发明创造名称：能够使甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接脱帽并使磷酸化的N-聚糖脱甘露糖基化的甘露糖苷酶及促进糖蛋白的哺乳动物细胞摄取的方法
外观设计名称：
决定号：189117
决定日：2019-09-06
委内编号：1F231694
优先权日：
申请（专利）号：201180057437.3
申请日：2011-09-29
复审请求人：奥克西雷恩英国有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：杨振宇
合议组组长：李晨
参审员：王金凤
国际分类号：C12P19/26，C12P21/00，A61K38/43，C12N9/10，C12N15/81
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：在所要求保护的技术方案与最接近的现有技术存在区别特征的情况下，如果现有技术中不存在将所述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其实际技术问题的启示，则所要求保护的技术方案是非显而易见的，具有创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201180057437.3，名称为“能够使甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接脱帽并使磷酸化的N-聚糖脱甘露糖基化的甘露糖苷酶及促进糖蛋白的哺乳动物细胞摄取的方法”的发明专利申请。申请人为奥克西雷恩英国有限公司。本申请的申请日为2011年09月29日，最早优先权日为2010年09月29日，公开日为2013年09月25日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年05月26日发出驳回决定，以权利要求1-35不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请，其理由是：权利要求1要求保护一种在糖蛋白上使甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块脱帽并使磷酸化N-聚糖脱甘露糖基化的方法。对比文件1（CN1541275A，公开日2004年10月27日）公开了一种使用酵母生产活性形式糖蛋白的方法，其中所述活性形式糖蛋白具有在非还原端携带甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链，所述糖蛋白是溶酶体酶；所述甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链可以结合甘露糖-6-磷酸酯受体；所述方法允许α-甘露糖苷酶作用于上述酵母产生的糖蛋白，从而从糖链中的甘露糖-1-磷酸酯键除去甘露糖残基（对应本申请所述“脱帽”）；所述α-甘露糖苷酶具有从甘露糖-1-磷酸酯键除去甘露糖残基的活性，具有非特异性破坏α-1,2，α-1,3和α-1,6甘露糖苷键的活性（对应本申请所述“脱甘露糖基化”），所述α-甘露糖苷酶活性是外切型活性，并且不包含内切型活性。可见，对比文件1实质上公开了一种在糖蛋白上使甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块脱帽并使磷酸化N-聚糖脱甘露糖基化的方法。权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别在于：权利要求1中限定了采用单一的甘露糖苷酶。基于上述区别技术特征，本申请要求保护的技术方案实际解决的技术问题是提供一种同时具备脱帽和脱甘露糖基化的甘露糖苷酶。对比文件1还公开了需要使用的可能的α-甘露糖苷酶包括刀豆α-甘露糖苷酶（属于家族38糖基水解酶）和来自酵母液泡的甘露糖苷酶，即教导了可采用刀豆α-甘露糖苷酶和来自酵母液泡的甘露糖苷酶产生上述活性糖蛋白；而且基于方便操作、易于分析等本领域的普遍需求，本领域技术人员有动机优先选择单一酶进行反应。对于刀豆α-甘露糖苷酶，对比文件1实施例3进一步公开了刀豆α-甘露糖苷酶能将具有甘露糖-1-磷酸酯键的糖链的峰B和峰C进行消化，从甘露糖-1-磷酸酯残基上切下甘露糖部分。可见，对比文件1通过实验验证了刀豆α-甘露糖苷酶具备降解甘露糖-1-磷酸酯键（即“脱帽”）的功能。而对比文件1还公开了所述糖蛋白是溶酶体酶，可以是α-半乳糖苷酶、β-己糖胺酶A、β-己糖胺酶A和B、半乳糖脑苷脂酶、α-艾杜糖苷酸酶、β-葡糖苷酸酶、岩藻糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶等。在此基础上，本领域技术人员有动机将对比文件1公开的刀豆α-甘露糖苷酶和来自酵母液泡的甘露糖苷酶应用于上述溶酶体酶以及其它相关的糖蛋白；而验证其效果并不需要本领域技术人员付出创造性的劳动。此外，尽管对比文件1的实施例4中采用刀豆α-甘露糖苷酶并未对α-半乳糖苷酶上的甘露糖-1-磷酸酯键进行切割，但是该结果并不影响本领域技术人员基于实施例3的实验结果尝试用该酶或来自于酵母液泡的甘露糖苷酶作用于其它的糖蛋白；即，结合实施例3和4的结果仅表明刀豆α-甘露糖苷酶无法对α-半乳糖苷酶进行脱帽，但是并不能以此证明刀豆α-甘露糖苷酶对所有类型的糖蛋白均不具备脱帽活性。由此可知，在对比文件1的基础上得出本申请权利要求1所要求保护的技术方案，对本领域的技术人员来说是显而易见的，其技术效果也是本领域技术人员能够预期的。因此权利要求1所要求保护的技术方案不具备专利法第22条第3款规定的创造性。基于相类似的理由，权利要求2-35对于本领域技术人员而言也是显而易见的，不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
驳回决定所依据的文本为：2013年05月29日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请中文译文的说明书第1-237段（第1-54页）、说明书附图图1A-图22、说明书摘要，依据专利合作条约第28条或者第41条修改的说明书核苷酸和氨基酸序列表；2016年12月22日提交的权利要求第1-35项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种在糖蛋白上使甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块脱帽并使磷酸化N-聚糖脱甘露糖基化的方法，所述方法包括：
a)提供所述糖蛋白，该糖蛋白具有含有所述甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块的磷酸化的N-聚糖；并
b)使所述糖蛋白与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷酶作为单一酶(i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷酸，并且(ii)水解末端alpha-1,2甘露糖、alpha-1,3甘露糖和/或alpha-1,6甘露糖连接，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
2. 一种使磷酸化的N-聚糖脱甘露糖基化的方法，所述方法包括：
a)提供包含磷酸化的N-聚糖的糖蛋白；并
b)使所述糖蛋白与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷酶作为单一酶(i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷酸，并且(ii)水解末端alpha-1,2甘露糖、alpha-1,3甘露糖和/或alpha-1,6甘露糖连接，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
3. 权利要求1-2中任一项的方法，其中所述甘露糖苷酶来自直生刀豆(Canavalia ensiformis)。
4. 权利要求1-2中任一项的方法，其中所述甘露糖苷酶来自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，所述方法进一步包括在步骤(a)和(b)后，使哺乳动物细胞与所述糖蛋白接触，所述糖蛋白包含所述脱甘露糖基化的磷酸化的N-聚糖，其中在所述接触后，所述糖蛋白转运到所述哺乳动物细胞的内部。
6. 权利要求5的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
7. 一种将糖蛋白引导至哺乳动物细胞内部的方法，所述方法包括：
a)提供具有磷酸化的N-聚糖的糖蛋白，所述磷酸化的N-聚糖包含通过alpha 1,2连接与下层甘露糖残基结合的末端甘露糖残基，其中所述下层甘露糖在第6位被磷酸化，与所述下层甘露糖结合的磷酸根残基是脱帽的，且所述糖蛋白实质上不结合所述细胞上的甘露糖-6-磷酸受体；b)使所述糖蛋白与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷酶作为单一酶在下层甘露糖被磷酸化时水 解末端alpha-1,2甘露糖连接和使与甘露糖残基的第6位结合的磷酸根残基脱帽以生成脱甘露糖基化的糖蛋白，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶，其中在所述脱甘露糖基化后的所述糖蛋白实质上结合所述细胞上的所述甘露糖-6-磷酸受体；并
c)使所述细胞与所述脱甘露糖基化的糖蛋白接触。
8. 权利要求7的方法，其中所述甘露糖苷酶来自直生刀豆或解脂耶氏酵母。
9. 一种将糖蛋白从实质上不结合哺乳动物细胞上的甘露糖-6-磷酸受体的第一形式转化成实质上确实结合哺乳动物细胞上的甘露糖-6-磷酸受体的第二形式的方法，其中在所述第一形式中，所述糖蛋白包含一个或多个N-聚糖，该N-聚糖各自含有在第1位与在第6位含有磷酸根残基的下层甘露糖残基连接的一个或多个末端甘露糖残基，且所述磷酸根残基是脱帽的，所述方法包括使所述糖蛋白的所述第一形式与作为单一酶除去所述一个或多个末端甘露糖残基并使与甘露糖残基的第6位结合的磷酸根残基脱帽的甘露糖苷酶接触，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
10. 权利要求9的方法，其中所述甘露糖苷酶来自直生刀豆或解脂耶氏酵母。
11. 一种将糖蛋白引导至哺乳动物细胞内部的方法，所述糖蛋白包含甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块，其中在第6位结合磷酸根残基的甘露糖残基在末端甘露糖残基的第1位与末端甘露糖残基连接，所述方法包括使所述细胞在所述糖蛋白经历下列步骤后与其接触：
(a)在所述糖蛋白上使所述甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块脱帽成甘露糖-6-磷酸；并
(b)除去所述末端甘露糖残基，
其中已经经历(a)而非(b)或(b)而非(a)的所述糖蛋白实质上不结合所述细胞上的甘露糖-6-磷酸受体，
其中经历(a)和(b)的所述糖蛋白实质上确实结合所述细胞上的甘露糖-6-磷酸受体；且
其中通过单一酶催化步骤(a)和(b)，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
12. 权利要求1-11中任一项的方法，其中所述糖蛋白是人蛋白质。
13. 权利要求1-11中任一项的方法，其中所述糖蛋白是病原体蛋白质、溶酶体蛋白质、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段、或融合蛋白。
14. 权利要求13的方法，其中所述溶酶体蛋白质是溶酶体酶。
15. 权利要求14的方法，其中所述溶酶体酶是酸性alpha葡糖苷酶或alpha半乳糖苷酶。
16. 权利要求1-15中任一项的方法，其中所述糖蛋白与LSD有关。
17. 权利要求16的方法，其中所述LSD是法布里(Fabry)氏病、粘多糖贮积症I、法韦尔(Farber)病、戈谢(Gaucher)病、GM1-神经节苷脂贮积病(gangliosidosis)、泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)、桑德霍夫(Sandhoff)病、GM2激活物病(GM2activator disease)、克拉伯(Krabbe)病、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)、尼曼-皮克(Niemann-Pick)病、沙伊(Scheie)病、亨特(Hunter)病、桑菲列普(Sanfilippo)病、莫尔丘(Morquio)病、马-拉(Maroteaux-Lamy)病、透明质酸酶缺乏、天冬氨酰基葡萄糖胺尿(aspartylglucosaminuria)、岩藻糖苷贮积症(fucosidosis)、甘露糖苷贮积症(mannosidosis)、欣德勒(Schindler)病、涎酸贮积症1型、蓬佩(Pompe)病、致密性成骨不全症(Pycnodysostosis)、蜡样脂褐质沉积症(ceroid lipofuscinosis)、胆固醇酯贮积病(cholesterol ester storage disease)、沃尔曼(Wolman)病、多种硫酸酯酶缺乏症(Multiple sulfatase deficiency)、半乳糖涎酸贮积症(galactosialidosis)、粘脂糖症(mucolipidosis)、胱氨酸贮积症(cystinosis)、唾液酸贮积病(sialic acid storage disorder)、乳糜微粒保留病伴马里内斯科-舍格伦综合征(chylomicron retention disease with Marinesco- syndrome)、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-Pudlak syndrome)、切-东二氏(Chediak-Higashi)综合征、Danon病、或Geleophysic发育异常。
18. 一种分离的真菌细胞，其遗传工程化改造为生成包含脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的糖蛋白，所述真菌细胞包含编码甘露糖苷酶的核酸，所述甘露糖苷酶作为单一酶能够(i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解为甘露糖-6-磷酸，并且(ii)水解末端alpha-1,2甘露糖、alpha-1,3甘露糖和/或alpha-1,6甘露糖连接，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
19. 权利要求18的真菌细胞，所述真菌细胞进一步包含编码能够促进甘露糖基磷酸化的多肽的核酸。
20. 权利要求18或19的真菌细胞，其中所述真菌细胞遗传工程化改造为OCH1活性缺乏的。
21. 权利要求18至20中任一项的真菌细胞，所述真菌细胞进一步包含编码靶蛋白的核酸，其中所述靶蛋白是糖蛋白。
22. 权利要求21的真菌细胞，其中所述靶蛋白是人蛋白质。
23. 权利要求21的真菌细胞，其中所述靶蛋白是病原体蛋白质、溶酶体蛋白质、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段、或融合蛋白。
24. 权利要求23的真菌细胞，其中所述溶酶体蛋白质是溶酶体酶。
25. 权利要求24的真菌细胞，其中所述溶酶体酶是酸性alpha葡糖苷酶或alpha半乳糖苷酶。
26. 权利要求22的真菌细胞，其中所述糖蛋白是与LSD有关的蛋白质。
27. 权利要求26的真菌细胞，其中所述LSD是法布里氏病、粘多糖贮积症I、法韦尔病、戈谢病、GM1-神经节苷脂贮积病、泰-萨克斯病、桑德霍夫病、GM2激活物病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、尼曼-皮克病、沙伊病、亨特病、桑菲列普病、莫尔丘病、马-拉病、透明质酸酶缺乏、天冬氨酰基葡萄糖胺尿、岩藻糖苷贮积症、甘露糖苷贮积症、欣德勒病、涎酸贮积症1型、蓬佩病、致密性成骨不全症、蜡样脂褐质沉积症、胆固醇酯贮积病、沃尔曼病、多种硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸贮积症、粘脂糖症、胱氨酸贮积症、唾液酸贮积病、乳糜微粒保留病伴马里内斯科-舍格伦综合征、赫曼斯基-普德拉克综合征、切-东二氏综合征、Danon病、或Geleophysic发育异常。
28. 权利要求18至27中任一项的真菌细胞，其中所述真菌细胞是解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans细胞。
29. 权利要求19的真菌细胞，其中所述能够促进甘露糖基磷酸化的多肽是MNN4多肽。
30. 权利要求29的真菌细胞，其中所述MNN4多肽是解脂耶氏酵母、酿酒酵母、Ogataea minuta、巴斯德毕赤酵母、或白念珠菌多肽。
31. 权利要求19的真菌细胞，其中所述能够促进甘露糖基磷酸化的多肽是巴斯德毕赤酵母PNO1多肽。
32. 权利要求18至31中任一项的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶包含分 泌信号。
33. 权利要求18至32中任一项的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶包含将所述甘露糖苷酶靶向至胞内区室的靶向信号。
34. 权利要求18至33中任一项的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶来自直生刀豆。
35. 权利要求18至33中任一项的真菌细胞，其中所述甘露糖苷酶来自解脂耶氏酵母。”
申请人奥克西雷恩英国有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年09月07日向国家知识产权局提出了复审请求，没有修改申请文件。复审请求人认为：（1）对比文件1没有教导催化脱帽和脱甘露糖基化两者的单一甘露糖苷酶，本领域技术人员不会假设存在单一的酶催化这两种反应的酶存在。（2）权利要求1中将这种酶描述为家族38糖基水解酶。现有技术没有提示具有这两种活性的酶可以特别选自GH38甘露糖苷酶。（3）尽管对比文件1的实施例3显示了JbMan脱帽分离的PA标记的糖链(而非糖蛋白上的糖链)，并且对比文件1的实施例4清楚显示了JbMan不能脱帽或以其它方式改变α-半乳糖苷酶上(即实际的糖蛋白上)的磷酸化的N-聚糖,对比文件1的发明人实际上观察到JbMan不能脱帽糖蛋白上的磷酸化的N聚糖。对比文件1另外筛选了SO-5的一种α甘露糖苷酶。据此教导，本领域技术人员会舍弃刀豆的酶，而采用更新的更优越的这种酶。（4）对比文件1还公开了刀豆酶具有较低的活性，最适pH在酸端，从而不适合从糖蛋白去除糖链。鉴于对比文件1的教导，本领域技术人员完全没有动机使用Jack Bean α-甘露糖苷酶来对蛋白质进行脱帽或脱甘露糖基化。（5）没有动机进一步研究刀豆的酶的能力，本领域技术人员不能合理预期刀豆酶或其他GH38家族酶作为单一酶，同时脱帽和脱甘露糖基化的能力。复审请求人同时提交了附件1作为补充实验证据来表明JbMan能够使IDS和GCase同时脱帽和脱甘露糖基化。
附件1：“用GH38α-甘露糖苷酶对具有高度磷酸化的N聚糖的解脂耶氏酵母中表达的糖蛋白的脱甘露糖基化和磷酸脱帽”，补充实验证据，中文，复印件共2页。
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年09月18日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：首先，对比文件1教导了刀豆α-甘露糖苷酶（JbMan）同时具备催化脱帽和脱甘露糖基化的功能，并且在实施例3中明确验证了其具有从甘露糖-1-磷酸酯残基上切下甘露糖部分（即“脱帽”）的功能。虽然在实施例4中其并未对α-半乳糖苷酶上的甘露糖-1-磷酸酯键进行切割，但是该结果仅表明刀豆α-甘露糖苷酶无法对α-半乳糖苷酶催化脱帽，并不能否认其具备脱帽的活性，也不会影响本领域技术人员尝试用该酶作为单一酶作用于对比文件1公开的其它结构的糖蛋白。其次，权利要求1中的糖蛋白涵盖了对比文件1公开的α-半乳糖苷酶，而且本申请说明书实施例6和8中仅验证了刀豆α-甘露糖苷酶作为单一酶时仅能以人溶酶体α-葡糖苷酶（huGAA）为底物同时进行催化脱帽和脱甘露糖基化，附件1中也仅验证了JbMan对IDS和GCase两种糖蛋白的作用；对于α-半乳糖苷酶为底物时的效果，本申请说明书中并未进行验证，即本申请也并未超出对比文件1的预期；因而基于对比文件1的教导，本领域技术人员有动机采用家族38糖基水解酶同时发挥催化脱帽和脱甘露糖基化的功能作用于不同的糖蛋白；即，本申请的实验结果并不足以证明权利要求所要求保护的技术方案具备创造性。因此，坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年02月02日向复审请求人发出复审通知书，指出：对比文件1公开了一种使用酵母生产活性形式糖蛋白的方法，其中所述活性形式糖蛋白具有在非还原端携带甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链，所述糖蛋白是溶酶体酶；所述甘露糖-6-磷酸酯的酸性糖链可以结合甘露糖-6-磷酸酯受体；所述方法允许α-甘露糖苷酶作用于上述酵母产生的糖蛋白，从而从糖链中的甘露糖-1-磷酸酯键除去甘露糖残基（对应本申请所述“脱帽”）；所述α-甘露糖苷酶具有从甘露糖-1-磷酸酯键除去甘露糖残基的活性，具有非特异性破坏α-1,2、α-1,3和α-1,6甘露糖苷键的活性（对应本申请所述“脱甘露糖基化”）。对比文件1还公开了“依照本发明用于除去酵母特异性甘露糖的α-甘露糖苷酶没有具体限制，只要该酶降解甘露糖-1-磷酸酯键、具有外切型活性、作用糖蛋白并且在需要处理的糖蛋白稳定的pH范围内作用。所述α-甘露糖苷酶具有广泛范围的底物特异性，作用于α-1，2、α-1，3或α-1，6连接的甘露糖苷键，同时也作用于合成底物例如对硝基苯-α-吡喃甘露糖苷或4-甲基伞形基-α-吡喃甘露糖苷。需要使用的可能的α-甘露糖苷酶包括刀豆(Jack Bean)α-甘露糖苷酶和来自酵母液泡的甘露糖苷酶。”；在对比文件1的实施例3中，为了验证酵母菌株表达的α-半乳糖苷酶的分离峰B是否是添加了甘露糖-1-磷酸酯的产物，用刀豆α-甘露糖苷酶消化，使用乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中的60mU刀豆α-甘露糖苷酶进行反应，其产物显示比原始糖链更迟一点的洗脱，与用碱性磷酸酶处理的洗脱出现在相同的点。这表明刀豆α-甘露糖苷酶具有使糖蛋白“脱帽”的能力。由此可见，对比文件1公开了一种使酵母产生的糖蛋白同时“脱帽”和脱甘露糖基化的方法，并且公开了来自刀豆的α甘露糖苷酶具有这样的能力。权利要求1与对比文件1相比区别特征在于：权利要求1中限定了所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。因而所解决的技术问题是，提供一种使用其他的酶来对糖蛋白进行脱帽和脱甘露糖基化的方法。首先，对比文件1公开的刀豆的α甘露糖苷酶本身是属于家族38的糖基水解酶，落入了权利要求1的保护范围。第二，本领域已知的是来自同一家族的糖基水解酶具有相似的活性，因而本领域技术人员容易想到家族38的糖基水解酶也将具备同时对糖蛋白进行脱帽和脱甘露糖基化的能力，从而可以用于所述的方法中。因此，在对比文件1的启示下，权利要求1的技术方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求1不具备创造性。基于相类似的理由，权利要求2-35对于本领域技术人员而言也是显而易见的，不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
复审请求人于2019年05月17日提交了意见陈述书和附件2，但未修改申请文件。复审请求人认为：（1）对比文件1可能公开了单一特异性酶制备物，其催化糖蛋白上磷酸化N-聚糖的脱帽和脱甘露糖基化，但这种制备物是“SO-5”上清液，然而SO-5上清液不构成作为单一酶催化这两种反应的GH38甘露糖苷酶的公开。具体而言，根据对比文件1的参考实施例4中的描述，来自SO-5上清液的α-甘露糖苷酶是一种部分纯化的制备物；属于相同糖苷水解酶(GH)家族的甘露糖苷酶趋于显示相当大的结构和折叠相似性，参考实施例4中应用的分离技术不一定将由SO-5分泌的每种甘露糖苷酶解析成单独的级份，因而不存在先验的理由去假设对比文件1的“部分纯化的SO-5制备物”中的脱帽和脱甘露糖基化活性是由单一酶进行的，并提供Tiels等人的文章（附件2）佐证。因此，围绕SO-5上清液的对比文件1的实际实验公开内容既未公开GH38甘露糖苷酶，也未公开甘露糖苷酶作为单一酶催化糖蛋白上磷酸化N-聚糖的脱帽和脱甘露糖基化的能力。（2）在对比文件1的说明书第26页最后一段中描述的实验中，未测试JbMan对如对比文件1的实施例3第1段中所述纯化的α-半乳糖苷酶的活性。JbMan是与分离的糖分子反应而不是与含糖分子的糖蛋白反应，JbMan仅用于分析和确认分离的糖分子的结构。该文献明确没有公开糖蛋白经由JbMan进行脱帽和脱甘露糖基化的方法。此外，如本领域技术人员公知的，用分离的糖分子进行的任何发现显然不能在不进行相关实验的情况下外推到含有此类糖的糖蛋白。（3）如对比文件1的实施例4的第2段中所示，刀豆α-甘露糖苷酶不能使α-半乳糖苷酶上的N-聚糖脱帽(“糖链中的甘露糖-1-磷酸键未被切割”)，并且完全未测试来自酵母液泡的甘露糖苷酶。（4）对比文件1的实施例4第2段的描述表明，JbMan不会导致糖蛋白上的磷酸化的N聚糖的脱甘露糖基化。通常认为JbMan对甘露糖苷中的α-1,2、α-1,3和α-1,6-键起作用这一事实并不能解决对比文件1中缺乏下述证据的问题，即JbMan可以从糖蛋白(其中与分离的甘露糖苷相比潜在的糖蛋白结构的存在可以影响反应)上磷酸化的N-聚糖(其中与非磷酸化的甘露糖苷相比，底物中磷酸基团的存在可以影响反应)除去甘露糖残基。（5）面对对比文件1的公开，本领域技术人员没有动机进一步研究JbMan或其他GH38甘露糖苷酶使糖蛋白上磷酸化N-聚糖脱帽的能力。对比文件1(实施例4)未能证明JbMan对α-半乳糖苷酶的磷酸化N-聚糖的任何改变。因此，本领域技术人员也没有理由预期JbMan或其他GH 38甘露糖苷酶使糖蛋白上的磷酸化N-聚糖脱甘酸。总之，本领域技术人员不能合理预期JbMan或其他GH 38甘露糖苷酶可以作为单一酶使糖蛋白上的磷酸化N-聚糖脱帽和甘露糖基化。
复审请求人所提交的附件2如下：
附件2：“A bacterial glycosidase enables mannose-6-phosphate modification and improved cellular uptake of yeast-produced recombinant human lysosomal enzymes”，Petra Tiels等，Nature Biotechnology，2012年，英文，复印件共10页。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查的文本
复审请求人在复审阶段未提交修改的申请文件，因而本复审请求审查决定所针对的文本与驳回决定相同，即，2013年05月29日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请中文译文的说明书第1-237段（第1-54页）、说明书附图图1A-图22、说明书摘要，依据专利合作条约第28条或者第41条修改的说明书核苷酸和氨基酸序列表；2016年12月22日提交的权利要求第1-35项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
在所要求保护的技术方案与最接近的现有技术存在区别特征的情况下，如果现有技术中不存在将所述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其实际技术问题的启示，则所要求保护的技术方案是非显而易见的，具有创造性。
在本案中，权利要求1请求保护一种在糖蛋白上使甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块脱帽并使磷酸化N-聚糖脱甘露糖基化的方法，所述方法包括：a)提供所述糖蛋白，该糖蛋白具有含有所述甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块的磷酸化的N-聚糖；并b)使所述糖蛋白与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷酶作为单一酶(i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块水解成甘露糖-6-磷酸，并且(ii)水解末端alpha-1,2甘露糖、alpha-1,3甘露糖和/或alpha-1,6甘露糖连接，其中所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。
驳回决定和前置审查意见书中认为：权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比区别在于：权利要求1中限定了采用单一的甘露糖苷酶。基于上述区别特征，本申请要求保护的技术方案实际解决的技术问题是提供一种同时具备脱帽和脱甘露糖基化的甘露糖苷酶。对比文件1还公开了需要使用的可能的α-甘露糖苷酶包括刀豆α-甘露糖苷酶（属于家族38糖基水解酶）和来自酵母液泡的甘露糖苷酶。可见对比文件1教导了可采用刀豆α-甘露糖苷酶和来自酵母液泡的甘露糖苷酶产生上述活性糖蛋白；而且本领域技术人员也有动机优先选择单一酶进行反应。对于刀豆α-甘露糖苷酶，对比文件1实施例3通过实验验证了刀豆α-甘露糖苷酶具备降解甘露糖-1-磷酸酯键（即“脱帽”）的功能。在此基础上，本领域技术人员有动机将对比文件1公开的刀豆α-甘露糖苷酶和来自酵母液泡的甘露糖苷酶应用于上述溶酶体酶以及其它相关的糖蛋白；而验证其效果并不需要本领域技术人员付出创造性的劳动。尽管对比文件1的实施例4中采用刀豆α-甘露糖苷酶并未对α-半乳糖苷酶上的甘露糖-1-磷酸酯键进行切割，但是该结果并不影响本领域技术人员尝试用该酶作用于其它的糖蛋白；即，结合实施例3和4的结果仅表明刀豆α-甘露糖苷酶无法对α-半乳糖苷酶进行脱帽，但是并不能以此证明刀豆α-甘露糖苷酶对所有类型的糖蛋白均不具备脱帽活性。由此权利要求1不具备创造性。对比文件1的实施例4的结果仅表明刀豆α-甘露糖苷酶无法对α-半乳糖苷酶催化脱帽，并不能否认其具备脱帽的活性，也不会影响本领域技术人员尝试用该酶作为单一酶作用于对比文件1公开的其它结构的糖蛋白。而对于α-半乳糖苷酶为底物时的效果，本申请说明书中也未进行验证，即本申请也并未超出对比文件1的预期。
复审通知书中认为：对比文件1公开了一种使酵母产生的糖蛋白同时“脱帽”和脱甘露糖基化的方法，并且公开了来自刀豆的α甘露糖苷酶具有这样的能力。权利要求1与对比文件1相比区别特征在于：权利要求1中限定了所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。因而所解决的技术问题是，提供一种使用其他的酶来对糖蛋白进行脱帽和脱甘露糖基化的方法。首先，对比文件1公开的刀豆的α甘露糖苷酶本身是属于家族38的糖基水解酶，落入了权利要求1的保护范围。第二，本领域已知的是来自同一家族的糖基水解酶具有相似的活性，因而本领域技术人员容易想到家族38的糖基水解酶也将具备同时对糖蛋白进行脱帽和脱甘露糖基化的能力，从而可以用于所述的方法中。因此，权利要求1不具备创造性。
经过综合考虑复审请求人提交的意见陈述和证据，合议组认为：权利要求1与对比文件1相比，区别特征在于：所述甘露糖苷酶作为单一酶使用，并且所述甘露糖苷酶是家族38糖基水解酶。所解决的技术问题是提供一种家族38糖基水解酶作为单一的酶来使糖蛋白上的甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块脱帽并使磷酸化N聚糖脱甘露糖基化的方法。然而，对于上述区别特征，对比文件1并未公开或教导一种能够同时实现“脱帽”和“脱甘露糖基化”的单一的酶，也没有教导这样的酶可以是家族38糖基水解酶。具体而言，首先，对比文件1公开了一种由菌株SO-5的上清液制备的α-甘露糖苷酶并且证明其可以催化上述两种反应，然而根据对比文件1的参考实施例4中描述的制备过程，这种α-甘露糖苷酶是作为一种部分纯化的酶制备物存在，而没有充分的证据表明所获得的是一种单一的甘露糖苷酶；对比文件1也没有教导来自SO-5上清液的甘露糖苷酶是属于家族38的甘露糖苷酶。第二，关于对比文件1中公开的刀豆α-甘露糖苷酶,在实施例3中使用该酶对糖链反应产物进行消化，用于确认分离的糖分子的结构，然而这一反应不是针对糖蛋白上的糖链进行的，鉴于处在糖蛋白上的糖链与分离的糖链在整体分子结构上的差异，本领域的技术人员并不能由此确认刀豆α-甘露糖苷酶能够实现对糖蛋白上的甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖模块进行“脱帽”。对比文件1的实施例4中采用刀豆α-甘露糖苷酶并未实现对α-半乳糖苷酶上的甘露糖-1-磷酸酯键进行切割，尽管在现实中刀豆α-甘露糖苷酶对其他糖蛋白实现“脱帽”的可能性仍然存在，但就对比文件1本身而言，其并未教导刀豆α-甘露糖苷酶的这一活性，也没有为本领域技术人员提供充分的动机来尝试验证刀豆α-甘露糖苷酶的相关活性。由此可见，对比文件1没有教导用一种单一的酶来实现对糖蛋白的“脱帽”和“脱甘露糖基化”，也没有教导这种单一酶可以是来自GH38的糖基水解酶。因此，对比文件1中不存在将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在技术问题的技术启示。因而，权利要求1所要求保护的技术方案对于本领域的技术人员而言是非显而易见的，具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
对于权利要求2-35，基于相类似的理由，相对于对比文件1，其技术方案对于本领域技术人员而言是非显而易见的，具有创造性，符合专利法第22条第3款的规定。
由此，驳回决定、前置审查意见书和复审通知书中指出的关于本申请权利要求1-35不具备创造性的理由不再成立。基于上述事实和理由，合议组做出以下决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2017年05月26日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审请求审查决定所针对的文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
郑重声明：本文版权归原作者所有，转载文章仅为传播更多信息之目的，如作者信息标记有误，请第一时间联系我们修改或删除，多谢。
