发明创造名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒及其制备方法
外观设计名称：
决定号：190306
决定日：2019-09-17
委内编号：1F260329
优先权日：
申请（专利）号：201610592430.6
申请日：2016-07-26
复审请求人：石家庄久正生物科技有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：姚宇鹯
合议组组长：徐恩波
参审员：穆飞鹏
国际分类号：G01N33/569,G01N33/535
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求请求保护的技术方案与作为最接近的现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，部分区别技术特征是本领域技术人员在其他对比文件给出的技术启示下结合本领域公知常识所容易想到的内容，其余区别技术特征是本领域的公知常识，那么权利要求请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610592430.6、名称为“猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒及其制备方法”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请日为2016年07月26日，公开日为2016年11月09日，申请人为石家庄久正生物科技有限公司。
国家知识产权局专利实质审查部门以本申请权利要求1不符合专利法第22条第3款规定的创造性为由，于2018年05月28日驳回了本申请，并在驳回决定的其他说明部分指出本申请权利要求2-4不符合专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定引用的对比文件：
对比文件1：CN102353778A，公开日为2012年02月15日；
对比文件2：CN204882568U，公告日为2015年12月16日；
对比文件3：CN101315368A，公开日为2008年12月03日。
驳回决定所针对的文本为：申请日2016年07月26日提交的说明书第1-15页、说明书摘要，2018年03月16日提交的权利要求第1-4项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
(1)抗原包被酶标板：抗原包被酶标板上的微孔内，每孔包被有0.18～0.32μg基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原；
(2)样品稀释液：每100ml样品稀释液包括氯化钠3.1～3.9g，牛血清白蛋白0.7～1.3g，酪蛋白钠0.18～0.30g，硫柳汞钠0.02～0.04g，溴甲酚绿0.001～0.002g，其余为去离子水；
(3)酶工作液：每100ml酶工作液包括山羊血清8～16ml，氨基比林0.3～0.6g，硫柳汞钠0.01～0.02g，吐温-20 0.03～0.06ml，牛血清白蛋白0.2～0.7g，辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG25～45ul，其余为0.01M、pH为7.2-7.5的PBS缓冲溶液；
(4)显色剂A液：每100ml显色剂A液包括醋酸钠2.1～3.2g，柠檬酸0.28～0.36g，30％双氧水0.04～0.08ml，其余为去离子水；
(5)显色剂B液：每100ml显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.03～0.06g，柠檬酸0.16～0.23g，甘油8～14ml，四甲基联苯胺0.03～0.06g，其余为去离子水；
(6)终止液：每100ml终止液包括浓硫酸10～20ml，其余为去离子水；
(7)20倍浓缩洗液：每100ml20倍浓缩洗液包括磷酸氢二钠2.6～3.2g，磷酸二氢钠0.2～0.4g，氯化钠18.5～25.5g，吐温-20 1.8～2.4ml，其余为去离子水；
(8)阳性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的猪血清；
(9)阴性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的猪血清；
所述抗原包被酶标板的制备中，使用封闭液用于封闭基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，每100ml封闭液包括以下组分：磷酸氢二钠0.45～0.58g，磷酸二氢钠0.06～0.10g，牛血清白蛋白1.0～2.0g，蔗糖1.8～2.4g，小牛血清 10～20ml，其余为去离子水。
2. 根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液、酶工作液、阳性对照和阴性对照均经滤膜过滤除菌得到。
3. 一种如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)、抗原包被酶标板的制备：
(1)、配制包被液：用0.05M、pH9.4～9.8的碳酸盐缓冲液将浓度为1.8～3.2mg/ml的基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原溶液稀释1000倍，搅拌混匀，得到包被液；
(2)、包板、洗板：将包被液按100μL/孔的量加入到酶标板的微孔中，于2～8℃下放置18～24小时，然后取出酶标板，用PBST洗液洗板至少3次，再在吸水纸上拍干；
(3)、封闭、拍板：将封闭液按150μL/孔的量加入到经步骤(2)处理后的酶标板的微孔中，于2～8℃下放置18～24小时，然后取出，吸走液体，再用吸水纸拍干；所述封闭液每100ml包括以下组分：磷酸氢二钠0.45～0.58g，磷酸二氢钠0.06～0.10g，牛血清白蛋白1.0～2.0g，蔗糖1.8～2.4g，小牛血清10～20ml，其余为去离子水；
(4)、干燥、封装：将步骤(3)处理后的酶标板置于温度不高于28℃、相对湿度不高于20％的环境下，干燥18～24小时，最后将干燥好的酶标板装入铝箔袋封装；
(二)、样品稀释液、酶工作液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、20倍浓缩洗液的配制：按物质配比分别配制各组分溶液，所述样品稀释液、酶工作液均经0.22μm滤膜过滤除菌得到，所述显色剂B液在避光条件下搅拌混匀得到；
(三)、阳性对照、阴性对照的配制：
(1)、阳性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌得到；
(2)阴性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌得到。
4. 根据权利要求3所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，所述酶工作液的配制按如下步骤进行：
依次取山羊血清8～16mL，氨基比林0.3～0.6g，硫柳汞钠0.01～0.02g，吐温-20 0.03～0.06ml，牛血清白蛋白0.2～0.7g，混合，加入0.01M、pH7.2-7.5的PBS溶液至100mL，充分搅拌混匀，然后加入辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG25～45μL，再充分搅拌混匀，最后经0.22μm滤膜过滤除菌得到酶工作液。”
驳回决定具体指出：1、独立权利要求1请求保护一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒。对比文件1公开了一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒，权利要求1的技术方案与对比文件1相比，区别技术特征在于：1）还包括抗原包被酶标板及其上抗原包被量；2）样品稀释液、酶工作液、显色剂A与B以及终止液的组成；3）洗液为浓缩型的，其中不含KCl，且各组分含量不同；4）阳性对照和阴性对照均是猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的；5）封闭液中还含有蔗糖、小牛血清以及其中各组分含量，其中的磷酸盐为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。针对区别技术特征1），对比文件2公开了在ELISA检测过程中在样品稀释液、酶标记物等试剂中加入合适的指示剂以避免加样时如漏加、多加、误加等错误的发生，对比文件3公开了溴甲酚绿可以作为ELISA检测试剂如酶标记物等中的指示剂而不会影响检测结果，其余区别技术特征是本领域技术人员的惯用技术手段；区别技术特征2）-5）是本领域技术人员的惯用技术手段。因此，权利要求1相对于对比文件1-3和公知常识的结合不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。2、在其他说明中对权利要求2-4的创造性进行了评述，具体为，从属权利要求2的部分附加技术特征被对比文件1公开，其余部分附加技术特征是本领域技术人员的惯用技术手段，因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求2也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。独立权利要求3请求保护一种如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的制备方法，对比文件1公开了一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒的制备方法，权利要求3的技术方案与对比文件1相比，区别技术特征还在于：1）抗原包被酶标板的制备中相关条件与参数，如包被缓冲液浓度、抗原稀释倍数、包被液与封闭液的用量、封闭步骤以及封闭液用量、干燥与封装步骤、吸水纸拍干操作等；2）样品稀释液、酶工作液、显色剂B液、阳性对照与阴性对照的配制。而上述区别技术特征是本领域技术人员的惯用技术手段，因此，权利要求3相对于对比文件1-3和公知常识的结合不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。从属权利要求4的部分附加技术特征被对比文件1、2公开，其余部分附加技术特征是本领域技术人员的惯用技术手段，因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求4也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年09月07日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件，陈述了权利要求1-4具备创造性的理由，复审请求人认为：权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）发明目的不同，检测时直接将样品稀释液和待测样品加入酶标板微孔内，省去对样品的预稀释步骤，提高试剂盒检测的准确性，减少预稀释过程中人为误差的产生；（2）指示剂显色和变色原理不同，为了防止加入样品稀释液和待测样品出现漏加或重复加入，在样品稀释液组成中增加了指示剂溴甲酚绿，对比文件2并没有公开采用何种指示剂，对比文件3使用的是指示剂的显色标识作用，对比文件2-3并没有公开采用指示剂的变色原理实现两步加液的标识的技术启示；（3）样品稀释液的成分不同，本申请的样品稀释液的组分可使得待检样品与包被在酶标板中的抗原更准确的发生特异性免疫反应，能够阻断待测样品中其他抗体与酶标板微孔中的固相抗原发生非特异性结合，能够提高反应的特异性。（4）封闭液成分不同，本申请中用的封闭液的组分构成，是因为封闭液能够影响酶标板的稳定性及免疫反应的灵敏度，而本申请的封闭液通过牛血清白蛋白及蔗糖等组分的结合，可使得包被在酶标板微孔中的抗原结构不会发生显著变化，以保持最佳的抗原性，从而有利于捕获抗体并发生抗原抗体的特异性结合，提高试剂盒的灵敏度，能够使酶标板稳定不容易变质，可使其长时间保持良好性能。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年09月18日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局依法成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年07月09日向复审请求人发出复审通知书，指出：1、独立权利要求1请求保护一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒。对比文件1公开了一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒，权利要求1的技术方案与对比文件1相比，区别技术特征在于：A、（1）抗原包被酶标板：抗原包被酶标板上的微孔内，每孔包被有0.18～0.32μg病毒抗原；（2）每100ml样品稀释液包括氯化钠3.1～3.9g，牛血清白蛋白0.7～1.3g，酪蛋白钠0.18～0.30g，硫柳汞钠0.02～0.04g，溴甲酚绿0.001～0.002g；（6）每100ml终止液包括浓硫酸10～20ml，其余为去离子水；（7）20倍浓缩洗液：每100ml20倍浓缩洗液包括磷酸氢二钠2.6～3.2g，磷酸二氢钠0.2～0.4g，氯化钠18.5～25.5g，吐温-20 1.8～2.4ml；B、（3）酶工作液：每100ml酶工作液包括山羊血清8～16ml，氨基比林0.3～0.6g，硫柳汞钠0.01～0.02g，牛血清白蛋白0.2～0.7g，辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG25～45ul，其余为0.01M、pH为7.2-7.5的PBS缓冲溶液；（4）每100ml显色剂A液包括醋酸钠2.1～3.2g，柠檬酸0.28～0.36g，30％双氧水0.04～0.08ml；（5）每100ml显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.03～0.06g，柠檬酸0.16～0.23g，甘油8～14ml，四甲基联苯胺0.03～0.06g；（8）阳性对照：猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的猪血清；（9）阴性对照：猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的猪血清； 抗原包被酶标板的制备中，每100ml封闭液包括以下组分：磷酸氢二钠0.45～0.58g，磷酸二氢钠0.06～0.10g，牛血清白蛋白1.0～2.0g，蔗糖1.8～2.4g，小牛血清 10～20ml。针对区别技术特征A，在对比文件2中公开了猪O型口蹄疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒，抗原包被反应板、病毒抗体阳性对照血清、病毒抗体阴性对照血清、样本稀释液、20×浓缩洗涤液、酶标记物、显色剂和终止液，并且给出了采用指示剂使得容易区分已加样品与未加样品而防止差错发生的技术启示，对比文件3公开了在ELISA试剂盒中，使用指示剂I：甲基橙、甲基红、苯酚红、溴甲酚绿、溴百里香酚兰、茶酚绿、酸性铬兰K或亚甲基兰，并且给出了采用溴甲酚绿防止试剂添加时发生差错的技术启示，而其余区别技术特征A是本领域技术人员的惯用技术手段；针对区别技术特征B，区别技术特征B中的各个溶液和对照品的组分是本领域技术人员在ELISA诊断试剂盒设计时的惯用技术手段。因此，权利要求1相对于对比文件1-3和公知常识的结合不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。2、从属权利要求2的附加技术特征是本领域技术人员的惯用技术手段，因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求2也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。3、权利要求3请求保护一种如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的制备方法，权利要求1不具备创造性，同时，对比文件1公开了一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒的制备方法，权利要求3所要求保护的技术方案与对比文件1的区别技术特征还在于：（1）、用0.05M的缓冲液将浓度为1.8～3.2mg/ml的基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原溶液稀释1000倍，搅拌混匀，得到包被液；（2）、包板、洗板：将包被液按100μL/孔的量加入到酶标板的微孔中，于2～8℃下放置18～24小时，然后取出酶标板，用PBST洗液洗板至少3次，再在吸水纸上拍干；（3）、封闭、拍板：将封闭液按150μL/孔的量加入到经步骤（2）处理后的酶标板的微孔中，于2～8℃下放置18～24小时，然后取出，吸走液体，再用吸水纸拍干；所述封闭液每100ml包括以下组分：磷酸氢二钠0.45～0.58g，磷酸二氢钠0.06～0.10g，牛血清白蛋白1.0～2.0g，蔗糖1.8～2.4g，小牛血清10～20ml，其余为去离子水；（4）、干燥、封装：将步骤（3）处理后的酶标板置于温度不高于28℃、相对湿度不高于20％的环境下，干燥18～24小时，最后将干燥好的酶标板装入铝箔袋封装；（二）20倍浓缩洗液的配制，样品稀释液、酶工作液均经0.22μm滤膜过滤除菌得到，所述显色剂B液在避光条件下搅拌混匀得到；（三）（1）、阳性对照：猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌得到；（2）阴性对照：猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌得到。而对比文件2公开了：抗原包被反应板的制备方法，其余区别技术特征是本领域技术人员的惯用技术手段，因此，权利要求3相对于对比文件1-3和公知常识的结合不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。4、从属权利要求4的附加技术特征是本领域技术人员的惯用技术手段，因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求4也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。5、针对复审请求人的意见进行了答复。
针对上述复审通知书，复审请求人于2019年08月16日提交了意见陈述书和权利要求书的全文修改替换页。修改主要涉及：将权利要求1和权利要求2合为新的权利要求1，将权利要求3和权利要求4合并为新的权利要求2。修改后的权利要求书如下：
“1. 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
(1)抗原包被酶标板：抗原包被酶标板上的微孔内，每孔包被有0.18～0.32μg基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原；
所述抗原包被酶标板的制备中，使用封闭液用于封闭基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，每100ml封闭液包括以下组分：磷酸氢二钠0.45～0.58g，磷酸二氢钠0.06～0.10g，牛血清白蛋白1.0～2.0g，蔗糖1.8～2.4g，小牛血清10～20ml，其余为去离子水；
(2)样品稀释液：每100ml样品稀释液包括氯化钠3.1～3.9g，牛血清白蛋白0.7～1.3g，酪蛋白钠0.18～0.30g，硫柳汞钠0.02～0.04g，溴甲酚绿0.001～0.002g，其余为去离子水；
(3)酶工作液：每100ml酶工作液包括山羊血清8～16ml，氨基比林0.3～0.6g，硫柳汞钠0.01～0.02g，吐温-200.03～0.06ml，牛血清白蛋白0.2～0.7g，辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG25～45ul，其余为0.01M、pH为7.2-7.5的PBS缓冲溶液；
(4)显色剂A液：每100ml显色剂A液包括醋酸钠2.1～3.2g，柠檬酸0.28～0.36g，30％双氧水0.04～0.08ml，其余为去离子水；
(5)显色剂B液：每100ml显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.03～0.06g，柠檬酸0.16～0.23g，甘油8～14ml，四甲基联苯胺0.03～0.06g，其余为去离子水；
(6)终止液：每100ml终止液包括浓硫酸10～20ml，其余为去离子水；
(7)20倍浓缩洗液：每100ml20倍浓缩洗液包括磷酸氢二钠2.6～3.2g，磷酸二氢钠0.2～0.4g，氯化钠18.5～25.5g，吐温-201.8～2.4ml，其余为去离子水；
(8)阳性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的猪血清；
(9)阴性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的猪血清；
所述样品稀释液、酶工作液、阳性对照和阴性对照均经滤膜过滤除菌得到。
2. 一种如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)、抗原包被酶标板的制备：
(1)、配制包被液：用0.05M、pH9.4～9.8的碳酸盐缓冲液将浓度为1.8～3.2mg/ml的基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原溶液稀释1000倍，搅拌混匀，得到包被液；
(2)、包板、洗板：将包被液按100μL/孔的量加入到酶标板的微孔中，于2～8℃下放置 18～24小时，然后取出酶标板，用PBST洗液洗板至少3次，再在吸水纸上拍干；
(3)、封闭、拍板：将封闭液按150μL/孔的量加入到经步骤(2)处理后的酶标板的微孔中，于2～8℃下放置18～24小时，然后取出，吸走液体，再用吸水纸拍干；所述封闭液每100ml包括以下组分：磷酸氢二钠0.45～0.58g，磷酸二氢钠0.06～0.10g，牛血清白蛋白1.0～2.0g，蔗糖1.8～2.4g，小牛血清10～20ml，其余为去离子水；
(4)、干燥、封装：将步骤(3)处理后的酶标板置于温度不高于28℃、相对湿度不高于20％的环境下，干燥18～24小时，最后将干燥好的酶标板装入铝箔袋封装；
(二)、样品稀释液、酶工作液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、20倍浓缩洗液的配制：按物质配比分别配制各组分溶液，所述样品稀释液、酶工作液均经0.22μm滤膜过滤除菌得到，所述显色剂B液在避光条件下搅拌混匀得到；
(三)、阳性对照、阴性对照的配制：
(1)、阳性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌得到；
(2)阴性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌得到；
所述酶工作液的配制按如下步骤进行：
依次取山羊血清8～16mL，氨基比林0.3～0.6g，硫柳汞钠0.01～0.02g，吐温-200.03～0.06ml，牛血清白蛋白0.2～0.7g，混合，加入0.01M、pH7.2-7.5的PBS溶液至100mL，充分搅拌混匀，然后加入辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG25～45μL，再充分搅拌混匀，最后经0.22μm滤膜过滤除菌得到酶工作液。”
复审请求人在意见陈述书中陈述了本申请权利要求具备创造性的理由。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）、审查文本的认定
复审请求人在2019年08月16日答复复审通知书时提交了权利要求书的全文修改替换页，经审查，所作修改符合专利法第33条的规定。本复审请求审查决定所依据的审查文本为：2019年08月16日提交的权利要求第1-2项，申请日2016年07月26日提交的说明书第1-15页、说明书摘要。
（二）、专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果权利要求请求保护的技术方案与作为最接近的现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，部分区别技术特征是本领域技术人员在其他对比文件给出的技术启示下结合本领域公知常识所容易想到的内容，其余区别技术特征是本领域的公知常识，那么权利要求请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，该权利要求不具备创造性。
具体到本案：
1.权利要求1请求保护一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒。对比文件1公开了一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒，并具体公开了下列技术特征（参见说明书第[0005]-[0017]段）：该试剂盒包括以下组分：
（1）、抗原包被：融合蛋白His-dGP5作为包被抗原；
（2）、样品稀释液：PBST溶液包括NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、Tween-20 0.5mL（相当于吐温-20 0.03～0.06ml）溶于800mL蒸馏水，定容至1000mL；
（3）酶工作液：羊抗猪IgG-HRP即辣根过氧化物酶标记羊抗猪，用PBST做1:2000倍稀释，酶标二抗稀释浓度1:2000；
（4）底物液A：Na2HPO4 14.60g、柠檬酸 9.33 g、过氧化氢脲 0.52 g，溶于三蒸水；
（5）底物液B：TMB 20mg（四甲基联苯胺）、无水乙醇10 mL，加双蒸水至1 000 mL；
（6）终止液：0.25% HF溶液；
（7）洗液：PBST包括NaCl 8.0g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、Tween-20 0.5mL溶于800mL蒸馏水，调整pH为7.4，定容至1000mL；
（8）阳性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性的猪血清；
（9）阴性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性的猪血清；
使用封闭液用于封闭基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，封闭液包括以下组分，封闭缓冲液：BSA0.3g溶于10mL PBST缓冲液。
由此可见，权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1的区别技术特征在于：
A、（1）抗原包被酶标板：抗原包被酶标板上的微孔内，每孔包被有0.18～0.32μg病毒抗原；
（2）每100ml样品稀释液包括氯化钠3.1～3.9g，牛血清白蛋白0.7～1.3g，酪蛋白钠0.18～0.30g，硫柳汞钠0.02～0.04g，溴甲酚绿0.001～0.002g；
（6）每100ml终止液包括浓硫酸10～20ml，其余为去离子水；
（7）20倍浓缩洗液：每100ml20倍浓缩洗液包括磷酸氢二钠2.6～3.2g，磷酸二氢钠0.2～0.4g，氯化钠18.5～25.5g，吐温-20 1.8～2.4ml；
B、（3）酶工作液：每100ml酶工作液包括山羊血清8～16ml，氨基比林0.3～0.6g，硫柳汞钠0.01～0.02g，牛血清白蛋白0.2～0.7g，辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG25～45ul，其余为0.01M、pH为7.2-7.5的PBS缓冲溶液；
（4）每100ml显色剂A液包括醋酸钠2.1～3.2g，柠檬酸0.28～0.36g，30％双氧水0.04～0.08ml；
（5）每100ml显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.03～0.06g，柠檬酸0.16～0.23g，甘油8～14ml，四甲基联苯胺0.03～0.06g；
（8）阳性对照：猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的猪血清；
（9）阴性对照：猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的猪血清；
抗原包被酶标板的制备中，每100ml封闭液包括以下组分：磷酸氢二钠0.45～0.58g，磷酸二氢钠0.06～0.10g，牛血清白蛋白1.0～2.0g，蔗糖1.8～2.4g，小牛血清 10～20ml。所述样品稀释液、酶工作液、阳性对照和阴性对照均经滤膜过滤除菌得到。
基于上述区别技术特征可以确定，权利要求1相对于对比文件1要解决的技术问题是：A、容易区分已加样品与未加样品，减少人为操作差错，提高试剂盒的特异性及灵敏度，B、显色反应迅速、颜色反差明显，提高稳定性和均一性。
针对区别技术特征A，在对比文件2中公开了猪O型口蹄疫病毒抗体的ELISA检测试剂盒（参见说明书第[0015]-[0041]段）：抗原包被反应板（相当于抗原包被酶标板）、病毒抗体阳性对照血清、病毒抗体阴性对照血清、样本稀释液、20×浓缩洗涤液、酶标记物、显色剂和终止液，
样本稀释液：将1000ml纯化水中加入2.8g磷酸二氢钾、118g氯化钠、1ml吐温-20、0.2g硫柳汞钠，加入5ml指示剂，定容至1000ml并调节pH值为5～6，将待检样本血清用样本稀释液稀释40倍，即190ul样本稀释液中加入10ul待检样本血清（加入后样本稀释液颜色有变化）。
酶标记物（相当于酶工作液）：将0.6gTris、2.2g氯化钠、0.4ml浓盐酸、0.125g吐温-20、0.1g氨基比林、0.5ml Proclin300、2ml红色染色剂加入到纯化水中，最终定容至1000ml并调节pH为7.0~7.4，加入100ul羊抗猪酶标记物；按22ml/瓶分装。
终止液：将500ml98%浓硫酸加入4.5L纯化水中（相当于每100ml终止液包括浓硫酸10～20ml，其余为去离子水），配成2mol/L的硫酸终止液；按12ml/瓶分装。
20×浓缩洗涤液：将1000ml纯化水中加入4g磷酸二氢钾、60g磷酸氢二钠、10ml吐温-20、160g氯化钠、4g氯化钾，调节pH值为7.0～7.4，定容至1000ml；按50ml/瓶分装。并且该特征在对比文件2中所起的作用与其在权利要求1中为解决其技术问题所起的作用相同，都是采用指示剂使得容易区分已加样品与未加样品而防止差错发生，因此本领域技术人员可以将指示剂应用到对比文件1中以区分已加样品与未加样品，但对比文件2并没有公开具体的指示剂成分，而对比文件3公开了（参见说明书第1-4页）：在ELISA试剂盒中，使用指示剂I：甲基橙、甲基红、苯酚红、溴甲酚绿、溴百里香酚兰、茶酚绿、酸性铬兰K或亚甲基兰，并且作用相同：采用溴甲酚绿防止试剂添加时发生差错，因此，根据对比文件2-3的启示，本领域技术人员容易想到将溴甲酚绿应用到对比文件1中以使得容易区分已加样品与未加样品而防止差错发生，但对比文件2-3均没有公开：每孔包被有0.18～0.32μg病毒抗原；每100ml样品稀释液包括氯化钠3.1～3.9g，牛血清白蛋白0.7～1.3g，酪蛋白钠0.18～0.30g，硫柳汞钠0.02～0.04g，溴甲酚绿0.001～0.002g；每100ml20倍浓缩洗液包括磷酸氢二钠2.6～3.2g，磷酸二氢钠0.2～0.4g，氯化钠18.5～25.5g，吐温-20 1.8～2.4ml，而上述组分及其含量是本领域技术人员在ELISA诊断试剂盒设计时的惯用技术手段。
针对区别技术特征B，对比文件1公开了：酶工作液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、阳性对照、阴性对照、封闭液，而为了显色反应迅速、颜色反差明显，提高稳定性和均一性，具体选择区别技术特征B中的各个溶液和对照品的组分并进行试剂的滤膜过滤除菌是本领域技术人员在ELISA诊断试剂盒设计时的惯用技术手段。
由此可见，在对比文件1的基础上结合对比文件2-3和本领域技术人员的惯用技术手段得到该权利要求请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，该权利要求不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2. 权利要求2请求保护一种如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的制备方法，权利要求1不具备创造性，同时，对比文件1公开了一种基于PRRSV GP5蛋白的iELISA试剂盒的制备方法，并具体公开了下列特征（参见说明书第[0005]-[0017]段）：（一）、配制包被缓冲液：Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g溶于去离子水中，定容至1000mL，调至 p H9.6；封闭，封闭时间1h；
(二)、样品稀释液、酶工作液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗液的配制：按物质配比分别配制各组分溶液；
(三)、阳性对照、阴性对照的配制：
(1)、阳性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性；
(2)、阴性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性；
权利要求2所要求保护的技术方案与对比文件1的区别技术特征还在于：
（1）、用0.05M的缓冲液将浓度为1.8～3.2mg/ml的基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原溶液稀释1000倍，搅拌混匀，得到包被液；
（2）、包板、洗板：将包被液按100μL/孔的量加入到酶标板的微孔中，于2～8℃下放置18～24小时，然后取出酶标板，用PBST洗液洗板至少3次，再在吸水纸上拍干；
（3）、封闭、拍板：将封闭液按150μL/孔的量加入到经步骤(2)处理后的酶标板的微孔中，于2～8℃下放置18～24小时，然后取出，吸走液体，再用吸水纸拍干；所述封闭液每100ml包括以下组分：磷酸氢二钠0.45～0.58g，磷酸二氢钠0.06～0.10g，牛血清白蛋白1.0～2.0g，蔗糖1.8～2.4g，小牛血清10～20ml，其余为去离子水；
（4）、干燥、封装：将步骤（3）处理后的酶标板置于温度不高于28℃、相对湿度不高于20％的环境下，干燥18～24小时，最后将干燥好的酶标板装入铝箔袋封装；
（二）20倍浓缩洗液的配制，样品稀释液、酶工作液均经0.22μm滤膜过滤除菌得到，所述显色剂B液在避光条件下搅拌混匀得到；
（三）（1）、阳性对照：猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌得到；（2）阴性对照：猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌得到。
酶工作液的配制按如下步骤进行：
依次取山羊血清8～16mL，氨基比林0.3～0.6g，硫柳汞钠0.01～0.02g，吐温-200.03～0.06ml，牛血清白蛋白0.2～0.7g，混合，加入0.01M、pH7.2-7.5的PBS溶液至100mL，充分搅拌混匀，然后加入辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG25～45μL，再充分搅拌混匀，最后经0.22μm滤膜过滤除菌得到酶工作液。
针对上述区别技术特征，对比文件2公开了：抗原包被反应板的制备：制备抗原包被液，混合均匀后加入96孔酶标板内，100ul/孔。放置2～8℃过夜后，甩掉孔内液体，以洗涤液洗涤1次，洗涤液为20×浓缩洗涤液以纯化水稀释为1×洗涤液。甩干后，加入封闭液，封闭液含5‰~10‰的鱼明胶溶液，以150ul/孔加入，放置37℃恒温箱中封闭2小时。取出，甩去孔内液体，干燥（参见说明书第[0017]段）。并且作用相同：都是如何制备抗原包被反应板，而具体采用权利要求2中的方法制备抗原包被反应板是本领域技术人员的惯用技术手段，对比文件1公开了样品稀释液、酶工作液，而选择将区别技术特征中步骤（二）的溶液通过滤膜过滤除菌得到是本领域技术人员的惯用技术手段，显色剂B液在避光条件下搅拌混匀得到是本领域技术人员的惯用技术手段。对比文件1公开了阳性对照和阴性对照，而具体选择步骤（三）中的对照品的制备方法是本领域技术人员的惯用技术手段，对比文件1公开了酶工作液的制备方法，而选择附加技术特征的制备方法是本领域技术人员的惯用技术手段。综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件2-3和本领域技术人员的惯用技术手段得到该权利要求请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，该权利要求不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）、针对复审请求人的意见进行答复
复审请求人认为：权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）样品稀释液、酶工作液、显色剂、终止液等的浓度是按照实际使用要求设置的，因此试剂盒的创造性必须综合考虑试剂盒的使用效果，同时应考虑试剂盒的设计原理和使用方法。检测时直接将样品稀释液和待测样品加入酶标板微孔内，省去对样品的预稀释步骤，提高试剂盒检测的准确性，减少预稀释过程中人为误差的产生；（2）指示剂显色和变色原理不同，为了防止加入样品稀释液和待测样品出现漏加或重复加入，在样品稀释液组成中增加了指示剂溴甲酚绿，对比文件2并没有公开采用何种指示剂，对比文件3使用的是指示剂的显色标识作用，对比文件2-3并没有公开采用指示剂的变色原理实现两步加液的标识的技术启示；（3）样品稀释液的成分不同，本申请的样品稀释液的组分可使得待检样品与包被在酶标板中的抗原更准确的发生特异性免疫反应，能够阻断待测样品中其他抗体与酶标板微孔中的固相抗原发生非特异性结合，能够提高反应的特异性。封闭液成分不同，封闭液能够影响酶标板的稳定性及免疫反应的灵敏度，而本申请的封闭液通过牛血清白蛋白及蔗糖等组分的结合，可使得包被在酶标板微孔中的抗原结构不会发生显著变化，以保持最佳的抗原性，从而有利于捕获抗体并发生抗原抗体的特异性结合，提高试剂盒的灵敏度，保护膜能够使酶标板稳定不容易变质，可使其长时间保持良好性能。
合议组认为：（1）、首先，对比文件1和本申请均涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒及其制备方法，其检测原理相同，而按照实验要求对样品稀释液、酶工作液、显色剂、终止液等的浓度进行设置，这是本领域技术人员公知的，因此，为了保证灵敏性、特异性、稳定性前提下，对试剂的浓度进行调整这是本领域技术人员容易想到的，并不需要克服任何技术困难和偏见。其次，权利要求1-2分别限定的是试剂盒及其制造方法，并没有对检测方法进行限定，即并没有对直接将样品稀释液和待测样品加入酶标板微孔内的检测步骤进行相应记载，因此上述步骤不能作为权利要求1-2具备创造性的理由；再次，权利要求1请求保护的是试剂盒，试剂盒在检测中的操作方法对试剂盒组分并没有限定作用，即样品稀释液、待测样品的加入顺序对于试剂盒的组分并没有限定作用，其不能作为权利要求1具备创造性的理由。
（2）、对比文件2公开了利用指示剂的颜色变化来区分样本与稀释液是否混合，给出了在试剂盒组分中增加指示剂以防止试剂出现漏加或重复加入从而减少人为差错，虽然没有给出具体的指示剂成分，但是本领域技术人员有动机在本领域中寻找合适的指示剂，对比文件3中公开了指示剂溴甲酚绿，而溴甲酚绿是公知的随着pH值的变化而变色的酸碱指示剂，并且样品稀释液加入到酶标板、然后加入样本混合前后pH会有变化，这是本领域技术人员熟知的，当采用溴甲酚绿时，其颜色随着pH的变化而变色以显示不同的标识这是本领域技术人员根据对比文件2-3的启示容易想到的。
（3）首先，在ELISA试剂盒设计时，保证抗原更准确的发生特异性免疫反应是本领域常见的，因此，在样品稀释液的成分的选择时，本领域技术人员有动机选择本领域熟知的样品稀释液成分，并对其配比进行调整以保证抗原更准确的发生特异性免疫反应，这是本领域技术人员容易想到的，同时本申请中并没有针对样品稀释液的不同组分进行对比实施例的记载，以说明其组分的配比带来何种预料不到的技术效果。其次，在抗原包被酶标板制造时，封闭液的使用需要保证酶标板的稳定性及免疫反应的灵敏度，这是本领域技术人员熟知的，而牛血清白蛋白及蔗糖的等组分是在ELISA试剂盒的抗原包被酶标板设计时的常用试剂组分，本领域技术人员有动机在现有的封闭液组分中进行选择，其达到的技术效果也是本领域技术人员可以预见的，同时本申请中并没有针对封闭液的不同组分的选择进行对比实施例的记载，也没有记载使用本领域常用的牛血清白蛋白及蔗糖相对于现有技术中其他常用的封闭液组分对试剂盒带来了何种预料不到的技术效果。
综上，复审请求人的意见陈述不能接受。
根据上述事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年05月28日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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