酵产物，干燥，保存。
2. 用上述权利要求1所述培养方法获得的淡紫拟青霉微菌核在防治线虫病害中的应用。
3. 用上述权利要求1所述培养方法获得的真菌微菌核在制备防治线虫病害的生防制剂中的应用，其特征在于：所述活性真菌为淡紫拟青霉，所述线虫病害病原物为根结线虫或胞囊线虫。
4. 根据权利要求3所述的微菌核在制备防治线虫病害的生防制剂中的应用，其特征在于：应用方式为：将权利要求1所述培养方法获得的淡紫拟青霉微菌核干燥后与硅藻土或高岭土以及助剂按重量比为微菌核；硅藻土或高岭土﹕助剂＝ 8-10﹕85-88﹕2-5混合后成为微菌核细粒剂，用于防治根结线虫或胞囊线虫。”
驳回理由是：①权利要求1要求保护一种淡紫拟青霉微菌核的发酵方法，与对比文件1（CN 102337221A，公开日：2012年02月01日）所公开的内容相比区别技术特征在于权利要求1制备的是淡紫拟青霉微菌核而对比文件1制备的是莱氏野村菌微菌核，并限定了制备淡紫拟青霉孢子悬浮液的具体步骤和诱导培养基各成分含量。基于该区别技术特征，权利要求1相对于对比文件1实际要解决的技术问题是制备淡紫拟青霉微菌核。对比文件2（CN 103320327A，公开日：2013年09月25日）公开了一种淡紫拟青霉PL461的活化方法（参见权利要求2步骤A），将淡紫拟青霉PL461菌株置于PDA培养基平板上，于26～28℃条件下培养5～9 d（与权利要求1的“8～10天”具有重叠的数值范围），活化。在对比文件2公开了相近的培养温度的基础上，本申请权利要求1的培养温度和孢子悬浮液的浓度本领域技术人员通过有限的试验可以得到。淡紫拟青霉与莱氏野村菌同属于食虫真菌，在应用方面同样存在制备易于应用的制剂的需求。在对比文件1公开了莱氏野村菌微菌核诱导方法的基础上，本领域技术人员有动机尝试采用相同的步骤和组成相同含量相近的诱导培养基诱导淡紫拟青霉微菌核。此外，由于本领域已有多种虫生真菌微菌核诱导成功（除对比文件1公开的莱氏野村菌，还有绿僵菌、白僵菌等），本领域技术人员有动机尝试诱导淡紫拟青霉的微菌核。而微菌核诱导培养时的接种量是所属领域技术人员在现有技术的基础上通过有限的试验可以得到的。在对比文件1公开了成分完全相同，含量范围相近的诱导培养基的基础上，具体的诱导培养基含量是所属领域技术人员在现有技术的基础上通过有限的试验可以得到的。因此，权利要求1要求保护的技术方案对本领域技术人员是显而易见的，不具有突出的实质性特点。权利要求1不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。权利要求2要求保护用上述权利要求1所述培养方法获得的淡紫拟青霉微菌核在防治线虫病害中的应用。对比文件2（参见说明书第4段）公开了淡紫拟青霉菌可用于防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫。因此，在权利要求1所述发酵法获得的淡紫拟青霉微菌核不具备创造性的基础上，权利要求2同样不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。依据相同的原因，权利要求3不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。对比文件2（参见说明书第14-15段）公开了一种淡紫拟青霉菌剂，包括颗粒菌剂、明胶（权利要求4中“助剂”的下为概念）、硅藻土等。可见，对比文件2给出了制备包含明胶（本申请权利要求4中“助剂”的下位概念）、硅藻土的菌剂的技术启示。因此，在其引用的权利要求3不具备创造性的基础上，权利要求4不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。②关于申请人的意见陈述,审查员认为,对比文件1与权利要求1的诱导培养液成分完全相同。至于含量，权利要求1中FeSO4?7H2O的含量范围与对比文件1中的含量范围存在共同的端点0.2 g/L，其他成分除蛋白胨之外所有其他成分的含量均是在对比文件1公开的相应数值范围内选择一个数值点。并且，本申请也未记载上述数值点相对于对比文件1公开范围中的其他数值点有何优异的技术效果，更未提供实验证据证实上述数值点的技术效果。本领域现有技术（参见“几株昆虫病原菌微菌核的诱导培养和条件优化”，杨欣，《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑（月刊）》，2014年第05期，2014年05月15日公开。下文称“对比文件3”）中已经成功诱导微菌核的真菌包括金龟子绿僵菌（子囊菌门、肉座菌目、麦角菌科、绿僵菌属）、球孢白僵菌（囊菌门、肉座菌目、虫草菌科、白僵菌属）、大丽轮枝孢菌（半知菌亚门轮枝菌属）、莱氏野村菌（无性型真菌门、半知菌纲、丝孢菌目、淡色菌科、莱氏野村菌属），现有技术认为影响微菌核产生的因素包括碳源浓度、碳氮比、温度等因素。由于上述成功诱导微菌核的真菌均属于不同种属，本领域技术人员能够得到微菌核广泛存在于不同种属真菌的技术启示，从而有动机尝试诱导其他种属真菌的微菌核。淡紫拟青霉与莱氏野村菌同属于生防用菌，在应用方面同样存在制备易于应用的制剂的需求。虽然淡紫拟青霉与莱氏野村菌的种属不同，但是由于现有技术已经成功诱导了不同种属真菌的微菌核，种属差异不会成为本领域技术人员尝试诱导其他种属真菌微菌核的障碍。对比文件1公开的莱氏野村菌的微菌核诱导条件与本申请权利要求1的淡紫拟青霉微菌核的诱导条件完全一致，鉴于本申请实施例按照该条件诱导出了淡紫拟青霉微菌核，申请人在意见陈述中却声称该条件不能诱导出淡紫拟青霉的微菌核，存在严重的自相矛盾，审查员无法采信申请人的上述意见。本领域技术人员在选择一种新的真菌进行微菌核诱导时，通常会参照现有技术中的诱导条件和诱导培养液，并对现有技术中认为影响微菌核产生的因素进行试验，最终选择适当的诱导条件和诱导培养液。由于现有技术已经指出，碳源浓度、碳氮比是影响微菌核产生的因素，本领域技术人员有动机对上述参数对淡紫拟青霉微菌核产生的影响进行考察，设定适当的浓度梯度进行试验，调整诱导培养液中的蛋白胨含量。而适当的碳源浓度和碳氮比是本领域技术人员通过有限的试验能够获得的。申请人在意见陈述中认为接种量的多少对于微菌核能否成功大量诱导十分关键。但是，关于接种量对于产生微菌核的影响，原说明书中并未提及，更未提供试验证据证实。申请人利用接种量对产生微菌核的影响争辩本申请的创造性在原申请文件中缺乏依据。此外，申请人的意见陈述中也没有给出接种量试验的具体操作步骤和实验条件，而仅给出了实验结果，无法充分说明其实验结果与本申请要求保护的技术方案的关联性。
申请人重庆大学（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年05月23日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。复审请求人认为：真菌微菌核是在特定真菌的生长时期或者特定的环境条件形成的一种抗逆体，在真菌领域，微菌核不是广泛存在的，不能显而易见地知道其他未报道的真菌能否产生微菌核，不能确定其它真菌在何种特定时期或何种逆境条件下产生微菌核，也不能仅通过常规培养即可获得 。莱氏野村菌与淡紫拟青霉分别属于同一目中的不同科属，自身结构和生理特征及功能特性明显不同，现有技术（参见“不同科属来源的六株Frankia代表菌株碳源利用谱的研究”，崔玉海和丁鉴，《微生物学杂志》，第8卷第3期，第30-33页，1988年09月）表明不同科属来源的菌株在碳源利用种类和程度上有明显差异，二者适宜的生长条件及微菌核的生产条件也必然不相同，不能显而易见地将对比文件1的方案用于诱导淡紫拟青霉产生微菌核，更不能显而易见地推知如何调整对比文件1的方案才能满足淡紫拟青霉生产微菌核的要求。对比文件2的发酵产物为淡紫拟青霉孢子，与本申请方法制备的淡紫拟青霉的微菌核属于不同培养条件下的发酵产物，二者在形态结构和抗逆特性等方面均有明显的不同，不能显而易见地想到将两者的技术方案结合。本申请发酵方法制备的淡紫拟青霉菌微菌核高温、紫外处理时萌发率下降少，明显好于分生孢子，具有显著的进步。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年06月04日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：本领域现有技术（参见对比文件3）中已经成功诱导微菌核的真菌包括金龟子绿僵菌、球孢白僵菌、大丽轮枝孢菌、莱氏野村菌，现有技术认为影响微菌核产生的因素包括碳源浓度、碳氮比、温度等因素。由于上述成功诱导微菌核的真菌均属于不同种属，本领域技术人员能够得到微菌核存在于不同种属真菌的技术启示，从而有动机尝试诱导其他种属真菌的微菌核。淡紫拟青霉与莱氏野村菌同属于生防用菌，在应用方面同样存在制备易于应用的制剂的需求。虽然淡紫拟青霉与莱氏野村菌的种属不同，但是由于现有技术已经成功诱导了不同种属真菌的微菌核，种属差异不会成为本领域技术人员尝试诱导其他种属真菌微菌核的障碍。在尝试诱导一种不同种属的真菌时，本领域技术人员通常会从已知的诱导微菌核的条件入手，通过梯度试验确定适合的诱导条件。对比文件1公开的莱氏野村菌的微菌核诱导条件为：培养基pH=5.4～6.5，温度为23~28℃（与本申请权利要求1有共同的端点“28℃”），摇床转速为200～250rpm（与本申请权利要求1的振荡转速完全相同）或者发酵罐转速为80～100rpm，培养时间为144～192h（即本申请权利要求1的“培养6～8天”）。可见，对比文件1公开的莱氏野村菌的微菌核诱导条件与本申请权利要求1的淡紫拟青霉微菌核的诱导条件完全一致。引用对比文件2是为了说明本申请权利要求1步骤1制备淡紫拟青霉孢子悬浮液是本领域技术人员在对比文件2和对比文件1的基础上结合有限的实验能够得到的。本申请权利要求1和对比文件2终产品的不同并不妨碍本领域技术人员获得淡紫拟青霉培养条件的技术启示。 因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在复审阶段未提交修改文件，因此，本复审决定针对的文本为：申请日2014年11月21日提交的说明书摘要、说明书第1-10页（即第1-55段）、摘要附图、说明书附图图1至图4；2017年7月7日提交的权利要求第1-4项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，评价一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别技术特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中不存在这种启示，且本发明的技术方案产生了有益的技术效果，则该发明具备创造性。
本案权利要求1要求保护一种淡紫拟青霉微菌核的发酵方法。对比文件1公开了一种莱氏野村菌微菌核诱导产生的方法，其特征在于按以下步骤进行：（1）把莱氏野村菌菌种活化，待用；（2）接种体制备：将活化的野村菌接种于SMAY培养基上，在25～28℃下连续光照培养144-192h，用0.1%～0.5%的Tween80水溶液将平板上的孢子或菌丝体洗下，配制莱氏野村菌接种体悬浮液；（3）液体发酵诱导：将接种体加入诱导培养液中进行发酵培养，将所得的发酵液过滤，弃去上清液，得到沉淀微菌核和菌体，干燥，保存；所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下：葡萄糖 10～50g/L，酵母膏5～10g/L，蛋白胨5～10g/L，KH2PO4 3～5g/L，CaCl2.2H2O 0.7～0.9g/L，MgSO4.7H2O 0.5～0.7g/L，FeSO4.7H2O 0.1～0.2g/L，CoCl2.6H2O 35～40mg/L，MnSO4.H2O 15～20mg/L，ZnSO4.7H2O 14～20mg/L，脱离子水配制；所述液体发酵的工艺条件为：培养基pH=5.4～6.5，温度为23～28℃，摇床转速为200～250rpm或者发酵罐转速为80～100rpm，培养时间为144～192h（参见权利要求1）。两者相比区别技术特征在于产生微菌核的微生物菌株不同（即：本案权利要求1由淡紫拟青霉发酵产生而对比文件1由莱氏野村菌产生），且本申请限定了淡紫拟青霉孢子悬浮液的接种量和诱导培养液中蛋白胨的不同含量。基于上述区别技术特征，本案权利要求1实际解决的技术问题是提供制备淡紫拟青霉微菌核的方法。
驳回决定和前置审查意见认为，在对比文件1公开了莱氏野村菌微菌核诱导方法的基础上，由于本领域现有技术（参见对比文件3）中已经成功诱导微菌核的真菌包括金龟子绿僵菌（子囊菌门、肉座菌目、麦角菌科、绿僵菌属）、球孢白僵菌（子囊菌门、肉座菌目、虫草菌科、白僵菌属）、大丽轮枝孢菌、莱氏野村菌，现有技术认为影响微菌核产生的因素包括碳源浓度、碳氮比、温度等因素，本领域技术人员有动机尝试采用与对比文件1相同的步骤和组成相同含量相近的诱导培养基并结合对比文件2公开的淡紫拟青霉PL461的活化方法来诱导淡紫拟青霉微菌核，具体的诱导培养基含量是所属领域技术人员在现有技术的基础上通过有限的试验可以得到的。因此，权利要求1要求保护的技术方案对本领域技术人员是显而易见的，不具备创造性。
对此，合议组认为：
在考虑现有技术整体上是否存在将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示时，应当考虑现有技术整体上是否存在将莱氏野村菌发酵产生微菌核的方法转用到淡紫拟青霉上以发酵产生其微菌核的启示，而是否存在该转用启示，取决于现有技术是否已知淡紫拟青霉能够产生微菌核以及本领域技术人员是否认为莱氏野村菌与淡紫拟青霉的生物学特性足够接近导致可产生转用的动机，一般来说，菌株的微生物学分类地位相距越远，其生物学特性差距越大，本领域的技术人员产生转用的动机也就越不明显。
对本案而言，首先，现有技术已知真菌微菌核是在特定真菌的生长时期或者特定的环境条件形成的一种抗逆体，在真菌领域，微菌核不是广泛存在的。对比文件3虽然公开了包括金龟子绿僵菌（子囊菌门、肉座菌目、麦角菌科、绿僵菌属）、球孢白僵菌（子囊菌门、肉座菌目、虫草菌科、白僵菌属）、大丽轮枝孢菌、莱氏野村菌的菌株成功诱导产生了微菌核，但是这些菌株与淡紫拟青霉分别属于不同科，分类地位相差较远，不能显而易见地预期淡紫拟青霉也能够产生微菌核，且前审也并未提供淡紫拟青霉或与其分类地位接近的同种或者同属的其它菌株能够产生微菌核的现有技术证据，不能显而易见地确定淡紫拟青霉能够产生微菌核。其次，莱氏野村菌与淡紫拟青霉分别属于同一目中的不同科，其分类地位相距较远，自身结构和生理特征及功能特性明显不同，二者适宜的生长条件及微菌核的生产条件按本领域的常识预期也必然会有不同，本领域的技术人员不能显而易见地产生将对比文件1的方案转用于诱导淡紫拟青霉产生微菌核的动机，更不能显而易见地在对比文件1的方案基础上从现有技术认为影响微菌核产生的众多因素中选择本发明的技术方案并预期其能够满足淡紫拟青霉生产微菌核的要求。对比文件2同样没有公开涉及淡紫拟青霉产生微菌核的相关内容，也无法产生上述相关启示和动机。因此，在前审提供的上述现有技术证据的前提下，现有技术整体上并不存在将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，且本申请说明书实施例1-2证实了本发明的发酵方法能够产生淡紫拟青霉菌微菌核，实施例4-5证实了其高温、紫外处理时萌发率下降少，明显好于分生孢子，产生了明显有益的技术效果，因此本案权利要求1所要求保护的技术方案相对于对比文件1、2和3所反映的现有技术整体具备创造性，符合专利法第22条第3款的规定。在独立权利要求1具备创造性的情况下，直接或间接引用权利要求1的其余权利要求2-4也均具备专利法第22条第3款规定的创造性。
综上所述，驳回决定、前置意见所指出的权利要求1-4不具备创造性的理由不成立。
基于上述事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2017年12 月08 日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审请求审查决定所针对的文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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