发明创造名称：用于鉴别靶细胞特异性靶表位的靶抗原发现、表型筛选及其用途
外观设计名称：
决定号：189313
决定日：2019-09-09
委内编号：1F256273
优先权日：2013-06-28
申请（专利）号：201480042778.7
申请日：2014-06-20
复审请求人：X博迪公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：李鹏飞
合议组组长：王少伟
参审员：杨敏
国际分类号：G01N33/53，G01N33/563，G01N33/68，C12N15/11
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求请求保护的技术方案与最接近的现有技术公开的技术方案之间具有区别技术特征，目前没有证据表明该区别技术特征属于本领域的公知常识，且该区别技术特征使权利要求的技术方案产生了有益效果，则该权利要求具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201480042778.7，名称为“用于鉴别靶细胞特异性靶表位的靶抗原发现、表型筛选及其用途”的PCT发明专利申请（下称本申请），申请人为X博迪公司。本申请的申请日为2014年06月20日，优先权日为2013年06月28日，进入中国国家阶段日为2016年01月28日，公开日为2016年06月08日。
国家知识产权局专利实质审查部门以本申请权利要求1-23不具备专利法第22条第3款的规定为由，于2018年04月02日驳回了本申请。驳回决定中引用了如下对比文件：
对比文件1：WO2012/125733A2，公开日为2012年09月20日。
驳回决定所针对的文本为：2017年12月28日提交的权利要求第1-23项；进入中国国家阶段日2016年01月28日提交的国际申请文件中文译文中的说明书第1-11页、说明书附图第1-10页以及说明书摘要。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，所述方法包括：
a.将结合多肽的多样化核酸展示文库与第一细胞类型的外表面上展示的细胞表面抗原接触；和
b.从所述文库分离特异性结合所述第一细胞类型外表面上的所述细胞表面抗原的至少一个文库成员，由此鉴别特异性结合所述细胞表面抗原的结合多肽。
2. 权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前，所述结合多肽的多样化核酸展示文库与第二细胞类型接触，所述第二细胞类型不展示在所述外表面上展示的所述抗原。
3. 一种鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，所述方法包括：
a.将结合多肽的多样化核酸展示文库与表达细胞表面抗原的第一细胞类型接触，并从所述文库分离特异性结合所述第一细胞类型的至少一个文库成员；
b.将所述结合多肽的多样化核酸展示文库与不表达所述细胞表面抗原的第二细胞类型接触，并从所述文库分离特异性结合所述第二细胞类型的至少一个文库成员；和
c.选择特异性结合所述第一细胞类型但不特异性结合所述第二细胞类型的文库成员，由此鉴别特异性结合所述细胞表面抗原的结合多肽。
4. 权利要求1、2或3所述的方法，其中所述多样化核酸展示文库是DNA展示文库。
5. 权利要求4所述的方法，其中所述DNA展示文库的每个成员包含结合多肽，所述结合多肽通过插入式DNA接头连接到编码所述结合多肽的DNA编码序列，其中所述DNA接头包含限制性核酸内切酶位点。
6. 权利要求5所述的方法，其中所述限制性核酸内切酶位点不存在于所述DNA展示文库的成员的编码序列中。
7. 权利要求5或6所述的方法，其中所述方法还包括物理分离所述分离的文库成员的所述DNA编码序列和连接的结合多肽。
8. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将完整的分离的文库成员与所述第一或第二细胞类型分离。
9. 权利要求8所述的方法，其中所述分离的文库成员通过酶裂解所述细胞表面抗原与所述第一或第二细胞类型分离。
10. 权利要求9所述的方法，其中所述细胞表面抗原通过糖脂锚连接到所述细胞表面，并且所述分离的文库成员通过磷脂酶裂解所述糖脂锚与所述第一或第二细胞类型分离。
11. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括测定所述分离的文库成员的至少一部分的所述DNA编码序列。
12. 权利要求11所述的方法，其中所述DNA编码序列通过焦磷酸测序测定。
13. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是天然存在的蛋白质、聚糖或脂质。
14. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的蛋白。
15. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是重组抗原。
16. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是嵌合抗原。
17. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是天然表达所述细胞表面抗原的细胞。
18. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是经工程化以异源性表达所述细胞表面抗原的重组细胞。
19. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是正常细胞的疾病相关变异体。
20. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是肿瘤细胞。
21. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合多肽是抗体或其抗原结合片段。
22. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合多肽是抗体VH或VL域。
23. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中第一细胞类型和第 二细胞类型是活细胞。”
驳回决定具体指出：1、权利要求1请求保护一种鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，其与对比文件1的区别技术特征为：权利要求1限定了抗原展示在细胞外表面上。该区别技术特征属于本领域的常规技术手段。所以，对于本领域的技术人员而言，在对比文件1的基础上结合本领域的常规技术手段得到权利要求1的技术方案是显而易见的。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、权利要求3请求保护一种鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，其与对比文件1的区别技术特征为：权利要求3的目的在于筛选仅特异性结合第一细胞类型在细胞外表面上展示的细胞表面抗原的结合多肽，而对比文件1在于筛选双特异性的多肽。该区别技术特征属于本领域的常规技术手段。所以，对于本领域的技术人员而言，在对比文件1的基础上结合本领域的常规技术手段得到权利要求3的技术方案是显而易见的。因此，权利要求3不具备专利法第22条第3款规定的创造性。3、从属权利要求2、4-23的附加技术特征或者被对比文件1公开，或者属于本领域的常规技术手段。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，从属权利要求2、4-23也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年07月17日向国家知识产权局提出了复审请求，未对申请文件进行修改，仅在意见陈述书中陈述了本申请的权利要求具备创造性的理由。复审请求人认为：首先，本申请权利要求涉及鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，其中第一细胞类型的外表面上展示的细胞表面抗原与结合多肽的多样化核酸展示文库的文库成员接触并结合。也就是说，被展示的细胞表面抗原为处于天然构象的抗原。而对比文件1实际上代表本申请说明书发明背景部分所述一般采用可溶性抗原的筛选结合多肽的传统方法。本申请对细胞表面抗原在细胞表面上展示以保持其天然构象的要求是本申请与对比文件1常规方法的显著区别。其次，本申请权利要求的方法是在结合到在细胞外表面上展示的靶细胞表面抗原的情境下进行的，进一步要求从该情境适合地分离结合到细胞外表面上展示的靶细胞抗原的至少一个文库成员。而对比文件1实施例3.C中所述抗原在珠上的常规固化足以接触和结合识别多肽，将对比文件1中的抗原在细胞表面上展示会造成维持细胞复杂环境和采用适合分离的很多不必要的负担。所以，本领域技术人员不能从对比文件1和现有技术获得任何动机以使对比文件1的抗原在细胞外表面上展示以结合和识别结合多肽。因此，本申请的权利要求具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年07月31日依法受理了该复审请求，并将其转送至专利实质审查部门进行前置审查。
专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年04月08日向复审请求人发出复审通知书，指出：1、权利要求1请求保护一种鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，其与对比文件1的区别技术特征为：所述抗原为第一细胞类型的外表面上展示的细胞表面抗原，还包括从所述文库分离特异性结合所述第一细胞类型外表面上的所述细胞表面抗原的至少一个文库成员的步骤。该区别技术特征属于本领域的惯用手段。所以，对于本领域的技术人员而言，在对比文件1的基础上结合本领域的惯用手段得到权利要求1的技术方案是显而易见的。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、权利要求3请求保护一种鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，其与对比文件1的区别技术特征为：权利要求3目的在于筛选仅特异性结合在第一细胞类型表面展示的细胞表面抗原的结合多肽，相应的，将结合多肽的多样化核酸展示文库分别与表达细胞表面抗原的第一细胞类型和不表达细胞表面抗原的第二细胞类型接触，并从所述文库中分离对应的文库成员，最终选择特异性结合所述第一细胞类型但不特异性结合所述第二细胞类型的文库成员，而对比文件1的目的在于筛选能结合两个抗原的双特异性的结合多肽。该区别技术特征属于本领域的惯用手段。所以，对于本领域的技术人员而言，在对比文件1的基础上结合本领域的惯用得到权利要求3的技术方案是显而易见的。因此，权利要求3不具备专利法第22条第3款规定的创造性。3、从属权利要求2、4-23的附加技术特征或者被对比文件1公开，或者属于本领域的常规技术手段。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，从属权利要求2、4-23也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。4、合议组针对复审请求人的意见陈述进行了答复。
针对上述复审通知书，复审请求人于2019年06月21日提交了意见陈述书以及权利要求书的全文修改替换页。主要修改涉及：1、将从属权利要求4-6的附加技术特征加入权利要求1中，并在权利要求1中增加新的技术特征“从所述第一细胞类型洗掉未结合的文库成员”以及“通过用合适的限制性核酸内切酶切割所述限制性核酸内切酶位点，通过酶分离结合的文库成员与所述第一细胞类型”；将权利要求1记载的“将结合多肽的多样化核酸展示文库与第一细胞类型的外表面上展示的细胞表面抗原接触”修改为“将结合多肽的多样化核酸展示文库与第一细胞类型的外表面上天然表达的细胞表面抗原接触”，将记载的“从所述文库分离特异性结合所述第一细胞类型外表面上的所述细胞表面抗原的至少一个文库成员，由此鉴别特异性结合所述细胞表面抗原的结合多肽”修改为“从所述文库分离至少一个特异性结合所述第一细胞类型的外表面上的细胞表面抗原的文库成员，从而鉴别特异性结合所述细胞表面抗原的结合多肽”；2、将权利要求2记载的“所述结合多肽的多样化核酸展示文库与第二细胞类型接触，所述第二细胞类型不展示在所述外表面上展示的所述抗原”修改为“所述结合多肽的多样化核酸展示文库与第二细胞类型接触，所述第二细胞类型不展示在所述外表面上展示的所述抗原，并且分离结合所述第二细胞类型的文库成员并将其从所述多样化核酸展示文库的未选择前体中除去，以产生步骤(a)中使用的所述多样化核酸展示文库”；3、将权利要求3修改为引用权利要求1，并将其记载的步骤“a.将结合多肽的多样化核酸展示文库与表达细胞表面抗原的第一细胞类型接触，并从所述文库分离特异性结合所述第一细胞类型的至少一个文库成员”删除；4、删除权利要求4-10、15-18，并适应性调整部分权利要求的编号及引用关系。
答复复审通知书时提交的权利要求书如下：
“1. 一种鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，所述方法包括：
(a)将结合多肽的多样化核酸展示文库与第一细胞类型的外表面上天然表达的细胞表面抗原接触；其中所述多样化核酸展示文库是DNA展示文库，其中所述DNA展示文库的每个成员包含通过插入式DNA接头连接到编码所述结合多肽的DNA编码序列的结合多肽，其中所述DNA接头包含不存在于所述DNA展示文库的成员的编码序列中的限制性核酸内切酶位点；
(b)从所述第一细胞类型洗掉未结合的文库成员；
(c)通过用合适的限制性核酸内切酶切割所述限制性核酸内切酶位点，通过酶分离结合的文库成员与所述第一细胞类型，和
(d)从所述文库分离至少一个特异性结合所述第一细胞类型的外表面上的细胞表面抗原的文库成员，从而鉴别特异性结合所述细胞表面抗原的结合多肽。
2. 权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前，所述结合多肽的多样化核酸展示文库与第二细胞类型接触，所述第二细胞类型不展示在所述外表面上展示的所述抗原，并且分离结合所述第二细胞类型的文库成员并将其从所述多样化核酸展示文库的未选择前体中除去，以产生步骤(a)中使用的所述多样化核酸展示文库。
3. 权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
(e)将所述结合多肽的多样化核酸展示文库与不表达所述细胞表面抗原的第二细胞类型接触，并从所述文库分离特异性结合所述第二细胞类型的至少一个文库成员；和
(f)选择特异性结合所述第一细胞类型但不特异性结合所述第二细胞类型的文库成员，由此鉴别特异性结合所述细胞表面抗原的结 合多肽。
4. 权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括测定所分离的文库成员的至少一部分的DNA编码序列。
5. 权利要求4所述的方法，其中所述DNA编码序列通过焦磷酸测序测定。
6. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是天然存在的蛋白质、聚糖或脂质。
7. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白。
8. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是正常细胞的疾病相关变异体。
9. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是肿瘤细胞。
10. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合多肽是抗体或其抗原结合片段。
11. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合多肽是抗体VH或VL域。
12. 前述权利要求中任一项所述的方法，其中第一细胞类型和第二细胞类型是活细胞。”
复审请求人认为：对比文件1没有教导或启示包括以下步骤的方法：将结合多肽的多样化核酸展示文库与第一细胞类型的外表面上天然表达的细胞表面抗原接触；其中所述多样化核酸展示文库是DNA展示文库，所述DNA展示文库的每个成员包含通过插入式DNA接头连接到编码所述结合多肽的DNA编码序列的结合多肽，其中所述DNA接头包含不存在于所述DNA展示文库的成员的编码序列中的限制性核酸内切酶位点；通过用合适的限制性核酸内切酶切割所述限制性核酸内切酶位点，通过酶分离结合的文库成员与所述第一细胞类型。本申请教导了通过将完好的文库成员与其所结合的细胞分离，促进回收结合细胞表面抗原的结合多肽，这种多肽回收方法允许快速且完整地回收与细胞上的全部表位结合的文库成员。面对快速分离和鉴定结合细胞表面抗原的文库成员的技术挑战，本领域技术人员没有动机改变对比文件1的教导以获得本申请修改后的权利要求。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人在答复复审通知书时提交了权利要求书的全文修改替换页，经审查，该修改符合专利法第33条的规定。本复审请求审查决定所针对的文本为：2019年06月21日提交的权利要求第1-12项；进入中国国家阶段日2016年01月28日提交的国际申请文件中文译文中的说明书第1-11页、说明书附图第1-10页以及说明书摘要。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果权利要求请求保护的技术方案与最接近的现有技术公开的技术方案之间具有区别技术特征，目前没有证据表明该区别技术特征属于本领域的公知常识，且该区别技术特征使权利要求的技术方案产生了有益效果，则该权利要求具备创造性。
具体到本案：
1）权利要求1请求保护一种鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，对比文件1为最接近的现有技术，其公开了一种筛选稳定的VH/VL对的方法，包括如下步骤（参见说明书第3页第1行-第4页第19行，第6页第9-18行，第9页第12行-第11页第9行）：
（1）提供可特异性结合抗原的VH域；
（2）将所述VH域与VL域的文库相连，形成VH/VL文库；所述VH域和VL域是多肽，所述文库为核酸展示文库，可以是dsDNA展示文库（参见说明书第4页第16-17行），由此可见，对比文件1公开的VH/VL文库为结合多肽的多样化核酸展示文库；
（3）将所述VH/VL文库与抗原接触；
（4）筛选至少一个特异性结合所述抗原的文库成员，进而筛选得到稳定的VH/VL对（相当于鉴别特异性结合所述抗原的结合多肽）。
权利要求1与对比文件1的区别技术特征为：所述抗原为第一细胞类型的外表面上天然表达的细胞表面抗原；所述DNA展示文库的每个成员包含通过插入式DNA接头连接到编码所述结合多肽的DNA编码序列的结合多肽，其中所述DNA接头包含不存在于所述DNA展示文库的成员的编码序列中的限制性核酸内切酶位点；还包括步骤：(b)从所述第一细胞类型洗掉未结合的文库成员；(c)通过用合适的限制性核酸内切酶切割所述限制性核酸内切酶位点，通过酶分离结合的文库成员与所述第一细胞类型，和 (d)从所述文库分离至少一个特异性结合所述第一细胞类型的外表面上的细胞表面抗原的文库成员，从而鉴别特异性结合所述细胞表面抗原的结合多肽。
基于上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题是：如何鉴别特异性结合在细胞外表面上天然表达的细胞表面抗原。
关于上述区别技术特征，首先，在对比文件1中，其实际上涉及采用可溶性抗原筛选结合多肽的传统方法（如对比文件1说明书实施例3.C所述），其所针对的抗原并不是细胞表面天然表达的抗原，也不涉及多肽与细胞表面抗原具体的结合和分离步骤，所以，对比文件1不能给出筛选能够特异性结合细胞表面抗原整套流程的技术启示。
驳回决定和前置审查意见认为：对比文件1已经公开了将结合多肽的dsDNA展示文库与细胞表面抗原PDGFRβ接触，筛选分离文库成员的发明构思，在此基础上，本领域技术人员可以将所述筛选方法应用于各种状态的靶抗原上。而对活细胞表面抗原抗体的特异性来实现检测是本领域的常规技术手段。
对此，合议组认为：首先，在修改后的权利要求1中，已经限定了筛选能够特异性结合细胞表面抗原的整套方法，其针对的对象为细胞表面天然表达的抗原，所述方法包括多肽与细胞表面抗原具体的结合和分离步骤。而对比文件1涉及采用可溶性抗原筛选结合多肽的传统方法，其与本申请所针对的抗原不同，相应的也不涉及多肽与可溶性抗原具体的结合与分离步骤。其次，可溶性抗原与表达于细胞表面的天然抗原性质并不相同，在仅公开鉴别能够结合可溶性抗原的多肽的基础上，本领域技术人员不容易想到将该方法用于鉴别能够结合细胞表面天然抗原的多肽，更不容易想到将多肽结合于天然抗原表面的具体方法以及分离与天然抗原特异性结合的多肽的具体方法。
目前，尚没有证据证明上述区别技术特征属于本领域的公知常识，且上述区别技术特征使得本申请的技术方案能够获得快速分离和鉴定能够结合细胞表面天然抗原的文库成员的技术效果。
所以，对于本领域的技术人员而言，在对比文件1的基础上结合本领域的公知常识不能显而易见的得到权利要求1的技术方案。因此，权利要求1具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2）权利要求2-12直接或间接从属于权利要求1，在权利要求1具备创造性的基础上，权利要求2-12也具备专利法第22条第3款规定的创造性。
三、决定
撤销国家知识产权局于2018年04月02日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局专利实质审查部门在本复审请求审查决定所依据的文本的基础上对本申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本复审请求审查决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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