发明创造名称：一种车前子药材与其配方颗粒中四种成分的含量测定方法
外观设计名称：
决定号：189750
决定日：2019-09-10
委内编号：1F278173
优先权日：
申请（专利）号：201611112346.6
申请日：2016-11-30
复审请求人：河北中医学院
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：孙春梅
合议组组长：边昕
参审员：陈永晖
国际分类号：G01N30/02
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：??如果权利要求与最接近的现有技术之间存在区别技术特征，该区别技术特征未被其他现有技术公开，并且没有证据证明该区别技术特征是本技术领域的公知常识，则该权利要求相对于上述现有技术具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201611112346.6，名称为“一种车前子药材与其配方颗粒中四种成分的含量测定方法”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请日为2016年11月30日，公开日为2017年05月10日，申请人为河北中医学院。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2019年02月15日以本申请权利要求1-2不符合专利法第22条第3款的规定为由，驳回了本申请。驳回决定引用如下1篇对比文件：
对比文件1：“车前子的高效液相指纹图谱研究”，曾金祥等，《时珍国医国药》，第22卷第2期，第329-331页，公开日期：2011年02月28日。
驳回决定所依据的文本为：申请日2016年11月30日提交的说明书附图图1-11、说明书摘要、摘要附图； 2017年02月27日提交的说明书第1-67段、权利要求1-2项。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种车前子药材与其配方颗粒中四种成分的含量测定方法，其特征在于：
(1)色谱条件与系统适用性试验 以乙腈为A相、0.5％乙酸为B相，采用梯度洗脱方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱温30℃；检测波长：京尼平苷酸为239nm、咖啡酸为325nm、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为330nm；理论板数按京尼平苷酸峰计算应不低于3000；
(2)对照品溶液的制备 精密称取京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为0.2921，0.0034，0.0476，0.1027mg/mL的混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备 取车前子药材细粉1.5g，精密称定；或车前子配方颗粒0.5g，研细，精密称定；分别置棕色具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，密塞，称定重量，药材细粉以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟；配方颗粒以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟；放冷，再称定重量，用60％甲醇补足各自减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
(4)测定法 分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量。
2. 根据权利要求1所述的一种车前子药材与其配方颗粒中四种成分的含量测定方法，其特征在于所述的车前子配方颗粒每1g相当原生药材6.5～6.7g。”
驳回决定主要认为：（一）权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1的区别技术特征在于：（1）用于测定车前子药材与其配方颗粒中四种成分京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量，并相应地制备这四种物质的对照品溶液，并具体限定了该对照品溶液的浓度；（2）色谱条件中，梯度洗脱过程、流速、检测波长、进样量以及理论塔板数不同于对比文件1；（3）供试品溶液制备过程中具体限定了车前子药材或配方颗粒的称定过程、60%甲醇溶解具体操作方式、超声条件、过滤条件等。对于区别技术特征（1），在对比文件1明确给出利用液相色谱法对车前子药材中各项组分进行有效分离的教导下，为了对其中主要的活性成分含量进行测定，本领域技术人员容易想到在对比文件1的色谱检测方法的基础上，通过配制对照品溶液，利用外标法对特定组分进行定量分析，而基于车前子药材及其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷为主要活性成分为本领域技术人员所熟知，故制备京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品溶液并对其进行定量分析是容易想到的，选择多少的对照品浓度，可以通过常规手段确定。对于上述区别技术特征（2），对比文件1明确给出了以乙腈-0.5%乙酸水溶液进行梯度洗脱的技术教导，本领域技术人员会基于最终的色谱分离情况对流动相洗脱过程进行系统适应性调整，并可通过合理的判断和有限次试验确定洗脱程序；对于流速、检测波长、进样量以及理论塔板数等，可通过峰形、待测成分特征吸收位置、上样要求、柱效要求等通过有限次试验确定，且获得的技术效果可以预期。对于区别技术特征（3），根据实际溶解效果等，将对比文件1中的甲醇替换为60%的甲醇是容易想到的；而选择多少的车前子药材或配方颗粒、如何操作甲醇溶液的溶解过程、超声条件、过滤条件等，可以在对比文件1的基础上结合本领域常规的试验操作确定。因此在对比文件1的基础上结合常用技术手段以获得权利要求1所要求的技术方案，对本领域技术人员是显而易见的，权利要求1不具备创造性。不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（二）从属权利要求2的附加技术特征是本领域技术人员熟知的配方颗粒与原生药材的活性成分比例关系，因而从属权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人河北中医学院（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2019年03月28日向国家知识产权局提出了复审请求，以及修改后的权利要求书。复审请求人依据说明书第16段的记载将“各波峰的保留时间：京尼平苷酸约3分钟、咖啡酸约6.5分钟、毛蕊花糖苷约10.7分钟、异毛蕊花糖苷约12.5分钟，相互分离度都在3以上，并在15分钟内运行完毕”限定至权利要求1中，其余权利要求未作修改。
修改后的权利要求如下：
“1. 一种车前子药材与其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于：
(1)色谱条件与系统适用性试验以乙腈为A相、0.5％乙酸为B相，采用梯度洗脱方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱温30℃；检测波长：京尼平苷酸为239nm、咖啡酸为325nm、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为330nm；理论板数按京尼平苷酸峰计算应不低于3000；
(2)对照品溶液的制备精密称取京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为0.2921，0.0034，0.0476，0.1027mg/mL的混合对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备取车前子药材细粉1.5g，精密称定；或车前子配方颗粒0.5g，研细，精密称定；分别置棕色具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，密塞，称定重量，药材细粉以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟；配方颗粒以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟；放冷，再称定重量，用60％甲醇补足各自减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量；
各波峰的保留时间：京尼平苷酸约3分钟、咖啡酸约6.5分钟、毛蕊花糖苷约10.7分钟、异毛蕊花糖苷约12.5分钟，相互分离度都在3以上，并在15分钟内运行完毕。”
复审请求人认为：（1）本申请的梯度洗脱程序与对比文件1并不相同，且对比文件1也没有给出如何调整洗脱程序可以测定京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量，并不会出现分离度低、分离不完全、误判为杂质峰的情况发生。（2）对比文件1中可以从图1和图2的色谱指纹图确定车前子指纹图谱共有峰为10个，从图2可以确定8号峰为芦丁标准品色谱，本领域技术人员不能显而易见的想到对比文件1中的10个共有峰中一定就含有本申请所要检测的样品，本领域技术人员在对比文件1的基础上并不能显而易见地想到本申请的技术方案。（3）同样，采用对比文件1的供试品溶液的制备方法会得到芦丁在内的车前子有效部分的大部分成分，采用该方法是否得到本申请的检测样品且对比文件1所述的制备方法中芦丁在内的车前子有效部位所含的大部分成分是否会影响本申请对待测物质的高效液相的检测，本领域技术人员不能预料到。对比文件1没有给出采用何种方式可以得到本申请待测样品的技术启示。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年04月12日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：
（1）权利要求1新增加的特征是权利要求1记载的测定方法在实施后的客观结果，不能对权利要求1记载的测定方法做出技术贡献。（2）对比文件1给出了通过高效液相色谱法分离车前子药材各特征组分的技术启示。对比文件1明确公开了流动相为乙腈-0.5%乙酸水溶液、梯度洗脱以及采用紫外检测器，本申请不得改变的检测条件均被对比文件1公开，本领域技术人员在面对如何检测车前子药材及其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸等的技术问题时，有动机根据实际检测情况适当改进供试品的制备条件以提高提取率，并根据色谱峰对应物质极性保留时间等因素对色谱条件进行合理调整以获得更优的色谱分离结果。因此本申请不具备创造性。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）关于审查文本
在复审程序中，复审请求人于2019年03月28日提交了权利要求的最终修改替换页，其中对权利要求1的内容进行了修改。经审查，该修改符合专利法实施细则第61条第1款以及专利法第33条的规定。本决定以复审请求人于2017年02月27日提交的说明书第1-67段，申请日2016年11月30日提交的说明书附图图1-11、说明书摘要、摘要附图，2019年03月28日提交的权利要求第1-2项为审查基础。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型有实质性特点和进步。
如果权利要求与最接近的现有技术之间存在区别技术特征，该区别技术特征未被其他现有技术公开，并且没有证据证明该区别技术特征是本技术领域的公知常识，则该权利要求相对于上述现有技术具备创造性。
具体到本案，
权利要求1要求保护一种车前子药材与其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量测定方法。
对比文件1公开了一种检测车前子指纹图谱的检测方法，具体公开以下技术特征（参见文章摘要、第1-2节）：该方法的色谱条件：Dimonsil C18柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.5%的乙酸水溶液（A B=100%），流速为1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长为270 nm，进样量20μl。线性梯度洗脱时间程序开始时为10%A，10min是为25%，18min时为36%，21-28min时为100%。
对照品溶液的制备：精密称定芦丁对照品1.24mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，0.22μm滤膜过滤，即得。
供试品溶液的制备：称取粉碎的车前子1g, 加甲醇40ml，超声提取60min，滤过，滤液旋转减压蒸干，用甲醇定容至10ml，过0.22μm 滤膜过滤, 即得。
检测波长的选择：利用PDA检测器对190-400nm进行全波段扫描，每10min提取1次色谱图，综合考虑峰的数目、面积，确定检测波长为270nm，建立车前子指纹图谱。
权利要求1请求保护的技术方案对比文件1公开的技术内容相比，区别技术特征在于：（1）用于测定车前子药材与其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量；色谱条件中，梯度洗脱方式为0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min，检测波长：京尼平苷酸为239nm、咖啡酸为325nm、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为330nm，理论板数按京尼平苷酸峰计算应不低于3000；分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量；各波峰的保留时间、相互分离度和运行时间；（2）对照品溶液的制备：精密称取京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为0.2921、0.0034、0.0476、0.1027mg/ml的混合对照品溶液；供试品溶液制备：取车前子药材细粉1.5g，或车前子配方颗粒0.5g，研细，精密称定；分别置棕色具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，密塞，称定重量，药材细粉以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟；配方颗粒以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟；放冷，再称定重量，用60％甲醇补足各自减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过。
由此可知，本申请实际解决的问题是如何准确快速测定车前子药材与其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量。
对于区别技术特征（1），合议组认为：①本申请请求保护的是车前子药材及其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量测定方法；对比文件1公开的是车前子的高效液相指纹图谱，由图1-2可知，车前子指纹图谱确定共有峰10个，S峰为芦丁的色谱峰，其余峰未明确其具体组分。对比文件1是将中药材经适当处理后，采用高效液相色谱分析方法得到的能够标示其成分特征谱图，由此可知两者的发明构思完全不同。②对比文件1公开的是车前子的高效液相指纹图谱，由图1-2可知，车前子指纹图谱确定共有峰10个，S峰为芦丁的色谱峰，将其作为参照峰。在本领域中，参比峰必须是与样品所含成分结构相似的同系物，本申请采用芦丁作为参照S峰，芦丁常用于代表黄酮类物质，因而对比文件1的指纹图谱主要体现黄酮类物质，但本申请中待测组分京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷都不属于黄酮类物质。③对比文件1（参见2.4节）利用PDA检测对190-400nm进行全波段扫描，综合考虑峰的数目、面积，确定检测波长为270nm，从而建立车前子指纹图谱（参见图1）。由本申请京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的190-400nm光谱扫描图中可以看出（参见图5-8），在270nm波长下京尼平苷酸基本无吸收，咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷在此波长下位于波谷位置，吸光度很低，基本不能出峰。由②③可以知晓，对比文件1虽然公开了10个共有峰，但是该10个共有峰并未包含本申请中4个待测组分：京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷或异毛蕊花糖苷，并且与本申请四种待测组分结构差异较大，这也进一步表明本申请与对比文件1属于不同的发明构思。④由于色谱柱流动相组分和洗脱梯度、流速、检测波长与待测样品的具体成分等多种因素之间存在复杂的整体相互作用，车前子四种待测组分高效液相色谱法的检测参数例如流动相组分和洗脱梯度、流速、检测波长和进样量等参数的选择需要依据特定待测组分的检测和实际效果来构建色谱分离，这对本领域技术人员来说需要付出创造性的劳动，并且其技术效果是无法预期的。对比文件1没有公开或给出能够采用本申请上述特定的色谱条件的色谱法来检测车前子药材与其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷含量的技术启示，并且能够达到准确、快速地检测成分的目的。本领域技术人员也无法预期选择上述HPLC法色谱条件等对测定结果的影响。上述区别技术特征（1）并不是本领域的常规选择，目前也没有证据表明上述区别技术特征属于本领域的公知常识。
对于区别技术特征（2），对比文件1（参见第2节）公开芦丁对照品以及供试品溶液的制备。对照品和供试品溶液的制备过程是本领域的常规操作。根据车前子待测组分的不同选择相应的对照品制备成不同浓度的混合对照品溶液属于本领域的常规技术手段。根据待测样品溶解以及实际检测结果的需要，选择溶剂甲醇的浓度、超声的功率、频率和时间等、超声后直接用甲醇补足过滤等是本领域的常规选择，属于本领域的常规技术手段。
综上，本领域技术人员在对比文件1的基础上结合公知常识无法得出权利要求1的技术方案。且权利要求1相对于对比文件1和公知常识具有突出的实质性特点和显著的进步，具备专利法第22条第3款规定的创造性。
在此基础上，从属权利要求2也具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2、前置意见认为：（1）权利要求1新增加的特征是权利要求1记载的测定方法在实施后的客观结果，不能对权利要求1记载的测定方法做出技术贡献。（2）根据药典的记载，除固定相种类、流动相组成和检测器类型不得改变外，其他如色谱规格、流动相流速、混合流动相各组分的比例等均可适当改变。对比文件1给出了通过高效液相色谱法分离车前子药材各特征组分的技术启示。对比文件1明确公开了流动相为乙腈-0.5%乙酸水溶液、梯度洗脱以及采用紫外检测器，本申请不得改变的检测条件均被对比文件1公开，本领域技术人员在面对如何检测车前子药材及其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸等的技术问题时，有动机根据实际检测情况适当改进供试品的制备条件以提高提取率，并根据色谱峰对应物质极性保留时间等因素对色谱条件进行合理调整以获得更优的色谱分离结果。因此本申请不具备创造性。
对此合议组认为：（1）权利要求1对波峰的保留时间、相互分离度以及运行时间属于色谱运行的结果，属于对该含量测定条件的进一步限定，应与权利要求1限定的其他技术特征结合作为技术方案整体上考虑权利要求1相对于现有技术在创造性意义上的贡献。（2）首先，2010年版药典一部在车前草（参见第64页）的含量测定中，明确记载了色谱柱填充剂、流动相组成和配比以及检测波长；并且在人参（参见第8页）的含量测定中明确记载了流动相组成和梯度。其次，对比文件1公开的包含乙腈-0.5%的乙酸溶液作为流动相、梯度洗脱和波长的色谱条件是用于得到车前子的高效液相指纹图谱；这些并非是不可改变的色谱条件，需要根据待测组分的不同根据实际检测效果进行调整的。参见权利要求1创造性的评述，对比文件1没有公开或给出能够采用本申请上述特定的色谱条件的色谱法来检测车前子药材与其配方颗粒中四种待测组分含量的技术启示，并且能够达到准确、快速地检测成分的目的；本领域技术人员也无法预期选择上述HPLC法色谱条件等对测定结果的影响。因此权利要求1-2具备创造性。
三、决定
撤销国家知识产权局于2019年02 月15 日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本决定所针对的文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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