发明创造名称：一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法
外观设计名称：
决定号：190418
决定日：2019-09-18
委内编号：1F261036
优先权日：
申请（专利）号：201610223375.3
申请日：2016-04-12
复审请求人：上海奥普生物医药有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：崔秀艳
合议组组长：魏嵬
参审员：陈雯菁
国际分类号：G01N33/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求所要求保护的技术方案与最接近的现有技术相比，存在多个区别技术特征，其中部分区别技术特征被另一篇现有技术公开且给出了相结合的启示，其余区别技术特征属于本领域的常规选择，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610223375.3，名称为“一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法”的发明专利申请（下称本申请），其申请日为2016年04月12日，公开日为2016年08月24日，申请人为上海奥普生物医药有限公司。
经实质审查，国家知识产权局专利实质审查部门于2018年06月04日发出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：权利要求1-8不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
驳回决定中引用如下对比文件：
对比文件1：CN104714015A，公开日为2015年06月17日；
对比文件2：CN104090248A，公开日为2014年10月08日；
对比文件3：CN104198723A，公开日为2014年12月10日。
驳回决定所依据的文本为：申请日2016年04月12日提交的说明书第1-12页、说明书附图第1-2页、说明书摘要和摘要附图；2017年08月07日提交的权利要求第1-8项。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：该试剂由试纸条和荧光液两部分组成；所述的试纸条包括底板(1)、Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)；
所述Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)水平方向顺序连接固定于底板上；
所述的荧光液(7)包含H-FABP单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球；
所述硝酸纤维素膜(3)上包被有H-FABP单克隆抗体1(5)、的检测线和兔IgG抗体(6)构成的质控线。
2. 根据权利要求1所述的快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的时间分辨荧光微球选自修饰过的聚苯乙烯微球。
3. 根据权利要求2所述的快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的聚苯乙烯微球，表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种，粒径为100～500nm。
4. 根据权利要求1所述的快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的时间分辨荧光微球内部填充镧系元素的螯合物。
5. 根据权利要求4所述的快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的镧系元素为铕、钐、鈊、镝中的一种。
6. 根据权利要求1所述的一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的时间分辨荧光微球标记步骤如下：
(1)H-FABP单克隆抗体2标记时间分辨荧光微球的制备及稀释：
将时间分辨荧光微球溶于MES缓冲液中，加入活化剂活化；随后加入氨基乙酸，使得微球表面连接手臂；洗涤、离心后，再次加入活化剂活化；再次洗涤、离心，将时间分辨荧光微球用硼酸缓冲液复溶，随后加入H-FABP单克隆抗体2 进行反应，硼酸溶液、微球与抗体的质量比为10mg:0.01mg～10mg：2.0mg；反应完后加入封闭剂进行封闭；封闭过后，洗涤、离心，再次用硼酸缓冲液及封闭剂复溶、超声，使微球均匀分散在缓冲液中，2-8℃避光保存。选择合适的缓冲液稀释荧光微球，工作浓度在0.5～50μg/ml，用于H-FABP性能的评估。
(2)羊抗兔抗体标记的荧光微球的制备及稀释过程同(1)所述。
7. 一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法，包括如下步骤：
(1)制备检测线和质控线：硝酸纤维素膜(3)在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生的场所；检测线(5)是将H-FABP单克隆抗体1使用柠檬酸盐或蔗糖稀释液稀释，划线于所述硝酸纤维素膜(3)上；质控线(6)是将兔IgG抗体使用柠檬酸盐或蔗糖稀释液稀释，划线与所述硝酸纤维素膜(3)上。将划好的硝酸纤维素膜置于真空干燥箱，在37～45℃下，烘干24～48小时。检测线(5)位于质控线(6)左侧，即液体首先接触的位置；
(2)试纸条的组装：试纸条底板(1)由左到右依次粘附Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水纸(4)。将组装好的大板切成小条，即得到所述快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试纸条。
8. 根据权利要求7所述的快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂的制备方法，其特征在于：所述的柠檬酸盐或蔗糖稀释液中柠檬酸盐或蔗糖占5-20％。”
驳回决定具体指出：（1）权利要求1要求保护一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，对比文件1公开了一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，该权利要求所要求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于：1）试剂的组成和试纸条的结构不同，权利要求1中试剂由试纸条和荧光液两部分组成，试纸条底板上顺序连接固定有Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水垫，而对比文件1中荧光微球设置在试纸卡上，底板上依次黏贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；2）权利要求1中荧光液包括H-FABP单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球，质控线包被有兔IgG抗体。上述区别技术特征1）部分被对比文件2公开且给出了相结合的启示，其他部分属于本领域的常规选择。上述区别技术特征2）属于本领域的常用技术手段，或者属于本领域技术人员容易想到的内容。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（2）权利要求7要求保护一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法，对比文件1公开了一种公开了一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及其制备方法，该权利要求所要求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于：1）试纸条的结构不同，权利要求1中试纸条底板依次粘附Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水纸，而对比文件1中试纸卡底板上依次黏贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；2）权利要求1中质控线包被的是兔IgG抗体；3）包被抗体的稀释液、硝酸纤维素膜的干燥条件不同，权利要求1中检测线位于质控线左侧，即液体首先接触的位置。上述区别技术特征1）部分被对比文件2公开且给出了相结合的启示，其他部分属于本领域的常规选择。上述区别技术特征2）-3）属于本领域的常用技术手段。因此，权利要求7不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（3）从属权利要求2-5的附加技术特征或者被对比文件1公开，或者属于本领域的常规选择；从属权利要求6的附加技术特征部分被对比文件3公开且给出了相结合的启示，其他部分属于本领域的常规选择；从属权利要求8的附加技术特征属于本领域的常规选择。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求2-6、8也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人上海奥普生物医药有限公司（下称复审请求人）不服上述驳回决定，于2018年09月18日向国家知识产权局提出复审请求，未修改申请文件。复审请求人认为：（1）从技术领域来看：权利要求1是为了提供快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂；对比文件2是提供β-受体激动剂和兽药等残留提供了快速、灵敏、定量的检测方法。本领域技术人员没有任何动机将检测“β-受体激动剂和兽药等残留”与检测H-FABP的两种技术方案相结合。此外，本申请的IPC分类号与对比文件1、对比文件2的IPC分类号不在同一小组，且三者各不相同。因此，本领域技术人员是没有动机将对比文件1和对比文件2相结合。（2）从所要解决的技术问题和技术效果来看：对比文件1没有解决本申请所要解决的技术问题，也未能产生相同的技术效果；对比文件2也没有全部解决本申请所要解决的技术问题，也未能产生相同的技术效果。权利要求1获得了预料不到的技术效果。（3）从解决问题的技术手段来看：权利要求1采用“Fusion5为样品垫，摒弃了传统的样品垫及结合物释放垫”；对比文件1没有采用相同的技术方案；对比文件2也没有采用相同的技术方案。没有证据表明“Fusion5是本领域常用的样品垫材料”。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年09月21日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年06月24日发出复审通知书，指出：（1）权利要求1要求保护一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，对比文件1公开了一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒。该权利要求所要求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于：1）试剂的组成和试纸条的结构不同，权利要求1中试剂由试纸条和荧光液两部分组成，Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水垫水平方向顺序连接固定于底板上，而对比文件1中试纸卡由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；2）权利要求1中荧光液包括H-FABP单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球，质控线包被有兔IgG抗体。上述区别技术特征1）部分被对比文件2公开且给出了相结合的启示，其他部分属于本领域的常规选择。上述区别技术特征2）属于本领域的常用技术手段，或者属于本领域技术人员容易想到的内容。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（2）权利要求7要求保护一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法，对比文件1公开了一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及其制备方法。该权利要求所要求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于：1）试纸条的结构不同，Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水垫水平方向顺序连接固定于底板上，而对比文件1中试纸卡由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；2）权利要求1中质控线包被的是兔IgG抗体；3）包被抗体的稀释液、干燥箱为真空干燥箱，硝酸纤维素膜的干燥时间不同，权利要求1中检测线位于质控线左侧，即液体首先接触的位置。上述区别技术特征1）部分被对比文件2公开且给出了相结合的启示，其他部分属于本领域的常规选择。上述区别技术特征2）-3）属于本领域的常用技术手段。因此，权利要求7不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（3）从属权利要求2-5的附加技术特征或者被对比文件1公开，或者属于本领域的常规选择；从属权利要求6的附加技术特征部分被对比文件3公开，其他部分属于本领域的常规选择；从属权利要求8的附加技术特征属于本领域的常规选择。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求2-6、8也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（4）对复审请求人的意见进行了详细评述。
复审请求人于2019年08月08日提交了意见陈述书和权利要求书的全文修改替换页，修改涉及：权利要求1中加入特征“粒径为100~500nm”，和“所述的时间分辨荧光微球粒径为200nm”；删除权利要求3中的特征“粒径为100～500nm”。复审请求人认为：（1）权利要求1相对于对比文件1的区别在于：1）权利要求1试剂的组成和试纸条的结构不同，权利要求1中试剂由试纸条和荧光液两部分组成；且试纸条底板上顺序连接固定有Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水垫，而对比文件1中的荧光微球设置在试纸卡上，底板上依次黏贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；2）权利要求1中荧光液包括H-FABP单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球，质控线包被有兔IgG抗体。3）限定了时间分辨荧光微球粒径为200nm。（2）本申请中的时间分辨荧光微球结构和荧光染料（Eu3 螯合物）的选择，使得本申请的时间分辨荧光微球具有有益的技术效果。（3）本申请最优的时间分辨荧光微球的粒径为200nm，而对比文件1披露的荧光微球的粒径为50-120nm。选择粒径为200nm左右的时间分辨荧光微球偶联抗体后离心时间短、超声分离的时间短、分散度好、能够长期保存、测试试剂的线性范围宽，具有综合性能最佳最优的技术效果，该技术效果为预料不到的技术效果。本领域技术人员没有动机自对比文件1的技术方案中获得使用粒径为200nm的时间分辨荧光微球的技术启示。该区别技术特征3）也不是常规技术手段。（4）从技术领域来看：权利要求1是为了提供快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂；对比文件2是提供β-受体激动剂和兽药等残留提供了快速、灵敏、定量的检测方法。本领域技术人员没有任何动机将检测“β-受体激动剂和兽药等残留”与检测H-FABP的两种技术方案相结合。此外，本申请的IPC分类号与对比文件1、对比文件2的IPC分类号并不在同一小组，三者各不相同。本领域技术人员没有动机将对比文件1和对比文件2相结合。（5）从所要解决的技术问题和技术效果来看：对比文件1没有解决本申请所要解决的技术问题，也未能产生相同的技术效果；对比文件2也没有全部解决上述技术问题，也未能产生相同的技术效果。权利要求1获得了预料不到的技术效果。（6）从解决问题的技术手段来看：权利要求1采用“Fusion5为样品垫，摒弃了传统的样品垫及结合物释放垫”；对比文件1没有采用相同的技术方案；对比文件2也没有采用相同的技术方案。没有证据表明“Fusion5是本领域常用的样品垫材料”。
答复复审通知书时修改的权利要求书如下：
“1. 一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：该试剂由试纸条和荧光液两部分组成；所述的试纸条包括底板(1)、Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)；
所述Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)水平方向顺序连接固定于底板上；
所述的荧光液(7)包含H-FABP单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球；粒径为100～500nm。
所述硝酸纤维素膜(3)上包被有H-FABP单克隆抗体1(5)、的检测线和兔IgG抗体(6)构成的质控线；
所述时间分辨荧光微球的粒径为200nm。
2. 根据权利要求1所述的快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的时间分辨荧光微球选自修饰过的聚苯乙烯微球。
3. 根据权利要求2所述的快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的聚苯乙烯微球，表面修饰官能团为羧基、羟基或环氧基的一种。
4. 根据权利要求1所述的快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的时间分辨荧光微球内部填充镧系元素的螯合物。
5. 根据权利要求4所述的快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的镧系元素为铕、钐、鈊、镝中的一种。
6. 根据权利要求1所述的一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：所述的时间分辨荧光微球标记步骤 如下：
(1)H-FABP单克隆抗体2标记时间分辨荧光微球的制备及稀释：
将时间分辨荧光微球溶于MES缓冲液中，加入活化剂活化；随后加入氨基乙酸，使得微球表面连接手臂；洗涤、离心后，再次加入活化剂活化；再次洗涤、离心，将时间分辨荧光微球用硼酸缓冲液复溶，随后加入H-FABP单克隆抗体2进行反应，硼酸溶液、微球与抗体的质量比为10mg:0.01mg～10mg：2.0mg；反应完后加入封闭剂进行封闭；封闭过后，洗涤、离心，再次用硼酸缓冲液及封闭剂复溶、超声，使微球均匀分散在缓冲液中，2-8℃避光保存。选择合适的缓冲液稀释荧光微球，工作浓度在0.5～50μg/ml，用于H-FABP性能的评估。
制备H-FABP、羊抗兔时间分辨荧光微球
将时间分辨荧光微球(粒径为200nm左右)溶于100mM MES缓冲液(PH为6.0)中，加入活化剂(NHS,20mg/ml；EDC,20mg/ml)活化15分钟；洗涤、离心，将时间分辨荧光微球用60mM硼酸缓冲液(PH为8.5)复溶，随后加入H-FABP单克隆抗体2进行反应2小时(微球与抗体的质量比在10mg:0.5mg)；反应完后加入封闭剂(BSA，100mg/ml)进行封闭2小时；封闭过后，洗涤、离心，再次用60mM硼酸缓冲液(PH为8.5)及封闭剂(BSA，100mg/ml)复溶、超声，使微球均匀分散在缓冲液中，2-8℃避光保存。
羊抗兔抗体标记的荧光微球的制备过程同H-FABP制备微球的过程相同
(2)羊抗兔抗体标记的荧光微球的制备及稀释过程同(1)所述。
7. 一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法，包括如下步骤：
(1)制备检测线和质控线：硝酸纤维素膜(3)在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生的场所；检测线(5)是将H-FABP单克隆抗体1使用柠檬酸盐或蔗糖稀释液稀释，划线于所述硝酸纤维素膜(3)上；质控线(6)是将兔IgG抗体使用柠檬酸盐或蔗糖稀释液稀释，划线与所述硝酸纤维素膜(3)上。将划好的硝酸纤维素膜置于真空干燥箱，在37～45℃下，烘干24～48小时。检测线(5)位于质控线(6)左侧，即液体首先接触的位置；
(2)试纸条的组装：试纸条底板(1)由左到右依次粘附Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水纸(4)。将组装好的大板切成小条，即得到所述快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试纸条。
8. 根据权利要求7所述的快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂的制备方法，其特征在于：所述的柠檬酸盐或蔗糖稀释液中柠檬酸盐或蔗糖占5-20％。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人在2019年08月08日答复复审通知书时提交了权利要求书的全文修改替换页，经查，其修改符合专利法第33条的规定。本复审请求审查决定依据的审查文本是：申请日2016年04月12日提交的说明书第1-12页、说明书附图第1-2页、说明书摘要和摘要附图；2019年08月08日提交的权利要求第1-8项。
2、关于专利法第22条第3款
创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果权利要求所要求保护的技术方案与最接近的现有技术相比，存在多个区别技术特征，其中部分区别技术特征被另一篇现有技术公开且给出了相结合的启示，其余区别技术特征属于本领域的常规选择，则该权利要求不具备创造性。
权利要求1-8不具备专利法22条第3款规定的创造性。
（1）权利要求1要求保护一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，对比文件1公开了一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，该试剂盒利用荧光免疫层析法，并具体公开了以下技术特征（参见说明书第【0007】段，实施例1）：
一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，设有试纸卡（相当于本申请中的试纸条），所述试纸卡由下自上依次设有：PVC板（相当于本申请中的底板）、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球（相当于本申请中的时间分辨荧光微球）标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体（相当于本申请中的H-FABP单克隆抗体2），所述稀土荧光微球的直径为50-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光。
包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制备：采用与获得结合垫上心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体不同的序列位点，合成多肽序列，参照上述单克隆抗体制备流程获得心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体。用包被稀释液将心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体（相当于本申请中的H-FABP单克隆抗体1）调整浓度，作为检测线喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被。
试纸卡的组装：在PVC板1上依次粘贴经过处理的样品垫2、吸附有稀土荧光标记的抗体的结合垫3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4和吸水垫5，组装后得到试纸大板，按照要求切割成4mm宽，将试纸装入塑料卡内形成试纸卡。
该权利要求所要求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于：1）试剂的组成和试纸条的结构不同，权利要求1中试剂由试纸条和荧光液两部分组成，Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水垫水平方向顺序连接固定于底板上，而对比文件1中试纸卡由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；2）权利要求1中荧光液包括H-FABP单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球，时间分辨荧光微球的粒径为200nm；质控线包被有兔IgG抗体。基于上述区别技术特征，可以确定本申请实际解决的技术问题是如何使检测样本与标记物充分反应和提供相对独立的质控体系。
对于区别技术特征1），对比文件2公开了铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂，由硝酸纤维素膜、吸水纸、样品垫、PVC底板组成的试卡或试条及微孔容器组成，被测样本先溶出附着在微孔容器内标记抗β-受体激动剂小分子抗体的Eu3 荧光乳胶颗粒并充分混合，使检测样本和标记物充分反应，然后把此反应液滴加到试卡或试条上进行免疫层析（参见说明书摘要、附图1）。由此可见，对比文件2公开了试卡或试条上不具有结合垫，PVC底板上水平方向依次连接固定有样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。且对比文件2给出了先将待测样本与时间分辨荧光微球反应，再添加到试纸条上层析以确保检测样本与标记物的充分反应的技术启示。在此基础上，为了促进H-FABP时间分辨免疫荧光层析试剂检测样本与标记物的充分反应，本领域技术人员有动机使该试剂由试纸条和荧光液两部分组成。此外，Fusion5是本领域常用的样品垫材料。
对于区别技术特征2），采用标记物标记的待测目标物质的单克隆抗体和羊抗兔抗体作为免疫层析试纸用结合物，后者用于独立的质控体系，是本领域常用的技术手段。即，为了实现H-FABP的检测，在荧光液中包括H-FABP单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球，属于本领域技术人员容易想到的内容。对比文件1公开了质控线包括羊抗小鼠IgG抗体，为了形成独立的质控体系，荧光液包括羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球属于本领域技术人员容易想到的内容。当采用时间分辨荧光微球标记羊抗兔抗体作为标记物质时，本领域技术人员容易想到将兔IgG抗体包被在质控线上。对比文件1公开了荧光微球的粒径为50-120nm。粒径大小可能对样品与抗体的结合效果、后续处理均产生影响，本领域技术人员根据实际需要，有动机改进粒径的尺寸，具体选择粒径为200nm属于本领域的常规选择。
因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2和本领域公知常识得到该权利要求所要求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，该权利要求不具有突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（2）权利要求2是权利要求1的从属权利要求，权利要求3是权利要求2的从属权利要求。稀土荧光微球表面修饰有羧基、羟基或环氧基的聚苯乙烯微球是本领域常用的时间分辨荧光微球。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求2-3也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（3）权利要求4是权利要求1的从属权利要求，权利要求5是权利要求4的从属权利要求。对比文件1已经公开了所述稀土荧光微球优选掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu) 、钐( Sm) 、铒(Er) 、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物，稀土荧光微球优选掺杂稀土络合物（参见说明书第【0008】段）。而镧系元素螯合物也常用于制备稀土荧光微球，鈊、镝也是本领域常用的稀土元素。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求4-5也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（4）权利要求6是权利要求1的从属权利要求，进一步限定了所述的时间分辨荧光微球标记步骤。对比文件1公开了将心型脂肪酸结合蛋白抗体与表面修饰有醛基的稀土荧光微球偶联（参见说明书第【0010】段）。而对比文件3公开了一种包被抗人NGAL抗体的乳胶颗粒的制备方法，包括：1）羧基化聚苯乙烯微球的活化，2）氨基酸间臂与羧基化聚苯乙烯微球偶联，3）接有氨基酸间臂微球的再活化，4）NGAL抗体偶联至氨基酸间臂。通过在乳胶微球与抗体之间增加一氨基酸间臂，减小了抗体不定向偶联造成的抗原抗体结合空间位阻，从而提高了检测试剂的灵敏度与线性范围（参见说明书第【0011】、【0017】-【0027】、【0031】段）。而心型脂肪酸结合蛋白抗体和羊抗兔抗体与时间分辨荧光微球的偶联同样存在着抗体不定向偶联造成的抗原抗体结合空间位阻的问题。为了解决该问题，本领域技术人员有动机采用对比文件3所述的偶联方法进行H-FABP单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球和羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球的制备，将时间分辨荧光微球活化后，加入氨基乙酸，使得微球表面连接手臂，然后再次活化，连接抗体。对比文件3已经公开了具体的制备步骤（参见说明书第【0022】-【0027】段）：(1) 羧基化聚苯乙烯微球的活化：取粒径为100-140nm 的聚苯乙烯微球，用活化缓冲液清洗分散后，加入水溶性碳化二亚胺（EDC）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）（相当于本申请中的活化剂），室温搅拌反应；离心弃上清，用反应缓冲液分散均匀沉淀颗粒，得到活化的聚苯乙烯微球。(2) 氨基酸间臂与羧基化聚苯乙烯微球偶联：向活化的聚苯乙烯微球中加入适量氨基酸，室温搅拌反应适当时间，离心洗2 次，用活化缓冲液分散均匀沉淀颗粒，得到连有氨基酸间壁的聚苯乙烯微球。(3) 接有氨基酸间臂微球的再活化：向步骤(2)中制备的连有氨基酸间壁的聚苯乙烯微球中加入水溶性碳化二亚胺（EDC）和N-羟基硫代琥珀酰亚（Sulfo-NHS）对氨基酸间臂游离羧基进行再活化，室温搅拌反应；离心清洗2 次，用反应缓冲液分散均匀沉淀颗粒。(4) NGAL抗体偶联至氨基酸间臂：向步骤(3)中制备的再活化微球中加入适量抗人NGAL 抗体，室温反应2-6h，加入乙醇胺及BSA封闭15-60mim，洗两次后，保存于含保护剂、表面活性剂、防腐剂的生物缓冲液B中，即R2。制备和稀释过程中各试剂、条件、参数和操作细节是本领域技术人员采用常用技术手段根据实际需求能够选择和调整的，且没有取得预料不到的技术效果。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2、3和本领域公知常识得到该权利要求进一步限定的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，该从属权利要求也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（5）权利要求7要求保护一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法，对比文件1公开了一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒利用荧光免疫层析法，并具体公开了以下技术特征（参见说明书第【0007】段，实施例1）：
一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，设有试纸卡（相当于本申请中的试纸条），所述试纸卡由下自上依次设有：PVC板（相当于本申请中的底板）、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球（相当于本申请中的时间分辨荧光微球）标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为50-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光。
分别用包被稀释液将心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体（相当于本申请中的H-FABP单克隆抗体1）和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时（相当于本申请中的制备检测线和质控线步骤）；
试纸卡的组装：在PVC板1上依次粘贴经过处理的样品垫2、吸附有稀土荧光标记的抗体的结合垫3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4和吸水垫5，组装后得到试纸大板，按照要求切割成4mm宽，将试纸装入塑料卡内形成试纸卡（相当于本申请中的将组装好的大板切成小条，即得到所述快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试纸条）。
硝酸纤维素膜在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生场所是对比文件1隐含公开的内容。
该权利要求所要求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于：1）试纸条的结构不同，Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水垫水平方向顺序连接固定于底板上，而对比文件1中试纸卡由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；2）权利要求1中质控线包被的是兔IgG抗体；3）包被抗体的稀释液、干燥箱为真空干燥箱，硝酸纤维素膜的干燥时间不同，权利要求1中检测线位于质控线左侧，即液体首先接触的位置。基于上述区别技术特征，可以确定本申请实际解决的技术问题是如何使检测样本与标记物充分反应和提供相对独立的质控体系。
对于区别技术特征1），对比文件2公开了铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂，由硝酸纤维素膜、吸水纸、样品垫、PVC底板组成的试卡或试条及微孔容器组成，被测样本先溶出附着在微孔容器内标记抗β-受体激动剂小分子抗体的Eu3 荧光乳胶颗粒并充分混合，使检测样本和标记物充分反应，然后把此反应液滴加到试卡或试条上进行免疫层析（参见说明书摘要、附图1）。由此可见，对比文件2公开了试卡或试条上不具有结合垫，PVC底板上水平方向依次连接固定有样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。且对比文件2给出了先将待测样本与时间分辨荧光微球反应，再添加到试纸条上层析，能够确保检测样本与标记物的充分反应的技术启示。Fusion5是本领域常用的样品垫材料。
对于区别技术特征2），采用标记物标记的抗兔抗体作为免疫层析试纸用结合物，并将兔IgG抗体包被在质控线上，以作为独立的质控体系，是本领域常用的技术手段。
对于区别技术特征3），包被抗体的稀释液、干燥箱为真空干燥箱、硝酸纤维素膜的干燥时间、检测线和质控线的位置属于本领域技术人员的常规选择。
因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2和本领域公知常识得到该权利要求所要求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，该权利要求不具有突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（6）权利要求8是权利要求7的从属权利要求。对于本领域技术人员来说，柠檬酸盐或蔗糖稀释液中柠檬酸盐或蔗糖的浓度是本领域技术人员根据需要能够选择和调整的。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，该从属权利要求也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、对复审请求人相关意见的答复
针对复审请求人的上述意见陈述，合议组认为：
（1）对于区别技术特征1），部分被对比文件2公开且给出相结合的启示，其他部分属于本领域的常规选择。区别技术特征2）属于本领域的常用技术手段，或者属于本领域技术人员容易想到的内容。具体可参见对权利要求1的评述。区别技术特征3）属于本领域的常规选择。
（2）对比文件1已经公开了稀土荧光微球掺杂有稀土镧系元素，为铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等镧系元素的任意一种或几种的混合物，稀土荧光微球优选掺杂稀土络合物（参见说明书第【0008】段）。对比文件1中稀土荧光微球掺杂稀土络合物，相当于本申请中的时间分辨荧光微球内部填充镧系元素的络合物。本申请的权利要求和说明书中均未记载荧光染料包埋在微球内部，因此，由本申请权利要求和说明书记载的内容不能直接毫无疑义地得出荧光微球具有填充饱满牢固的技术效果。螯合物属于络合物的一种。在对比文件1公开的内容的基础上，选择镧系元素螯合物制备稀土荧光微球，属于本领域的常规选择。由于对比文件1与本申请的时间分辨荧光微球中采用的镧系元素均为Eu3 ，同样可以实现减少干扰的技术效果。
（3）本申请说明书中记载的时间分辨荧光微球的粒径为100~500nm。即时间分辨荧光微球的粒径在100~500nm范围内均能解决本申请所要求解决的技术问题，并达到相同的技术效果。虽然请求人补充实验数据证明粒径为200nm时，具有有益的技术效果，但并不能表明其他粒径的微球的技术方案无法实现。对比文件1公开了荧光微球的粒径为50-120nm。对于本领域技术人员来说，抗体是标记在微球表面的，因此，粒径大小可能对样品与抗体的结合效果、后续处理均产生影响，基于该特征所获得的技术效果并不属于预料不到的技术效果。本领域技术人员根据实际需要，有动机改进粒径的尺寸，具体选择粒径为200nm属于本领域的常规选择。
（4）本申请采用时间分辨荧光免疫层析法检测H-FABP的含量，对比文件1公开的也是荧光免疫层析法测定H-FABP的含量。对比文件2公开的时间分辨荧光免疫层析法测定食品中β-受体激动剂试剂。由此可见，本申请与对比文件1、对比文件2基于同样的检测原理对待测物质的含量进行检测。虽然对比文件2与本申请、对比文件1检测的物质不同，但对于本领域技术人员来说，时间分辨荧光免疫层析法可以适用于多种抗原物质的检测。对比文件2中的试条上不具有结合垫，荧光微球设置在试条外，先将待测样本与时间分辨荧光微球反应，再添加到试纸条上层析，能够确保检测样本与标记物的充分反应。本领域技术人员为了确保检测样本与标记物的充分反应，提高检测精度，有动机将对比文件2公开的内容结合到对比文件1中，改进对比文件1的技术方案。即，对比文件1和对比文件2具有结合启示。
本申请的分类号为G01N33/68，对比文件1的分类号为G01N33/577、G01N33/558，对比文件2的分类号为G01R33/02、G01N21/64、G01N33/558、G01N33/577。由此可见，对比文件1与对比文件2具有相同的分类号G01N33/577、G01N33/558，与本申请同处于G01N33/50这一小组下，同属于生物物质的化学分析领域，技术领域相同。
（5）对比文件1公开的待测样本为血清或全血，待测样本直接加入样本孔中，并未进行预处理（参见说明书第【0024】段）。对比文件2公开的试条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，而不包括结合垫。对比文件2还公开了（参见说明书第【0010】段）免疫层析时，先将被测样品加入微孔容器内，把附着在容器壁上的标记荧光乳胶颗粒溶出，充分混合，同时如被检测样本含有相应的抗原与荧光乳胶颗粒上的抗体结合发生免疫反应形成复合物，此反应液再滴加到试条的样品垫上进行免疫层析。由此可见，对比文件2中的待测样品也无需预处理。由此可见，对比文件2已经公开了样品垫与结合垫合二为一的技术方案，摒弃了传统的样品垫及结合物释放垫，荧光微球设置在试条外，无需对样品进行预处理，给出了先将样本与荧光微球反应，再添加到试条上层析以确保检测样本与标记物的充分反应的技术启示，解决了荧光微球释放问题，从而获得提高检测精度的技术效果。且本申请所达到的技术效果是本领域技术人员可以预期的，并不属于预料不到的技术效果。
（6）对比文件2公开的试条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，而不包括结合垫。Whatman Fusion5（单层基质）是本领域广泛使用的商用试纸材料，广泛用于诊断试纸条，使用单一材料能够实现侧向流试纸条所有功能，简化成本。本领域技术人员能够根据实际需要选择使用。
因此，对于复审请求人在意见陈述中强调的本申请具备创造性的理由合议组不予支持。
基于上述事实和理由，合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年06月04日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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