发明创造名称：一种三唑磷分析测定试剂盒及其应用
外观设计名称：
决定号：189478
决定日：2019-09-10
委内编号：1F259443
优先权日：
申请（专利）号：201611165135.9
申请日：2016-12-16
复审请求人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：崔秀艳
合议组组长：汤利容
参审员：彭予泓
国际分类号：G01N33/577；G01N33/543
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求所要求保护的技术方案与最接近的现有技术相比，存在区别技术特征，其中部分区别技术特征被另一篇现有技术公开并给出了结合启示，其余区别技术特征属于本领域的常规选择，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201611165135.9，名称为“一种三唑磷分析测定试剂盒及其应用”的发明专利申请（下称本申请），其申请日为2016年12月16日，公开日为2017年05月31日，申请人为中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所。
经实质审查，国家知识产权局专利实质审查部门于2018年06月01日发出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：权利要求1-5不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。驳回决定中引用如下对比文件：
对比文件1：CN105651992A，公开日为2016年06月08日；
对比文件2：“纳米金标记p53抗体探针在p53蛋白检测中的应用”，黄云艳 等，中国实验诊断学，第14卷第6期，第839-843页，公开日为2010年06月30日。
驳回决定所依据的文本为：申请日2016年12月16日提交的说明书第1-11页、说明书附图第1页、说明书摘要和摘要附图；2018年02月07日提交的权利要求第1-5项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种三唑磷分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有：
三唑磷标准品、三唑磷纳米探针、三唑磷酶标胶体金复合探针、催化底物以及终止液；
所述三唑磷纳米探针由磁性纳米粒子和三唑磷完全抗原偶联而成；
所述三唑磷酶标胶体金复合探针由抗三唑磷抗体以及HRP包被胶体金颗粒得到；所述HRP与链霉亲和素组成复合物，以生物素修饰的单链DNA为媒介包被至所述胶体金颗粒上；
所述三唑磷完全抗原由三唑磷和载体蛋白偶联而成；
述载体蛋白为鸡卵白蛋白；
所述磁性纳米粒子的粒径为18～22nm；
所述胶体金颗粒的粒径为13～15nm；
所述抗三唑磷抗体为单克隆抗体。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述三唑磷酶标胶体金复合探针具体由以下方法制备得到：
1）、取胶体金溶液调pH至8.8～9.2后向其中加入抗三唑磷抗体，搅拌混合，静置25～35min；然后加入生物素修饰的单链DNA链，8～12℃静置36～44h；再调整pH至7.3～7.5，加入NaCl至浓度0.08～0.12mol/L，8000～11000r/min离心8～12min，弃上清，得到含寡核苷酸的胶体金；
2）、用牛血清白蛋白浓度为0.8～1.2％的磷酸盐缓冲溶液重悬所述含寡核苷酸的胶体金，孵育1～3h；再加入链霉亲和素-HRP，室温反应1～3h，离心弃上清，得到所述三唑磷酶标胶体金复合探针。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
在加入NaCl至既定浓度时，在120～180min内分2～4次等量加入，每次间隔40～60min。
4. 权利要求1～3任一项所述的三唑磷分析测定试剂盒在三唑磷定性定 量分析中的应用。
5. 一种三唑磷定性定量分析的方法，其特征在于，包括：
a）、将三唑磷标准品、提取与净化后的待测样品分别与等体积的三唑磷酶标胶体金复合探针和三唑磷纳米探针混合孵育；
b）、洗涤孵育产物并去杂化得到竞争复合物；
c）、使用催化底物与所述竞争复合物共孵育，然后加入终止液终止反应，酶标仪测定；
d）、以三唑磷标准品的浓度为横坐标，各浓度所对应的灰度抑制率为纵坐标，建立标准曲线，并根据标准曲线计算各样品中的三唑磷浓度。”
驳回决定具体指出：（1）权利要求1要求保护一种三唑磷分析测定试剂盒，对比文件1公开一种三唑磷生物条形码免疫分析测定试剂盒，权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：前者的胶体金复合探针由三唑磷抗体以及HRP包被胶体金颗粒得到，HRP与链霉亲和素组成复合物，以生物素修饰的单链DNA作为媒介包被至胶体金颗粒上，试剂盒中还包含催化底物以及终止液，而不包含单标胶体金纳米探针和DNA生物芯片以及银染试剂。也就是说权利要求1要求保护的技术方案以酶催化底物产生可检测信号，而对比文件1中通过银染胶体金颗粒的方式产生可检测信号。对于上述区别技术特征，对比文件2公开了利用纳米金可以与蛋白和寡核苷酸等生物分子进行结合等特点，将抗体蛋白和辣根过氧化物酶通过寡核苷酸作用标记到纳米金表面构建新型多功能纳米金探针，结合免疫磁珠探针，构建p53蛋白检测体系。其中，巯基化DNA链与检测抗体修饰的纳米金颗粒孵育，再加入链霉亲和素-HRP反应，HRP分子通过与巯基化DNA链的生物素-链霉亲和素结合反应标记到纳米金颗粒表面。探针上HRP的定量通过酶催化底物TMB生成有色产物的吸光度值进行测定。进行免疫检测时，加入TMB溶液反应，再加入H2SO4终止显色反应。对比文件2与本申请均属于免疫检测领域，且无需基因芯片、银染步骤。对比文件2给出了与对比文件1相结合的启示。因此，权利要求1不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。（2）从属权利要求2的附加技术特征属于本领域技术人员由对比文件1和对比文件2公开的内容容易想到的；从属权利要求3的附加技术特征被对比文件1公开。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求2-3也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。（3）独立权利要求4要求保护权利要求1-3任一项所述的三唑磷分析测定试剂盒在三唑磷定性定量分析中的应用，对比文件1也公开了将其试剂盒用于三唑磷定性定量分析。因此，在权利要求1-3不具备创造性的基础上，对比文件1结合对比文件2得到权利要求4的技术方案，对于本领域技术人员来说也是显而易见的。因此，权利要求4也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。（4）独立权利要求5要求保护一种三唑磷定性定量分析方法，对比文件1也公开了测定三唑磷的方法，权利要求5与对比文件1的区别技术特征在于：前者检测时，使用催化底物与竞争复合物共孵育，加入终止液终止反应，酶标仪测定。也就是说权利要求5要求保护的技术方案以酶催化底物产生可检测信号，而对比文件1中通过银染胶体金颗粒的方式产生可检测信号。对于上述区别技术特征，对比文件2公开了利用纳米金可以与蛋白和寡核苷酸等生物分子进行结合等特点，将抗体蛋白和辣根过氧化物酶通过寡核苷酸作用标记到纳米金表面构建新型多功能纳米金探针，结合免疫磁珠探针，构建p53蛋白检测体系。其中，巯基化DNA链与检测抗体修饰的纳米金颗粒孵育，再加入链霉亲和素-HRP反应，HRP分子通过与巯基化DNA链的生物素-链霉亲和素结合反应标记到纳米金颗粒表面。探针上HRP的定量通过酶催化底物TMB生成有色产物的吸光度值进行测定。进行免疫检测时，待测抗原或血清标本与磁珠探针孵育，外加磁场收集结合抗原的磁珠探针，加入多功能纳米金探针，孵育，洗液清洗去除未结合的多功能纳米金探针。加入TMB溶液反应，再加入H2SO4终止显色反应。对比文件2中的方法无需基因芯片、银染步骤。对比文件2给出了与对比文件1相结合的启示。因此，权利要求5不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
申请人中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所（下称复审请求人）不服上述驳回决定，于2018年08月23日向国家知识产权局提出复审请求，同时提交了权利要求书的全文修改替换页，修改涉及：将权利要求2的附加技术特征加入到权利要求1中，删除权利要求2，并适应性修改了权利要求的序号和引用关系。复审请求人认为：（1）权利要求1中的三唑磷酶标胶体金复合探针的制备方法与对比文件1中的三唑磷双标胶体金纳米探针制备方法不同。（2）权利要求1以HRP催化底物显色作为检测信号，对比文件1中以银染胶体金颗粒的方式产生检测信号。（3）本申请与对比文件2相比，胶体金未经硝酸纤维素薄膜过滤器过滤，未加稳定剂稳定探针，反应体系pH、孵育时间、NaCl添加量和添加方式不同。（4）本申请具有检测限低，灵敏度高等一系列优点。
提出复审请求时提交的权利要求书如下：
“1. 一种三唑磷分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有：
三唑磷标准品、三唑磷纳米探针、三唑磷酶标胶体金复合探针、催化底物以及终止液；
所述三唑磷纳米探针由磁性纳米粒子和三唑磷完全抗原偶联而成；
所述三唑磷酶标胶体金复合探针由抗三唑磷抗体以及HRP包被胶体金颗粒得到；所述HRP与链霉亲和素组成复合物，以生物素修饰的单链DNA为媒介包被至所述胶体金颗粒上。
所述三唑磷完全抗原由三唑磷和载体蛋白偶联而成。
所述载体蛋白为鸡卵白蛋白。
所述磁性纳米粒子的粒径为18～22nm。
所述胶体金颗粒的粒径为13～15nm。
所述抗三唑磷抗体为单克隆抗体。
所述三唑磷酶标胶体金复合探针具体由以下方法制备得到：
1）、取胶体金溶液调pH至8.8～9.2后向其中加入抗三唑磷抗体，搅拌混合，静置25～35min；然后加入生物素修饰的单链DNA链，8～12℃静置36～44h；再调整pH至7.3～7.5，加入NaCl至浓度0.08～0.12mol/L，8000～11000r/min离心8～12min，弃上清，得到含寡核苷酸的胶体金；
2）、用牛血清白蛋白浓度为0.8～1.2％的磷酸盐缓冲溶液重悬所述含寡核苷酸的胶体金，孵育1～3h；再加入链霉亲和素-HRP，室温反应1～3h，离心弃上清，得到所述三唑磷酶标胶体金复合探针。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
在加入NaCl至既定浓度时，在120～180min内分2～4次等量加入，每次间隔40～60min。
3. 权利要求1～2任一项所述的三唑磷分析测定试剂盒在三唑磷定性定量分析中的应用。
4. 一种三唑磷定性定量分析的方法，其特征在于，包括：
a）、将三唑磷标准品、提取与净化后的待测样品分别与等体积的三唑磷酶标胶体金复合探针和三唑磷纳米探针混合孵育；
b）、洗涤孵育产物并去杂化得到竞争复合物；
c）、使用催化底物与所述竞争复合物共孵育，然后加入终止液终止反应，酶标仪测定；
d）、以三唑磷标准品的浓度为横坐标，各浓度所对应的灰度抑制率为纵坐标，建立标准曲线，并根据标准曲线计算各样品中的三唑磷浓度。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年09月04日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年04月24日发出复审通知书，指出：（1）权利要求1要求保护一种三唑磷分析测定试剂盒。对比文件1公开了一种三唑磷生物条形码免疫分析测定试剂盒，权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：权利要求1的三唑磷酶标胶体金复合探针由三唑磷抗体以及HRP包被胶体金颗粒得到，HRP与链霉亲和素组成复合物，以生物素修饰的单链DNA作为媒介包被至胶体金颗粒上，试剂盒中还包含催化底物以及终止液，而不包含单标胶体金纳米探针和DNA生物芯片以及银染试剂。也就是说权利要求1要求保护的技术方案以酶催化底物产生可检测信号，而对比文件1中通过银染胶体金颗粒的方式产生可检测信号。区别还包括：权利要求1三唑磷酶标胶体金复合探针的具体制备方法中，单链DNA链是生物素修饰的；孵育后的含寡核苷酸的胶体金再加入链霉亲和素-HRP，室温反应1～3h，离心弃上清，得到所述三唑磷酶标胶体金复合探针。对比文件2公开了将抗体蛋白和辣根过氧化物酶标记到纳米金表面构建新型多功能纳米金探针，结合免疫磁珠探针，构建p53蛋白检测体系。且对比文件2给出了向抗体标记的胶体金溶液中加入生物素修饰的单链DNA链和链霉亲和素-HRP以制备胶体金复合探针，相应的在试剂盒中还包含催化底物以及终止液的技术启示。在对比文件1的基础上，当本领域技术人员需要简单易行且灵敏度高的检测信号产生方式时，有动机将对比文件2中的技术手段结合至对比文件1中。在对比文件2公开内容的基础上，其他具体操作步骤的选择属于本领域的常规选择。因此，权利要求1不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。（2）从属权利要求2的附加技术特征被对比文件1公开。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。（3）独立权利要求3要求保护权利要求1-2任一项所述的三唑磷分析测定试剂盒在三唑磷定性定量分析中的应用，对比文件1也公开了将其试剂盒用于三唑磷定性定量分析。因此，在权利要求1-2不具备创造性的基础上，对比文件1结合对比文件2和本领域公知常识得到权利要求3的技术方案，对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，权利要求3不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。（4）独立权利要求4要求保护一种三唑磷定性定量分析方法，对比文件1公开了一种三唑磷的定性定量分析方法，权利要求4与对比文件1的区别技术特征在于：权利要求4中，参与混合孵育的是三唑磷酶标胶体金复合探针，洗涤孵育产物并去杂化得到的是竞争复合物，使用催化底物与竞争复合物共孵育，加入终止液终止反应，酶标仪测定。也就是说权利要求4要求保护的技术方案以酶催化底物产生可检测信号，而对比文件1中通过银染胶体金颗粒的方式产生可检测信号。对于上述区别技术特征，对比文件2公开了利用纳米金可以与蛋白和寡核苷酸等生物分子进行结合等特点，将抗体蛋白和辣根过氧化物酶标记到纳米金表面构建新型多功能纳米金探针，结合免疫磁珠探针，构建p53蛋白检测体系。对比文件2公开了使用催化底物与免疫反应的复合物共孵育，加入终止液终止反应，且对比文件2中的方法无需基因芯片、银染步骤。在对比文件2的启示下，本领域技术人员有动机将对比文件2中的技术手段结合至对比文件1中。在对比文件2公开内容的基础上，本领域技术人员容易想到使用催化底物与竞争复合物共孵育及进行后续的加入终止液终止反应，酶标仪测定。由此可见，在对比文件1的基础上结合对比文件2和本领域公知常识得到权利要求4的技术方案，对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，权利要求4不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。（5）对复审请求人的意见陈述进行了详细答复。
复审请求人于2019年05月31日提交了意见陈述书，但未修改申请文件。复审请求人认为：（1）权利要求 1与对比文件 1 的区别至少有：1）本申请试剂盒还包括催化底物和终止液，对比文件1中还包括单标胶体金纳米探针、DNA生物芯片以及银染试剂；2）本申请中三唑磷酶标胶体金复合探针由抗三唑磷抗体以及HRP包被胶体金颗粒得到，HRP与链霉亲和素组成复合物，以生物素修饰的单链DNA作为酶解包被至胶体金颗粒上，对比文件 1 中三唑磷双标胶体金纳米探针由抗三唑磷抗体和双链DNA包被胶体金颗粒得到；3）本申请中限定了三唑磷酶标胶体金复合探针的制备方法，其中单链DNA链是生物素修饰的，孵育后的含寡核苷酸的胶体金再加入链霉亲和素-HRP，对比文件1中不涉及。（2）对比文件2与对比文件1不具有结合启示。首先，对比文件1中给出了“三明治”结构模式不适用于三唑磷的检测的技术启示。而对比文件2中采用的是纳米金探针构成的三明治结构。对比文件1和对比文件2技术构思不同，分别给出了完全相反的技术启示，解决的技术问题相反，本领域技术人员不会将对比文件1中的检测步骤替换为对比文件2中的方法。其次，对比文件2中所检测的对象与本申请和对比文件1中均不相同。本领域技术人员不会将对比文件2中的针对大分子蛋白检测体系用于对比文件1中的小分子农药。（3）本申请获得了有益的技术效果，该技术效果并不是在对比文件1和2基础上能够预料到的。对比文件1的检出限比本申请的检出限高出约20倍，其检测的灵敏度低。将对比文件2的检测方法用于检测三唑磷的效果无法预料。本申请具有简便、快速、灵敏、特异、稳定、便于操作和生产、可靠等优点。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人在2018年08月23日提出复审请求时提交了权利要求书的全文修改替换页，经查，所作修改符合专利法第33条的规定。本复审请求审查决定针对的审查文本是：2018年08月23日提交的权利要求书第1-4项，申请日2016年12月16日提交的说明书第1-11页、说明书附图第1页、说明书摘要和摘要附图。
2、关于专利法第22条第3款
创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果权利要求所要求保护的技术方案与最接近的现有技术相比，存在区别技术特征，其中部分区别技术特征被另一篇现有技术公开并给出了结合启示，其余区别技术特征属于本领域的常规选择，则该权利要求不具备创造性。
（1）权利要求1不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
权利要求1要求保护一种三唑磷分析测定试剂盒，对比文件1公开了一种三唑磷生物条形码免疫分析测定试剂盒（参见权利要求1-6、8），包含：三唑磷标准品、三唑磷磁性纳米探针、单标胶体金纳米探针、三唑磷双标胶体金纳米探针、DNA生物芯片、银染试剂。三唑磷磁性纳米探针由磁性纳米粒子和三唑磷完全抗原偶联而成；单标胶体金纳米探针由单链DNA1包被胶体金颗粒得到；三唑磷双标胶体金纳米探针由抗三唑磷抗体和双链DNA包被胶体金颗粒得到；三唑磷完全抗原由三唑磷和载体蛋白偶联而成，载体蛋白为鸡卵白蛋白；磁性纳米粒子的粒径为18～22nm；胶体金颗粒的粒径为13～15nm；抗三唑磷抗体为单克隆抗体。三唑磷双标胶体金纳米探针的制备方法：取胶体金溶液调pH至8.8～9.2后向其中加入抗三唑磷抗体，搅拌混合，静置25～35min；然后加入硫醇修饰的单链DNA链，8～12℃静置36～44h；再调整pH至7.3～7.5，加入NaCl至浓度0.08～0.12mol/L，8000～11000r/min离心8～12min，弃上清，得到含寡核苷酸的胶体金；用牛血清白蛋白浓度为0.8～1.2％的磷酸盐缓冲溶液重悬所述含寡核苷酸的胶体金，孵育1～3h；再加入与所述硫醇修饰的单链DNA链互补的生物条形码DNA链，室温杂交3～5h，8000～11000r/min离心，弃上清，得到所述三唑磷双标胶体金纳米探针。
权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：权利要求1的三唑磷酶标胶体金复合探针由三唑磷抗体以及HRP包被胶体金颗粒得到，HRP与链霉亲和素组成复合物，以生物素修饰的单链DNA作为媒介包被至胶体金颗粒上，试剂盒中还包含催化底物以及终止液，而不包含单标胶体金纳米探针和DNA生物芯片以及银染试剂。也就是说权利要求1要求保护的技术方案以酶催化底物产生可检测信号，而对比文件1中通过银染胶体金颗粒的方式产生可检测信号。区别还包括：权利要求1三唑磷酶标胶体金复合探针的具体制备方法中，单链DNA链是生物素修饰的；孵育后的含寡核苷酸的胶体金再加入链霉亲和素-HRP，室温反应1～3h，离心弃上清，得到所述三唑磷酶标胶体金复合探针。基于上述区别技术特征，权利要求1的技术方案实际解决的技术问题是提供一种简单易行且灵敏度高的检测信号产生方式。
对比文件2公开了利用纳米金可以与蛋白和寡核苷酸等生物分子进行结合等特点，将抗体蛋白和辣根过氧化物酶（HRP，通过寡核苷酸作用）标记到纳米金表面构建新型多功能纳米金探针，结合免疫磁珠探针，构建p53蛋白检测体系。纳米金生物分子复合探针的制备方法：1ml 59nM的10nm纳米金溶液经0.22μm硝酸纤维薄膜过滤器过滤，K2CO3溶液调节pH9.0后，加入检测抗体，室温孵育1小时，巯基化DNA链（5’-(SH)-TTTTTTTTTTAgCTACgAgTTgAATCCTgCgTTTT-TTTTTT(BIOTIN)-3’，为生物素修饰的单链DNA）与检测抗体修饰的纳米金颗粒混合摇匀，4℃孵育16小时；加入PEG8000稳定探针，加入NaCl、PB，充分混匀（相当于本申请中的含寡核苷酸的胶体金），多余检测抗体和巯基化DNA链通过离心去除；加入2.5μl streptavidin-HRP（1mg/mL）室温反应1h，HRP分子通过与巯基化DNA链的生物素-链霉素结合反应标记到纳米金颗粒表面。探针上HRP的定量通过酶催化底物TMB生成有色产物的吸光度值进行测定。进行免疫检测时，加入TMB溶液反应，再加入H2SO4终止显色反应，于多功能酶标仪450nm波长处检测A450nm值（参见对比文件2第840页左栏，第841页左栏）。对比文件2与本申请均属于免疫检测领域，且无需基因芯片、银染步骤，其中纳米金复合探针以及TMB溶液和终止液H2SO4的作用与其在本申请中一致，即，在免疫反应中产生与待测物含量相关的可检测信号。也就是说对比文件2给出了向抗体标记的胶体金溶液中加入生物素修饰的单链DNA链和链霉亲和素-HRP以制备胶体金复合探针，相应的在试剂盒中还包含催化底物以及终止液的技术启示。在对比文件1的基础上，当本领域技术人员需要简单易行且灵敏度高的检测信号产生方式时，有动机将对比文件2中的技术手段结合至对比文件1中，取代对比文件1中的银染测定以使检测体系简单易行且灵敏度高。对比文件2公开了HRP分子通过与巯基化DNA链的生物素-链霉素结合反应标记到纳米金颗粒表面。即对比文件2公开了含寡核苷酸的胶体金是用于吸附HRP分子，为了得到含有HRP分子的复合探针，本领域技术人员容易想到在孵育后的含寡核苷酸的胶体金中加入链霉亲和素-HRP室温反应。对于本领域技术人员来说，含寡核苷酸的胶体金加入链霉亲和素-HRP室温反应后，为了去除其中的干扰物质，采用离心去上清的处理方式，属于本领域的常规选择。
由此可见，在对比文件1的基础上结合对比文件2和本领域公知常识得到权利要求1的技术方案，对于本领域技术人员来说是显而易见的，因此权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
（2）权利要求2不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
对于从属权利要求2，对比文件1已经公开了其附加技术特征（参见权利要求7）：在加入NaCl至既定浓度时，在120～180min内分2～4次等量加入，每次间隔40～60min。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
（3）权利要求3不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
独立权利要求3要求保护权利要求1-2任一项所述的三唑磷分析测定试剂盒在三唑磷定性定量分析中的应用，根据对权利要求1-2的评述可知，其中的试剂盒相对于对比文件1与对比文件2和本领域公知常识的结合不具备创造性，此外，对比文件1也公开了将其试剂盒用于三唑磷定性定量分析（参见权利要求9）。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2和本领域公知常识得到权利要求3的技术方案，对于本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求3不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
（4）权利要求4不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
独立权利要求4要求保护一种三唑磷定性定量分析方法，对比文件1也公开了一种三唑磷的定性定量分析方法（参见权利要求10）：a)、将三唑磷标准品、提取与净化后的待测样品分别与等体积的三唑磷双标胶体金探针和三唑磷磁性纳米探针混合孵育；b)、洗涤孵育产物并去杂化得到与各标准品与待测样品对应的生物条形码；c)、将所述生物条形码与DNA生物芯片杂交，并加入单标纳米金探针放大信号；杂交反应结束后加入银染试剂并用芯片扫描仪测定仪测定各孔灰度值；d)、以三唑磷标准品的浓度为横坐标，各浓度所对应的灰度抑制率为纵坐标，建立标准曲线，并根据标准曲线计算各样品中的三唑磷浓度。
权利要求4与对比文件1的区别特征在于：权利要求4中，参与混合孵育的是三唑磷酶标胶体金复合探针，洗涤孵育产物并去杂化得到的是竞争复合物，使用催化底物与竞争复合物共孵育，加入终止液终止反应，酶标仪测定。也就是说权利要求4要求保护的技术方案以酶催化底物产生可检测信号，而对比文件1中通过银染胶体金颗粒的方式产生可检测信号。基于上述区别特征，权利要求4的技术方案实际解决的技术问题是提供一种简单易行且灵敏度高的检测信号产生方式。
对比文件2公开了利用纳米金可以与蛋白和寡核苷酸等生物分子进行结合等特点，将抗体蛋白和辣根过氧化物酶（HRP，通过寡核苷酸作用）标记到纳米金表面构建新型多功能纳米金探针，结合免疫磁珠探针，构建p53蛋白检测体系。其中，巯基化DNA链与检测抗体修饰的纳米金颗粒孵育，再加入链霉亲和素-HRP反应，HRP分子通过与巯基化DNA链的生物素-链霉亲和素结合反应标记到纳米金颗粒表面。探针上HRP的定量通过酶催化底物TMB生成有色产物的吸光度值进行测定。进行免疫检测时，待测抗原或血清标本与磁珠探针孵育，外加磁场收集结合抗原的磁珠探针，加入多功能纳米金探针，孵育，洗液清洗去除未结合的多功能纳米金探针。加入TMB溶液反应，再加入H2SO4终止显色反应，于多功能酶标仪450nm波长处检测A450nm值（参见第840页左栏，第841页左栏）。即对比文件2公开了使用催化底物与免疫反应的复合物共孵育，加入终止液终止反应，且对比文件2中的方法无需基因芯片、银染步骤，并且其中多功能纳米金探针以及检测时向免疫复合物中加入TMB溶液和终止液的作用与其在本申请中一致，即，在免疫反应中产生与待测物含量相关的可检测信号。在对比文件2的启示下，本领域技术人员有动机将对比文件2中的技术手段结合至对比文件1中，取代对比文件1中的银染测定以使检测体系简单易行且灵敏度高，从而使得参与混合孵育的是三唑磷酶标胶体金复合探针；以及后续的使用催化底物与免疫反应的复合物共孵育，加入终止液终止反应，酶标仪测定。在竞争免疫反应之后，对反应的产物进行洗涤孵育去杂化处理后得到竞争复合物，再对竞争复合物进行检测，属于本领域对竞争复合物进行检测的常规选择，因而本领域技术人员容易想到使用催化底物与竞争复合物共孵育及进行后续的加入终止液终止反应，酶标仪测定。
由此可见，在对比文件1的基础上结合对比文件2和本领域公知常识得到权利要求4的技术方案，对于本领域技术人员来说是显而易见的，因此权利要求4不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
3、对复审请求人相关意见的答复
针对复审请求人的上述意见陈述，合议组认为：
（1）对于复审请求人陈述的上述区别1），对比文件1说明书第[0012]段公开了利用磁性纳米粒子表面的包被抗原与农药分子竞争结合胶体金纳米探针表面的抗体建立竞争型免疫化学反应体系。利用磁分离系统分离免疫结合的抗原抗体复合物，采用热变性技术促使胶体金纳米探针释放生物条形码，并利用DNA芯片探针和单标胶体金纳米探针杂交结合生物条形码，进而利用金标银染法测定生物条形码含量，实现对三唑磷农药的定量检测。由此可见，对比文件1中采用单标胶体金纳米探针、DNA生物芯片和银染试剂，是用于对竞争反应体系的产物进行检测。对比文件2公开的酶联免疫分析法，无需采用基因芯片、银染试剂等，在酶联免疫分析的检测中加入了酶催化底物TMB以及终止液H2SO4。而银染反应检测过程需要多步杂交反应，还需结合基因芯片、银染或PCR扩增等步骤，检测时间很长、杂交过程复杂且需要昂贵的检测仪器，大大限制了其在临床方面的应用。因此，本领域技术人员有动机将对比文件2的酶标胶体金探针用于替换对比文件1中的双标胶体金纳米探针，从而无需采用单标胶体金纳米探针、DNA生物芯片以及银染试剂。
对于复审请求人陈述的上述区别2）-3），对比文件1公开了含寡核苷酸的胶体金的制备方法，并在含寡核苷酸的胶体金的基础上，制备复合探针。对比文件2公开了纳米金生物分子复合探针（即本申请中的酶标胶体金复合探针）的制备方法，1ml 59nM的10nm纳米金溶液经0.22μm硝酸纤维薄膜过滤器过滤，加入检测抗体，室温孵育1小时，巯基化DNA链与检测抗体修饰的纳米金颗粒混合摇匀，4℃孵育16小时，所得产物相当于本申请中的含寡核苷酸的胶体金。HRP分子通过与巯基化DNA链的生物素-链霉素结合反应标记到纳米金颗粒表面。其中巯基化DNA链为5’-(SH)-TTTTTTTTTTAgCTACgAgTTgAATCCTgCgTTTT-TTTTTT(BIOTIN)-3’，该DNA为生物素修饰的单链DNA。由此可见，上述区别2）-3）被对比文件2公开，权利要求1和对比文件2均为在含寡核苷酸胶体金的基础上，制备复合探针，且其中采用的DNA均为生物素修饰的单链DNA。即对比文件2公开了酶标胶体金复合探针的制备方法，公开了辣根过氧化物酶HRP可通过生物素修饰的单链DNA结合到纳米金表面。本领域技术人员为了将HRP分子结合到纳米金表面，容易想到将对比文件1中的硫醇修饰的单链DNA替换为生物素修饰的单链DNA。本领域技术人员有动机在对比文件1公开的含寡核苷酸的胶体金的基础上，结合对比文件2公开的复合探针的制备方法，制备酶标胶体金复合探针。
（2）对比文件1说明书第[0028]段公开了通过形成三唑磷磁性纳米探针-三唑磷双标胶体金纳米探针的结合，与三唑磷-三唑磷双标胶体金纳米探针的结合进行竞争。由此可见，对比文件1的方法本质上是一种竞争法，并不是“三明治”结构。对比文件2虽然采用了“三明治”结构，但对比文件2与对比文件1结合，是使用对比文件2中的酶标探针替换对比文件1中的双标胶体金探针，并不是将对比文件2的检测方法完全结合到对比文件1中。由于酶标探针，采用底物催化发光即可实现检测，具有过程简单、灵敏度高等优点，而对比文件1中采用双标探针的检测方法，后续处理需要用到银染试剂。因此，本领域技术人员为了减少银染试剂的使用，提高检测灵敏度，有动机将对比文件2公开的酶标探针用于替换对比文件1中的双标探针。
对比文件1明确公开了（参见说明书第[0005]段）：三唑磷分子为小分子化合物，通常情况下只有一个抗原结合位点。对比文件1采用的方法本质上是竞争法，适合于三唑磷小分子化合物。大分子因为结合位点较多，可采用“三明治”结构，而小分子因为结合位点少，不适合采用“三明治”结构，这是本领域公知的内容。对比文件2公开的酶标探针具有抗体结合位点，可与三唑磷小分子结合。而本领域技术人员用对比文件2中的酶标探针替换对比文件1中的双标探针时，容易想到采用竞争法进行检测，而非将对比文件1的检测方法改进为采用“三明治”结构。且竞争法也是酶联免疫分析中公知的方法，将对比文件2中的酶联免疫分析法改进为酶联免疫竞争法也属于本领域的惯用手段。因此，对比文件1与对比文件2的结合并不存在技术上的障碍。
（3）对于生物检测方法来说，提高灵敏度是本领域公知的需求。对比文件1公开了检测方法灵敏度大大提高，可为蔬菜水果中三唑磷的检测提供更为灵敏、快速、可靠的依据。由此可见，对比文件1获得了提高灵敏度的技术效果。对于检测方法的灵敏度，不仅与检测方法本身的原理有关，还与其他多种因素相关，例如实际待测样品的性质、检测的操作步骤、反应条件、仪器的参数等。具体灵敏度提高的倍数与该检测方法的各个方面相对应。本申请所取得的技术效果是本领域技术人员可以预期的，不属于预料不到的技术效果。
因此，对于复审请求人在意见陈述中认为本申请具备创造性的理由合议组不予支持。
基于上述事实和理由，合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年06月01日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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