发明创造名称：一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因及其应用
外观设计名称：
决定号：189312
决定日：2019-09-09
委内编号：1F280150
优先权日：
申请（专利）号：201810028794.0
申请日：2018-01-11
复审请求人：内蒙古大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：韩世炜
合议组组长：杨莹跃
参审员：吴文英
国际分类号：C12N15/12，C12N15/85，A01K67/027
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果发明是在现有技术中所公开的可能的、有限的范围内进行的选择，而这些选择可由本领域的技术人员常规获得并且没有产生预料不到的技术效果，则该发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201810028794.0，名称为“一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因及其应用”的发明专利申请。申请人为内蒙古大学。本申请的申请日为2018年01月11日，公开日为2018年09月21日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2019年03月29日以本申请权利要求1-6不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为：申请日提交的说明书第1-146段、说明书摘要、摘要附图，申请日提交的初审依职权修改的说明书附图图1-图13，2019年03月15日提交的权利要求1-6项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 获得能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因的方法，该方法包括以下步骤：一、MSTN靶位点设计与合成；二、切割载体构建；三、获得基因敲除细胞；
所述能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因包含两个内含子和三个外显子序列，第一内含子上有部分碱基缺失；
所述切割载体构建步骤包括：在设计好的gRNA两端添加酶切位点Bsmb1，进行合成，得到带有粘性末端的双链gRNA序列即g1合g2，连入pCas-Guide载体，构建好pCas-Guide-gRNA即g1、g2载体并测序得到正确载体；
所述获得基因敲除细胞步骤为如下：将2μl质粒DNA即1μl pCas-Guide-gRNA质粒，和1μl Donor sequence质粒，用100μl opti-MEM稀释，加入2μl Plus液体，混匀后室温静置5min；在将3μl LTX用100μl opti-MEM稀释，加入DNA液体中，混匀，室温静置30min。30min后将DNA-LTX复合物添加到培养在24孔板中的鲁西黄牛胎儿成纤维细胞上，在37℃下，培养箱中孵育6h后更换正常细胞培养液，24小时检查转染情况，48小时将转染的细胞消化成细胞悬液，并通过流式细胞仪分选单细胞，培养在96孔板中，将能够长满孔的细胞分别传代至24孔板，取5000个细胞用于基因型鉴定；
在所述正常细胞培养液中加入下式(I)所示的培养诱导物：
其中R为乙基或异丙基或羟基，该培养诱导物在正常细胞培养液中的浓度为0.00001mol/L-0.01mol/L，该培养诱导物通过蒸馏提取和柱层析分离方法提取自菊科植物。
2. 根据权利要求1的方法获得的一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因，所述基因包含两个内含子和三个外显子序列，第一内含子上有部分碱基缺失。
3. 一种含有根据权利要求2所述的肌肉抑制素基因的序列的切割载体。
4. 根据权利要求3所述的载体在制备转基因牛或MSTN生物体性状研究中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其中所述载体用于制备转基因牛。
6. 根据权利要求5所述的应用，所述的载体用于增加牛骨骼肌的肌肉量，产生双肌现象。”
驳回决定认为：对比文件1（“CRISPR/Cas9技术在制备牛Myostatin基因敲除细胞株上的应用”，杨宇，中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑，2016年第4期，A006-200，公开日期2016年04月15日）公开了CRISPR/Cas9技术制备牛肌肉抑制素(Myostatin)基因敲除细胞株的方法,权利要求1与其相比区别在于：1）两者涉及的靶位点存在差别，2）本申请限定了引物合成步骤，切割载体构建步骤及获得基因敲除细胞的步骤存在差别。基于此权利要求1所要解决的技术问题是寻找另一种在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因的方法。对于区别特征1），牛肌肉抑制素基因的第一内含子（如现有技术1：“草原红牛肌生成抑制素基因内含子1多态性及部分屠宰性状的相关性分析”，公开日期2010年11月30日）、第一外显子（现有技术2：“Efficient Generation of Myostatin (MSTN) Biallelic Mutations in Cattle Using Zinc Finger Nucleases”，Junjie Luo等，PLOS ONE，第9卷第4期，e95225，公开日期2014年04月17日，其敲除位点同本申请相同）等其他部分均存在有义突变，会对该基因的表达水平产生影响，本领域技术人员面对对比文件1公开的内容结合本领域现有技术，采用其他位点碱基缺失进行尝试是容易做到的，其效果可以预期。对于区别特征2），引物设计后进行合成是必然步骤。切割载体构建步骤及获得基因敲除细胞的步骤在现有技术中广泛公开。如对比文件2（CN107034221A，公开日期2017年08月11日）具体公开了构建切割载体的方法；对比文件3（“牛肌肉卫星细胞中抑制MSTN表达后对脂肪代谢相关基因的影响”，胡思敏，中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑，2016年第1期，D050-74，公开日期2016年01月15日）公开了牛肌肉卫星细胞中抑制MSTN表达的方法；虽然细节参数上存在一些差别，但根据质粒的类型进行参数调整是容易做到的。至于流式细胞仪分选后的培养、传代及鉴定步骤是常规操作。对于细胞培养液中的添加组分，作为本领域公知常识，杭白菊等菊花提取的黄酮类化合物具有抗氧化等功能，可用于添加到细胞的体外培养体系中（如参考文献1：《浙江优势药用资源研究》，第56-57页，公开日期2015年1月），而细胞培养基中的抗氧化物也是常见的组分之一，本领域技术人员为了获得较好的细胞培养效果将菊花提取的黄酮类化合物作为抗氧化成分添加到培养基中容易想到，蒸馏、层析等为常见的植物有效组分提取方法，其具体的添加浓度容易确定。虽然上述步骤在不同的对比文件公开，但其在相应的对比文件中均用于敲除MSTN的部分碱基，且上述方法均有普遍适用性。本领域技术人员基于对比文件1公开的内容，选取现有技术中公开的其他部分碱基缺失的肌肉抑制素基因的方法是容易想到的。综上，权利要求1不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。在权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2-6请求保护基因、切割载体以及应用也不具备创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2019年04月22日向国家知识产权局提出了复审请求，同时修改了权利要求书(共2页6项)，其中在权利要求1中进一步限定了所述方法还包括基因敲除细胞的鉴定步骤及其具体操作（步骤四）。复审请求时新修改的权利要求1如下：
“1. 获得能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因的方法，该方法包括以下步骤：一、MSTN靶位点设计与合成；二、切割载体构建；三、获得基因敲除细胞；
所述能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因包含两个内含子和三个外显子序列，第一内含子上有部分碱基缺失；
所述切割载体构建步骤包括：在设计好的gRNA两端添加酶切位点Bsmb1，进行合成，得到带有粘性末端的双链gRNA序列即g1合g2，连入pCas-Guide载体，构建好pCas-Guide-gRNA即g1、g2载体并测序得到正确载体；
所述获得基因敲除细胞步骤为如下：将2μl质粒DNA即1μl pCas-Guide-gRNA质粒，和1μl Donor sequence质粒，用100μl opti-MEM稀释，加入2μl Plus液体，混匀后室温静置5min；在将3μl LTX用100μl opti-MEM稀释，加入DNA液体中，混匀，室温静置30min，30min后将DNA-LTX复合物添加到培养在24孔板中的鲁西黄牛胎儿成纤维细胞上，在37℃下，培养箱中孵育6h后更换正常细胞培养液，24小时检查转染情况，48小时将转染的细胞消化成细胞悬液，并通过流式细胞仪分选单细胞，培养在96孔板中，将能够长满孔的细胞分别传代至24孔板，取5000个细胞用于基因型鉴定；
在所述正常细胞培养液中加入下式(I)所示的培养诱导物：
其中R为乙基或异丙基或羟基，该培养诱导物在正常细胞培养液中的浓度为0.00001mol/L-0.01mol/L，该培养诱导物通过蒸馏提取和柱层析分离方法提取自菊科植物；
所述方法还包括步骤四：基因敲除细胞鉴定，该步骤包括：
(1)提取细胞基因组
收集细胞于EP管中，加细胞裂解液，室温震荡，冰浴，加入终止液，离心，将上清液转移至新EP管中，并加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混合均匀，室 温静置，离心，弃去上清，在白色沉淀中加入70％浓度乙醇溶液，上下颠倒洗涤数次，离心，弃去乙醇，室温干燥，加入适量的无酶水溶解沉淀，保存DNA于-20℃；
(2)MSTN基因型分析
通过PCR的方法，克隆MSTN基因的部分序列，测序分析基因敲除细胞的基因型；
引物序列为如下：
MSTN上：TTTAATATTAAAGTAGGATTTTCATTATGTG
MSTN下：CATTACCTAAGTTAACTCCTGTTAAAG
PCR体系为如下：
退火温度是55℃，PCR产物为约4000bp；
通过PCR产物测序，分析出在第一内含子1-6位碱基缺失的细胞株。”
复审请求人认为，（1）对比文件1是制备牛基因敲除细胞株应用，对比文件2涉及小鼠体内表达的部分碱基缺失肌肉抑制素基因及其应用，二者技术领域不同，没有动机进行结合。此外，二者酶切位点完全不同，酶切位点与应用对象密切相关，不是本领域技术人员容易选取的。（2）在权利要求1中，限定了所述方法还包括步骤四即基因敲除细胞鉴定，还限定了其具体制备步骤和参数，如何选择这样的引物序列和PCR体系，并非本领域技术人员的任意选择。（3）在权利要求1中，限定了切割载体构建和获得基因敲除细胞具体步骤和工艺参数。具体制备步骤和参数不是本领域技术人员通过有限的试验能够确定的或者常规技术手段，本发明中所述步骤和参数是针对本申请如何获得能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因所特定选择的。在所述正常细胞培养液中加入式(I)所示的培养诱导物，现有技术中也没有任何证据表明将该培养物用于获得基因敲除细胞方法，其也不是本领域技术人员容易想到的或常规技术手段，该诱导物的加入对于获得基因敲除细胞步骤有非常好的效果，能够大幅提高细胞培养的可靠性，并且能够使培养时间缩短20-30％。（4）本领域技术人员没有预期到DTPA能够更有效抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏。综上，上述选择是需要付出创造性劳动才能实现的，本申请具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年04月26日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，虽然复审请求人增加了权利要求1的步骤限定，但提取细胞基因组和PCR扩增测序分析基因型的步骤是常规手段。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年06月28日向复审请求人发出复审通知书，指出：本申请权利要求1同对比文件1公开的内容相比区别在于：1）两者涉及的靶位点不同，2）本申请限定的切割载体及其构建步骤、获得基因敲除细胞步骤、基因敲除细胞的鉴定步骤及其中的参数存在差别，3）权利要求1限定了在正常细胞培养液中加入式（I）所示的培养诱导物。基于区别技术特征，本申请权利要求1所要解决的技术问题是，提供一种缺失位点不同的在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因的方法。
对于区别特征1），对比文件1中已公开了哺乳动物MSTN缺失或失活或出现肌纤维直径变大或肌纤维数增加，导致肌肉过度发育的现象；自然诱变或者基因编辑都可以使MSTN基因反生功能性障碍，使动物出现“双肌”的性状，对比文件1也公开了根据预测靶位点网站对MSTN基因进行靶位点预测，设计相应引物；而且现有技术中（参见现有技术2）已知小牛中MSTN的内含子1缺失（其所针对的位点同本申请相同）的突变小牛在一个月大时表现出双肌肉表型，并且组织学检查显示肌纤维肥大，相对于野生（WT）对照小牛的肌肉纤维肥大（参见图4）。因此，基于现有技术的教导，选择MSTN基因的不同靶点，例如内含子1作为靶点进行尝试是本领域技术人员容易想到的。对于区别特征2），确定靶点后，切割载体构建步骤及获得基因敲除细胞、基因敲除细胞的鉴定步骤均为本领域常规技术手段，有些步骤可按照试剂盒的要求进行操作。引物合成、切割载体构建步骤及获得基因敲除细胞的步骤在现有技术中广泛公开，如对比文件2具体公开了一种构建切割载体的方法；对比文件3公开了牛肌肉卫星细胞中抑制MSTN表达的方法。虽然详细参数与权利要求1存在一些差别，但根据质粒的类型对这些参数进行调整是本领域技术人员容易想到的。引入两侧含断裂区域同源序列的转基因（即本申请中的Donor Sequence）以精确置换或敲除靶位点也是应用CRISPR/Cas系统时的常规操作方式。采用流式细胞仪进行单细胞分选，以及其后的培养、传代等步骤均是常规操作。对于基因敲除细胞的鉴定，提取基因组、根据靶基因设计引物并通过PCR的方法克隆靶基因并测序分析是本领域的常规技术手段，PCR的体系或参数可参照市售试剂盒的指示设置或可由本领域技术人员常规调整获得。对于区别特征3），作为本领域公知常识，杭白菊等菊花提取的黄酮类化合物具有抗氧化等功能，可用于添加到细胞的体外培养体系中（如参考文献1），本申请对于式（I）所示的培养诱导物在说明书中仅作了泛泛说明（参见第0028-0031段），并未确认诱导物的具体结构，如取代基R的具体基团，也未对其效果进行对照验证，在实施例中也未记载在细胞培养时添加了所述诱导物，本领域技术人员不能确认其具备“诱导物的加入对于获得基因敲除细胞步骤有非常好的效果，能够大幅提高细胞培养的可靠性，并且能够使培养时间缩短20-30％”的效果，因此，结合上述公知常识，该诱导物仅能认为是一种体外培养体系的常规添加成分。综上，本领域技术人员基于对比文件1公开的内容，结合对比文件2、对比文件3及本领域常规技术手段，得到权利要求1的技术方案是显而易见的，且本申请也未取得预料不到的技术效果，因此权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。在权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2-6也不具备创造性。
对于复审请求人的意见，合议组指出，（1）对比文件1涉及的也是采用CRISPR/Cas9方法对相同的基因MSTN进行突变，对比文件2虽然涉及小鼠体内表达的部分碱基缺失肌肉抑制素基因及其应用，但其同样需要构建切割载体，而且切割载体的目的也同样是用于敲除MSTN基因，本领域技术人员有动机借鉴对比文件２中的载体构建方式。对于酶切位点，可由本领域技术人员根据靶位点和载体的具体序列常规选择。(2)基因敲除细胞鉴定的步骤实际就是对转染后的细胞后靶基因的序列进行检测，对比文件1中也已公开了类似步骤，提取基因组、设计相应引物以及利用PCR方法对靶基因进行扩增并检测是本领域的常规技术手段。（3）对于切割载体构建和获得基因敲除细胞具体步骤和工艺参数，对比文件2和对比文件3已经公开了相近的步骤和参数，而且所述手段在对比文件2和对比文件3中的目的和本申请相同，本领域技术人员有动机采用所述手段，而且有能力在此基础上进行适应性地调整。至于式（I）的诱导物，如前所述，本申请并未对其进行效果方面的验证，其效果仅能认为属于常规添加的培养物成分。（4）本申请权利要求中并未限定DTPA，说明书中也仅泛泛说明DTPA相对于EDTA用量减少，但实施例中使用的也是EDTA，并未涉及DTPA。况且，EDTA与DTPA均属于常见的螯合剂，本领域技术人员可进行常规替换。
复审请求人于2019年07月29日提交了意见陈述书，并修改了权利要求书（共2页6项），其中将权利要求1中式（I）的R基团限定为乙基。复审请求人认为：（1）对于式（I）诱导物的效果，审查指南中并没有规定必须在具有对照验证的情况下才能够确认效果；复审请求人提供对照验证实验证明当正常细胞培养液中加入所述式（I）所示诱导物时，细胞培养时间缩短了25%。从杭白菊提取的黄酮类化合物具有抗氧化性本身是公知的，但是这并不代表将这样的化合物应用于培养基来解决本发明的技术问题是公知的；现有技术中未给出将这类特定的黄酮应用于培养基中的技术启示。(2)本领域技术人员在不存在尝试动机、不知晓尝试方向和尝试后果的情况下，难以选择出本申请的靶位点；现有技术2为期刊文献，不是审查指南规定的工具书和教科书，因此不能作为本领域的公知常识性证据来使用；对于所述期刊文献而言，应当总体考虑全部位点，不应该选择性地选择出与本申请相同的位点，这种割裂性选择未考虑技术特征之间的关联性以及技术方案的整体性。（3）本领域技术人员没有动机将对比文件2与对比文件1结合，即使将对比文件1和2结合也无法获得本申请权利要求1的技术方案：对比文件1是制备牛基因敲除细胞株应用，对比文件2涉及小鼠体内表达的部分碱基缺失肌肉抑制素基因及其应用，这是两个完全不同的技术领域；二者酶切位点完全不同，对比文件2的酶切位点无法应用到对比文件1；二者存在诸多差异，例如酶切位点与应用对象密切相关，不是本领域技术人员容易选取的。（4）在权利要求1中，限定了所述方法还包括步骤四即基因敲除细胞鉴定，还限定了其具体制备步骤和参数。所有对比文件都没有公开上述技术特征，现有技术中也没有任何证据表明所述技术特征是本领域的常用技术手段或公知常识，现有技术同样也没有给出任何相应的技术启示或教导。例如：现有技术未给出使用所述引物序列（MSTN上：TTTAATATTAAAGTAGGATTTTCATTATGTG，和MSTN下：CATTACCTAAGTTAACTCCTGTTAAAG）以及PCR体系的任何技术启示或教导。（5）在权利要求1中，限定了“二、切割载体构建；三、获得基因敲除细胞”具体步骤和工艺参数。上述具体制备步骤和参数不是本领域技术人员通过有限的试验能够确定的或者常规技术手段，本发明中所述步骤和参数是针对本申请如何获得能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因所特定选择的；在本申请的说明书中明确记载了所述技术特征给能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因的获得带来预料不到的技术效果。（6）DTPA的用量仅仅只需EDTA的1/5-1/10，用量的减少远远超过了二者羧基当量摩尔数的比例，这是本领域技术人员所不可能预期的。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人于2019年07月29日提交了权利要求书全文替换页（共2页6项）。经审查，所述修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审决定所依据的文本为：申请日2018年01月11日提交的说明书第1-146段、说明书摘要、摘要附图、经初审依职权修改的说明书附图图1-图13，2019年07月29日提交的权利要求第1-6项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果发明是在现有技术中所公开的可能的、有限的范围内进行的选择，而这些选择可由本领域的技术人员常规获得并且没有产生预料不到的技术效果，则该发明不具备创造性。
权利要求1请求保护获得能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因的方法。对比文件1公开了利用CRISPR/Cas9技术制备牛Myostatin基因敲除细胞株，其中公开了根据预测靶位点网站（http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx）对 MSTN 基因成熟蛋白编码区进行靶位点预测，设计相应引物（参见对比文件1正文第9页第2.2.1.5节、表2-3）；构建切割载体（参见对比文件1正文第10页第2.2.1.6节、图2-1）；获得基因敲除的细胞（参见对比文件1正文第13-14页第2.2.5节），即公开了权利要求1的步骤。另外，对比文件1公开了MSTN基因属于分泌性多肽，具有三个外显子区域和两个内含子区域（参见正文第4页第3段），其选择的A靶点位于第二外显子，B靶点位于第三外显子（参见对比文件1正文第9页表2-3），以PEI法将含CRISPR/Cas9的质粒转入牛胎儿成纤维细胞，提取转染细胞基因组，检测转染细胞的突变效率；经对比后以突变效率最高针对B靶点的psPgRNA-M-B载体和Cas9载体作为制备MSTN突变细胞株的打靶载体，利用电穿孔法转染牛胎儿成纤维细胞，获得了在第三外显子部分缺失的细胞克隆（参见正文第12-14页第2.2.4-2.2.5节；正文第19-20页表3.1）。其中：
构建载体的步骤包括：根据预测靶位点网站对MSTN基因成熟蛋白编码区进行靶位点预测，设计相应引物；将含有引物的退火反应液和psPgRNA、pX330质粒单酶切回收产物进行连接反应，得到载体（参见正文第8-11页第2.2.1节）。
获得基因敲除细胞步骤如下：将牛胎儿成纤维细胞传至6孔板中，待细胞密度达到70%-80%时，进行转染；取24ugCRISPR/Cas9(gRNA和Cas9)的质粒溶于600ulOpti-MEM孵育液中，然后取48ulPEI加入600μL Opti-MEM孵充液中，室温孵充5min；将含PEI的Opti-MEM孵育液600μl加入到含质粒的Opti-MEM孵育液中，均匀混合后室温孵育15min；弃掉6孔板中的培养液，用无血清的DMEM洗两遍，每孔加入1.8mL的加入无双抗的DMEM 10�S培养液，然后均匀吸取混合物每孔缓慢加入孵充后含有CRISPR/Cas9质粒和PEI的溶液200μL,轻轻上下摇匀6孔板；放入37℃ 5% CO2培养箱中培养，72小时后用0.25%胰蛋白酶消化细胞，提取转染细胞基因组。也可以利用电穿孔法转染牛胎儿成纤维细胞，并利用有限稀释法稀释细胞（参见正文第2.2.4.1节、第2.2.5.1、2.2.5.2节）。
基因敲除细胞鉴定的步骤包括：提取细胞基因组，根据基因Genbank已公布的基因序列以及确定的靶点位置，利用Primer5.0设计引物，以提取的细胞全基因组为模板，PCR扩增出目的片段（参见正文第2.2.4.3节、第2.2.5.3节）。
本申请权利要求1同对比文件1公开的内容相比区别在于：1）两者涉及的靶位点不同，2）本申请限定的切割载体及其构建步骤、获得基因敲除细胞步骤、基因敲除细胞的鉴定步骤及其中的参数存在差别，3）权利要求1限定了在正常细胞培养液中加入式（I）所示的培养诱导物。基于区别技术特征，本申请权利要求1所要解决的技术问题是，提供一种缺失位点不同的在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因的方法。
对于区别特征1），对比文件1中已公开了哺乳动物MSTN缺失或失活或出现肌纤维直径变大或肌纤维数增加，导致肌肉过度发育的现象；自然诱变或者基因编辑都可以使MSTN基因反生功能性障碍，使动物出现“双肌”的性状，对比文件1也公开了根据预测靶位点网站对MSTN基因进行靶位点预测，设计相应引物；而且现有技术中（现有技术2）已知小牛中MSTN的内含子1缺失（其所针对的位点同本申请相同）的突变小牛在一个月大时表现出双肌肉表型，并且组织学检查显示肌纤维肥大，相对于WT对照小牛的肌肉纤维肥大（参见图4）。因此，基于现有技术的教导，选择MSTN基因的不同靶点，例如内含子1作为靶点进行尝试是本领域技术人员容易想到的。
对于区别特征2），确定靶点后，切割载体构建步骤及获得基因敲除细胞、基因敲除细胞的鉴定步骤均为本领域常规技术手段，有些步骤可按照试剂盒的要求进行操作。引物合成、切割载体构建步骤及获得基因敲除细胞的步骤在现有技术中广泛公开，如对比文件2具体公开了一种构建切割载体的方法（参见对比文件2说明第3页第4段）：设计好的gRNA两端添加酶切位点并送TaKaRa公司合成，得到带有粘性末端的双链gRNA序列，连入pCas-Guide载体，构建好pCas-Guide-gRNA(A/B/C/D)载体并测序得到正确载体，Cas9载体购自origene公司pCas-Guide cloning kit(SKU GE100001)（参见说明书第0028-0029段）。对于具体的酶切位点，是本领域技术人员根据靶位点和载体的序列进行的常规选择。另外，对比文件3公开了牛肌肉卫星细胞中抑制MSTN表达的方法，具体公开了转染牛胎儿成纤维细胞步骤如下（参见对比文件3正文第21页第2段）:(1)将1μg DNA混于30μl Opti-MEM中,轻轻混匀;(2)振荡混匀plus,取2μl于Opti-MEM中至20μl,加入DNA液体中,混匀,室温静止5分钟;(3)吹吸混匀LTX,稀释LTX 3.5μl于Opti-MEM中至50μl,轻轻混匀;(4)将稀释的LTX加入静置5分钟的DNA-PLUS中,轻轻混匀,室温静止30分钟;贴壁细胞:去除细胞培养液,添加100μl Opti-MEM，并轻轻滴加DNA-LTX液体;(5)上下颠倒旋转,使培养板中的液体混合均匀,37℃转染6小时,更换普通培养液（参见正文第21页第2段）。虽然详细参数与权利要求1存在一些差别，但根据质粒的类型对这些参数进行调整是本领域技术人员容易想到的。引入两侧含断裂区域同源序列的转基因（即本申请中的Donor Sequence）以精确置换或敲除靶位点也是应用CRISPR/Cas系统时的常规操作方式。采用流式细胞仪进行单细胞分选，以及其后的培养、传代等步骤均是常规操作。对于基因敲除细胞的鉴定，提取基因组、根据靶基因设计引物并通过PCR的方法克隆靶基因并测序分析是本领域的常规技术手段，PCR的体系或参数可参照市售试剂盒的指示设置或可由本领域技术人员常规调整获得。
对于区别特征3），作为本领域公知常识，杭白菊等菊花提取的黄酮类化合物具有抗氧化等功能，可用于添加到细胞的体外培养体系中（如参考文献1），本申请对于式（I）所示的培养诱导物在说明书中仅作了泛泛说明（参见第0028-0031段），并未确认诱导物的具体结构，如取代基R的具体基团，也未对其效果进行对照验证，在实施例中也未记载在细胞培养时添加了所述诱导物，本领域技术人员不能确认其具备“诱导物的加入对于获得基因敲除细胞步骤有非常好的效果，能够大幅提高细胞培养的可靠性，并且能够使培养时间缩短20-30％”的效果。因此，结合上述公知常识，该诱导物仅能认为是一种体外培养体系的常规添加成分。虽然修改后的权利要求1中具体限定了取代基为乙基，并提交了补充实验数据，但该实验内容并未记载在说明书中，不能证明本申请在申请日时已验证了取代基为乙基的该诱导物的效果。
综上，本领域技术人员基于对比文件1公开的内容，结合对比文件2、对比文件3及本领域常规技术手段，得到权利要求1的技术方案是显而易见的，且本申请也未取得预料不到的技术效果，因此权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2请求保护权利要求1的方法获得的一种能够在牛体内表达的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因。基于权利要求1的相似评述，当其获得方法不具备创造性时，制备相应的碱基缺失的肌肉抑制素基因是容易做到的。因此，权利要求2不具备创造性。
权利要求3请求保护一种含有根据权利要求2所述的肌肉抑制素基因的序列的切割载体。对比文件1公开了包含其肌肉抑制素基因的序列的切割载体psPgRNA（参见对比文件1正文第10页图2-1）。如前所述，权利要求2涉及的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因不具备创造性，因此，权利要求3也不具备创造性。
权利要求4-6请求保护权利要求3所述切割载体的应用。对比文件1公开了其切割载体转入牛胎儿成纤维细胞（参见对比文件1正文第12页第2段）。并指出其通过制备敲除MSTN基因的细胞株为制备转基因肉牛提供材料，以培育出敲除MSTN基因的出现双肌性状的肉牛（参见对比文件1正文第5页第3-4段）。因此，当权利要求3涉及的切割载体不具备创造性时，上述权利要求也不具备创造性。
对复审请求人答复复审通知书的意见的评述
如前所述，本领域现有技术仅能预期黄酮类化合物具有抗氧化等功能，可用于添加到细胞的体外培养体系中，但并不能预期其能显著缩短细胞培养时间，在此前提下，复审请求人主张所述诱导物的添加带来了上述技术效果，则说明书中应记载充分的实验数据才能使本领域技术人员确信所述效果。但说明书中对于式（I）的化合物为通式表达的多种化合物，并未针对具体诱导物的效果进行实验，甚至在具体实施例的整个过程中均未添加该诱导物，本领域技术人员对其效果不能确认，该效果不能成为判断本申请是否具备创造性的基础和依据。补充实验数据提交的时间在申请日后，不能表明本申请在申请日时已验证所述效果，不能用于证明本申请的创造性。(2)对比文件1中已公开了MSTN基因具有三个外显子区域和两个内含子区域，也公开了根据预测靶位点网站对MSTN基因进行靶位点预测，在此基础上有动机对不同区域的靶点进行尝试。权利要求1中并未具体限定具体的位点，其限定的“第一内含子上有部分碱基缺失”为较宽泛的范围，这是本领域技术人员容易选择得到的。而现有技术（现有技术2）针对的具体位点都和本申请说明书中一致，是用于向复审请求人说明，即使限定到具体位点，该位点的选择也是本领域中已经尝试过的。（3）对比文件1和对比文件2均涉及MSTN基因部分碱基敲除的技术及其应用，对比文件1中需要制备切割载体，而对比文件2中公开了制备切割载体的方法，本领域技术人员有动机将对比文件2与对比文件1结合。酶切位点的选择及调整是本领域技术人员采用常规技术手段能够实现的。（4）对于基因敲除细胞的鉴定，提取基因组、根据靶基因设计引物并通过PCR的方法克隆靶基因并测序分析是本领域的常规技术手段，PCR的体系或参数可参照市售试剂盒的指示设置或可由本领域技术人员常规调整获得。对于引物的设计，现有技术中有成熟的设计原则，例如长度、GC含量等方面的考虑，以及引物设计辅助软件，均是本领域的常规技术手段。（5）“切割载体构建”、“获得基因敲除细胞”中限定的具体步骤和工艺参数，是本领域技术人员根据常规技术手段容易调整的，而且本申请获得的部分碱基缺失的肌肉抑制素基因所具有的能使小牛肌肉量增大、体重增加的效果也是本领域技术人员可以预期的，并不属于预料不到的技术效果。（6）DTPA并未限定在权利要求中，不能为权利要求带来创造性。综上，复审请求人的理由不具有说服力。
基于以上事实和理由，合议组作出如下复审决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2019年03月29日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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