发明创造名称：脂肪酸及其衍生物的制备
外观设计名称：
决定号：189075
决定日：2019-09-05
委内编号：1F250291
优先权日：
申请（专利）号：201610085050.3
申请日：2007-05-18
复审请求人：REG生命科学有限责任公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：王慧梅
合议组组长：潘俊宇
参审员：李肖蕖
国际分类号：C12N1/21，C12P7/64，C12R1/19
外观设计分类号：
法律依据：专利法第33条
决定要点
：如果修改的内容没有记载在原说明书和权利要求书中，也不能由原说明书和权利要求书文字记载的内容以及说明书附图直接地、毫无疑义地确定，则该修改超范围。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610085050.3，名称为“脂肪酸及其衍生物的制备”的发明专利申请。申请人为REG生命科学有限责任公司。本申请的申请日为2007年05月18日，最早优先权日为2006年05月19日，公开日为2016年08月10日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年01月29日以权利要求1-24不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请，其理由是：对比文件1（AINER，KALSCHEUER等，A Novel Bifunctional Wax Ester Synthase/Acyl-CoA:Diacylglycerol Acyltransferase Mediates Wax Ester and Triacylglycerol Biosynthesis in Acinetobacter calcoaceticus ADP1，JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，第278卷，第10期，第8075-8082页，公开日：2003年03月07日）公开了一种重组大肠杆菌，其通过表达来自乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）的具有蜡合酶活性的多肽的编码核酸，获得了蜡合酶活性分别提高约768倍（84.51pmol vs.对照0.11pmol）的重组大肠杆菌菌株XL1-Blue和约900倍（99.20pmol vs 对照0.11pmol）的大肠杆菌菌株S17-1（参见摘要，表1，第8076页左栏第1段，第8077页右栏最后1段，图3）。权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：所述乙酰辅酶A羧化酶基因被过表达。根据上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题是：提高微生物脂肪酸及其衍生物的产量。本领域技术人员普遍已知：乙酰辅酶A羧化酶是催化脂肪酸生物合成通路中第一个关键步骤的酶，是脂肪酸合成的关键调控点（B.D.黑姆斯等著，《生物化学》（第二版），科学出版社，公开日：2004年09月30日，参见正文第368-369页K3节“脂肪酸合成要点”），因此，在制备用于生产脂肪酸及其衍生物的微生物时，对该酶进行修饰是本领域技术人员的合理选择之一；并且根据常规知识可知，提高该酶的表达量（例如过表达）预期将通过加快该关键步骤，对脂肪酸及其衍生物的合成产生有利的影响。因此，权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款规定的创造性。对比文件1已经公开了使用大肠杆菌作为表达宿主，和所述重组大肠杆菌催化12-20个碳原子的饱和或单烯键脂肪醇与酰基CoA的酯化反应，并最终形成蜡酯（参见第8076页左栏第1段，第8077页右栏最后1段，图3）。权利要求18中的微生物也是本领域常见宿主微生物，脂肪酸酯或蜡酯在微生物发酵肉汤中的含量是本领域通过常规手段能够测定获得的，脂肪酸衍生物酯键两侧的双键数量、碳链长度是脂肪酸衍生物的常规参数，在对比文件1公开了蜡酯由12-20个碳原子的饱和或单烯键脂肪醇（A侧）与酰基CoA的酯化反应的情况下，本领域技术人员能够根据需要对脂肪酸衍生物酯键两侧的双链数量、碳链长度进行选择，并确定总的碳链长度、双键数量。碳分枝点及环丙基是脂肪酸衍生物中的常见结构，本领域技术人员能够对脂肪酸衍生物酯键两侧的碳分枝点、环丙基数量进行常规选择，并确定总的碳分枝点数量。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，从属权利要求2，8-18也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。本领域技术人员可以根据宿主微生物脂肪酸合成代谢能力以及对脂肪酸衍生物产物的需要选择转入编码所述酶的外源核酸序列。因此，在其引用的权利要求1、18不具备创造性的情况下，从属权利要求3，5，21-22也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。对比文件2（EP 0557469B1，公开日：2004年03月17日）公开了一种利用重组大肠杆菌生产不饱和中链游离脂肪酸的方法，将植物中链硫酯酶编码基因导入宿主菌细胞，所述宿主菌细胞是脂肪酸降解缺陷的，所述宿主菌是乙酰辅酶A缺陷的、可选自大肠杆菌fadD和fadE（参见权利要求1-10）。对比文件2给出了将植物硫酯酶导入宿主菌、调节fadD和fadE，以生产中链不饱和脂肪酸的技术启示，本领域技术人员在制备用于生产脂肪酸或其衍生物，特别是中链脂肪酸或其衍生物的重组微生物时，有动机表达植物源硫酯酶编码基因、调节fadD和fadE。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，从属权利要求4，6-7，23也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求19-20，24所述的方法包括培养所述微生物和相应产物的常规分离步骤。因此，当涉及的微生物不具有创造性时，权利要求19-20，24也不具有专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定所依据的文本为分案申请递交日2016年02月15日提交的说明书第1-284段（即第1-57页）、说明书摘要、说明书附图图1-图10(续)（即第1-21页）、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-33页，以及2017年05月18日提交的权利要求第1-24项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 微生物，所述微生物包含一种或多种编码包含EC 2.3.1.75的蜡酯合酶的多肽的外源核酸序列，和编码包含EC 6.4.1.2的乙酰辅酶A羧化酶的多肽的核酸序列，其中所述核酸序列被过表达，并且其中所述微生物从碳水化合物碳源产生脂肪酸衍生物。
2. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌(E.coli)。
3. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物表达一种或多种编码酶的外源核酸序列，所述酶选自EC 1.2.4.4的支链酮酸脱氢酶复合物的一种或者多种组分，EC 2.6.1.42的Ilve，EC 1.8.1.4的lpd，EC 1.1.19的Ccr，EC 5.4.99.2的IcmA，EC 5.4.99.13的IcmB，EC 2.3.1.180的fabH，EC 2.3.1.179的fabF，EC 2.3.1.180的fabH3，登录号NP_823468的fabC3，EC 2.3.1.180的β-酮酰-ACP合酶II，EC 1.3.1.34的烯酰辅酶A还原酶，EC 4.2.1.-的烯酰辅酶A异构酶，及其组合，其中所述脂肪酸衍生物是分枝的。
4. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物表达编码EC 3.1.2.-或EC 3.1.1.-的硫酯酶的一种或多种外源核酸序列。
5. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物表达一种或多种编码酶的外源核酸序列，所述酶选自EC 2.3.1.41的fabB，EC 1.2.1.9的fabK，EC 1.2.1.9的fabL，EC 5.3.3.14的fabM，EC 1.3.99.3或1.3.99.-的fadE，及其组合，并且其中所述脂肪酸衍生物是不饱和的。
6. 如权利要求1所述的微生物，其中fadE是弱化的。
7. 如权利要求1所述的微生物，其中fadD是过表达的。
8. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物位于包含发酵肉汤的容器中，所述发酵肉汤包含至少10mg/L脂肪酸酯或至少10mg/L蜡。
9. 如权利要求1所述的微生物用于产生脂肪酸衍生物的用途，其中所述脂肪酸衍生物包括1至5个双键。
10. 如权利要求1所述的微生物用于产生脂肪酸衍生物的用途，其中所述脂肪酸衍生物包括约8至约30的碳链长度。
11. 如权利要求1所述的微生物用于产生脂肪酸衍生物的用途，其中所述脂肪酸衍生物包括约1至约5个分枝点。
12. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物还包括具有A侧和B侧的脂肪酸酯或蜡，其中所述A侧由醇提供，所述B侧由酰基辅酶A提供。
13. 如权利要求12所述的微生物，其中所述A侧和B侧由所述微生物产生。
14. 如权利要求12所述的微生物用于产生脂肪酸衍生物的用途，其中所述脂肪酸衍生物的A侧，B侧，或A侧和B侧包含约1至约5个双键。
15. 如权利要求12所述的微生物用于产生脂肪酸衍生物的用途，其中脂肪酸衍生物的A侧，B侧，或A侧和B侧包含约1至约26的碳链长度。
16. 如权利要求12所述的微生物用于产生脂肪酸衍生物的用途， 其中所述脂肪酸衍生物的A侧，B侧，或A侧和B侧包含约1至约5个碳分枝点。
17. 如权利要求12所述的微生物用于产生脂肪酸衍生物的用途，其中所述脂肪酸衍生物的A侧，B侧，或A侧和B侧包含约1至5个环丙基部分。
18. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是节杆菌(Arthrobacter sp.),芽孢杆菌(Bacillus sp.),布朗葡萄藻(Botryococcus braunii),着色菌(Chromatium sp.),树脂枝孢霉(Cladosporium resina)(ATCC22711),巴斯德梭状芽胞杆菌VKM(Clostridium pasteurianum VKM),破伤风形梭菌(Clostridium tenanomorphum),尿酸棱菌(Clostridium acidiurici),棒状杆菌(Corynebacterium species),蓝藻(cyanobacterial species),蓝藻(cyanobacterial species)(灰色念珠藻(Nostoc muscorum),组囊藻(Anacystis(Synechococcus)nidulans),丝状蓝藻(Phormidium luridum),佛氏绿胶蓝细菌(Chlorogloea fritschii),红海束毛藻(Trichodesmium erythaeum),Oscillatoria williamsii,微鞘藻(Microcoleus chthonoplaseis),Coccochloris elabens,Agmenellum quadruplicatum,Plectonema terebrans,具鞘微鞘藻(M vaginatus),和岩生眉藻(C.scopulorum)),脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)(ATCC29577),Kineococcus radiotolerans(BAA-149),藤黄微球菌(Micrococcus luteus)(FD533,ATCC 272,381,382,ISU,540,4698,7468,27141),小球菌(Micrococcus sp.)(ATCC 146,398,401,533),玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 412,416,516),溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus),分支杆菌(Mycobacterium species),青霉(Penicillium sp.),曲霉(Aspergillus sp.),绿色木霉(Trichoderma virida),出芽短梗霉(Pullularia pullulans),Jeotgalicoccus sp.(M.candicans)(ATCC 8456),红假单胞菌球状绿菌(Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp.),深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170),万尼氏红微菌(Rhodomicrobium vannielii),嗜麦芽窄食 单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637,17444,17445,17666,17668,17673,17674,17679,17677),路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711),类酵母(Saccharomyces sp.)(oviformus,ludwiggi,tropicalis),弗尼斯弧菌M1(Vibrio furnissii M1),海产弧菌MP-1(Vibrio marinus MP-1),Vibrio ponticus,海红沙雷氏菌(Serratia marinorubra),玉米黑粉菌(Ustilago maydis),麦散黑粉菌(Ustilago nuda),小麦条黑粉菌(Urocystis agropyri),高粱丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)或腥黑粉菌(Tilletia sp.)(foetida,caries,controversa)。
19. 产生脂肪酸酯的方法，包括在足以产生脂肪酸酯的条件下培养权利要求1-18中任一项所述的微生物；和分离脂肪酸酯。
20. 如权利要求19所述的方法，其中所述脂肪酸酯是蜡酯。
21. 如权利要求18所述的微生物，其中所述微生物还表达选自下列的酶：EC 2.3.1.84的醇乙酰转移酶，EC 1.1.1.1的醇脱氢酶，和EC 1.1.1.*的脂肪醇形成性酰基辅酶A还原酶。
22. 如权利要求18所述的微生物，其中所述微生物表达一种或多种编码酶的核酸序列，所述酶选自EC 1.2.4.4的支链酮酸脱氢酶复合物的一种或者多种组分，EC 2.6.1.42的live，EC 1.8.1.4的lpd，EC1.1.19的ccr，EC 5.4.99.2的IcmA，EC 5.4.99.13的IcmB，EC 2.3.1.180的fabH，登录号NP_626635的ACP，EC 2.3.1.179的fabF，EC 2.3.1.180的fabH3，登录号NP_823468的fabC3，EC 2.3.1.180的β-酮酰-ACP 合酶II，EC 1.3.1.34的烯酰辅酶A还原酶，EC 4.2.1.-的烯酰辅酶A异构酶，及其组合，其中所述脂肪酸衍生物是分枝的。
23. 如权利要求18和21-22任一项所述的微生物，其中所述微生物表达编码EC 3.1.2.-或EC 3.1.1.-的硫酯酶的一种或多种外源核酸序 列。
24. 如权利要求19或20所述的方法，还包括：
使脂肪酸衍生物分离进入有机相；和
从所述有机相纯化所述脂肪酸衍生物。”
申请人REG生命科学有限责任公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年04月25日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了经修改的权利要求书全文替换页（共4页21项），其中所作修改在于：将原权利要求1，3，5，8-11，14-17，24中的“脂肪酸衍生物”修改为“FAME和/或FAEE”，原权利要求12中的“脂肪酸酯或蜡”修改为“FAME和/或FAEE”，原权利要求19中的“脂肪酸酯”修改为“FAME和/或FAEE”，删除原权利要求20，22，23，并对权利要求编号和引用关系进行适应性修改。复审请求人认为：（1）微生物的生化通路复杂，对比文件1没有证明异源表达蜡合酶后微生物的脂肪酸酯的产量必然升高，而仅仅记载了异源表达WS/DGAT酶后的体外酶活性相对于对照的升高，并教导了异源表达WS/DGAT的大肠杆菌以葡萄糖为唯一碳源时，仅显示出体外WS和DGAT活性，体内仅有TAG积累，没有蜡酯形成（参见第8080页左栏第1段）。基于对比文件1本领域技术人员无法预期将蜡合酶与乙酰辅酶A羧化酶联合表达将对产量产生何种影响，因此本申请要求保护的从碳水化合物碳源产生脂肪酸衍生物的微生物不是显而易见的。（2）对比文件1中涉及单独一种具有WS和DGAT活性的双功能酶的异源表达，本领域技术人员没有动机挑选出乙酰辅酶A羧化酶来与对比文件1所述蜡合酶组合表达于一种微生物中。由于微生物的生化通路复杂，本领域技术人员无法预期将蜡合酶与乙酰辅酶A组合表达将对脂肪酸衍生物的产生带来何种影响。（3）答复一通时补充证据表明共表达蜡酯合酶和乙酰辅酶A羧化酶相对于仅表达蜡酯合酶产生了1.5-2倍的FAME产量增加，构成预料不到的技术效果。复审请求时新修改的权利要求书如下：
“1. 微生物，所述微生物包含一种或多种编码包含EC 2.3.1.75的蜡酯合酶的多肽的外源核酸序列，和编码包含EC 6.4.1.2的乙酰辅酶A羧化酶的多肽的核酸序列，其中所述核酸序列被过表达，并且其中所述微生物从碳水化合物碳源产生脂肪酸甲酯(FAME)和/或脂肪酸乙酯(FAEE)。
2. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌(E.coli)。
3. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物表达一种或多种编码酶的外源核酸序列，所述酶选自EC 1.2.4.4的支链酮酸脱氢酶复合物的一种或者多种组分，EC 2.6.1.42的Ilve，EC 1.8.1.4的lpd，EC 1.1.19的Ccr，EC 5.4.99.2的IcmA，EC 5.4.99.13的IcmB，EC 2.3.1.180的fabH，EC 2.3.1.179的fabF，EC 2.3.1.180的fabH3，登录号NP_823468的fabC3，EC 2.3.1.180的β-酮酰-ACP合酶II，EC 1.3.1.34的烯酰辅酶A还原酶，EC 4.2.1.-的烯酰辅酶A异构酶，及其组合，其中所述FAME和/或FAEE是分枝的。
4. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物表达编码EC 3.1.2.-或EC 3.1.1.-的硫酯酶的一种或多种外源核酸序列。
5. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物表达一种或多种编码酶的外源核酸序列，所述酶选自EC 2.3.1.41的fabB，EC 1.2.1.9的fabK，EC 1.2.1.9的fabL，EC 5.3.3.14的fabM，EC 1.3.99.3或1.3.99.-的fadE，及其组合，并且其中所述FAME和/或FAEE是不饱和的。
6. 如权利要求1所述的微生物，其中fadE是弱化的。
7. 如权利要求1所述的微生物，其中fadD是过表达的。
8. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物位于包含发酵肉汤的容器中，所述发酵肉汤包含至少10mg/LFAME和/或FAEE。
9. 如权利要求1所述的微生物用于产生FAME和/或FAEE的用途，其中所述FAME和/或FAEE包括1至5个双键。
10. 如权利要求1所述的微生物用于产生FAME和/或FAEE的用途，其中所述FAME和/或FAEE包括约8至约30的碳链长度。
11. 如权利要求1所述的微生物用于产生FAME和/或FAEE的用途，其中所述FAME和/或FAEE包括约1至约5个分枝点。
12. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物还包括具有A侧和B侧的FAME和/或FAEE，其中所述A侧由醇提供，所述B侧由酰基辅酶A提供。
13. 如权利要求12所述的微生物，其中所述A侧和B侧由所述微生物产生。
14. 如权利要求12所述的微生物用于产生FAME和/或FAEE的用途，其中所述FAME和/或FAEE的A侧，B侧，或A侧和B侧包含约1至约5个双键。
15. 如权利要求12所述的微生物用于产生FAME和/或FAEE的用途，其中FAME和/或FAEE的A侧，B侧，或A侧和B侧包含约1至约26的碳链长度。
16. 如权利要求12所述的微生物用于产生FAME和/或FAEE的 用途，其中所述FAME和/或FAEE的A侧，B侧，或A侧和B侧包含约1至约5个碳分枝点。
17. 如权利要求12所述的微生物用于产生FAME和/或FAEE的用途，其中所述FAME和/或FAEE的A侧，B侧，或A侧和B侧包含约1至5个环丙基部分。
18. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是节杆菌(Arthrobacter sp.),芽孢杆菌(Bacillus sp.),布朗葡萄藻(Botryococcus braunii),着色菌(Chromatium sp.),树脂枝孢霉(Cladosporium resina)(ATCC22711),巴斯德梭状芽胞杆菌VKM(Clostridium pasteurianum VKM),破伤风形梭菌(Clostridium tenanomorphum),尿酸棱菌(Clostridium acidiurici),棒状杆菌(Corynebacterium species),蓝藻(cyanobacterial species),蓝藻(cyanobacterial species)(灰色念珠藻(Nostoc muscorum),组囊藻(Anacystis(Synechococcus)nidulans),丝状蓝藻(Phormidium luridum),佛氏绿胶蓝细菌(Chlorogloea fritschii),红海束毛藻(Trichodesmium erythaeum),Oscillatoria williamsii,微鞘藻(Microcoleus chthonoplaseis),Coccochloris elabens,Agmenellum quadruplicatum,Plectonema terebrans,具鞘微鞘藻(M vaginatus),和岩生眉藻(C.scopulorum)),脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)(ATCC29577),Kineococcus radiotolerans(BAA-149),藤黄微球菌(Micrococcus luteus)(FD533,ATCC 272,381,382,ISU,540,4698,7468,27141),小球菌(Micrococcus sp.)(ATCC 146,398,401,533),玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 412,416,516),溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus),分支杆菌(Mycobacterium species),青霉(Penicillium sp.),曲霉(Aspergillus sp.),绿色木霉(Trichoderma virida),出芽短梗霉(Pullularia pullulans),Jeotgalicoccus sp.(M.candicans)(ATCC 8456),红假单胞菌球状绿菌(Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp.),深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170),万尼氏红微菌(Rhodomicrobium vannielii),嗜麦芽窄食 单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637,17444,17445,17666,17668,17673,17674,17679,17677),路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711),类酵母(Saccharomyces sp.)(oviformus,ludwiggi,tropicalis),弗尼斯弧菌M1(Vibrio furnissii M1),海产弧菌MP-1(Vibrio marinus MP-1),Vibrio ponticus,海红沙雷氏菌(Serratia marinorubra),玉米黑粉菌(Ustilago maydis),麦散黑粉菌(Ustilago nuda),小麦条黑粉菌(Urocystis agropyri),高粱丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)或腥黑粉菌(Tilletia sp.)(foetida,caries,controversa)。
19. 产生FAME和/或FAEE的方法，包括在足以产生FAME和/或FAEE的条件下培养权利要求1-18中任一项所述的微生物；和分离FAME和/或FAEE。
20. 如权利要求18所述的微生物，其中所述微生物还表达选自下列的酶：EC 2.3.1.84的醇乙酰转移酶，EC 1.1.1.1的醇脱氢酶，和EC 1.1.1.*的脂肪醇形成性酰基辅酶A还原酶。
21. 如权利要求19所述的方法，还包括：
使FAME和/或FAEE分离进入有机相；和
从所述有机相纯化所述FAME和/或FAEE。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年05月04日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，（1）首先，说明书中对脂肪酯进行了举例，其中包括C18:1的甲酯、C16:1的乙酯、C16:1的甲酯、C18:1乙酯（说明书第105段、第215段），一些具体的实施例中也涉及到脂肪乙酯（实施例7、8），但根据上述内容不能直接、毫无疑义地确定本申请中的“脂肪酸衍生物”、“脂肪酸酯”、“脂肪酸酯或蜡”为FAME和/或FAEE。其次，原申请文件中涉及大量酶及酶的组合（例如，说明书第11、14-15、70段等），同时也涉及了大量上位化的脂肪酸衍生物（例如，说明书第9段等），即原申请文件中对酶、脂肪酸衍生物均有大量并列可选项。对于修改后权利要求1中具体酶（蜡酯合酶和乙酰辅酶A羧化酶）对应具体脂肪酸衍生物（FAME和/或FAEE）的技术方案，根据原申请文件无法直接、毫无疑义地确定。最后，权利要求1中“产生脂肪酸甲酯(FAME)和/或脂肪酸乙酯(FAEE)”包括三种情况产生FAME、产生FAEE、产生FAME和FAEE的混合物，上述内容根据原申请文件无法直接、毫无疑义地确定。因此，将权利要求中涉及“脂肪酸衍生物”、“脂肪酸酯”、“脂肪酸酯或蜡”修改为FAME和/或FAEE不符合专利法33条的规定。（2）复审理由与实审阶段答二通（2017年12月01日）的意见陈述内容相同（仅是将（2）置于（3）之后并重新编号），驳回决定中已进行了针对性回复。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019 年02 月01 日向复审请求人发出复审通知书，指出：(1) 新修改的权利要求1的内容不是原说明书和权利要求书记载的内容。虽然本申请说明书第105段记载了“在一个实施方式中，脂肪酯产物具有24-32个碳原子的碳原子含量。在另一个实施方式中，脂肪酯产物具有14和20个碳的碳含量。 在另一个实施方式中，脂肪酯是C18:1的甲酯。在另一个实施方式中， 脂肪酯是C16:1的乙酯。在另一个实施方式中，脂肪酯是C16:1的甲酯。 在另一个实施方式中，脂肪酸酯是辛醇的十八烷酯”；第215段也对脂肪酸衍生物进行了举例，其为C16:1乙酯或者C18:1乙酯；而且实施例7和8涉及产生脂肪酸乙酯，但实施例7中记载C16乙酯是最主要的酯，实施例8产生的特定脂肪酸乙酯种类如表8所示，且其中均未转入乙酰辅酶A羧化酶基因。即原说明书中仅在发明内容部分记载了产生特定碳链长度的脂肪酸甲酯和/或脂肪酸乙酯，未记载过表达蜡酯合酶和乙酰辅酶A羧化酶的微生物能够产生除上述特定碳链长度以外的其他碳链长度的脂肪酸甲酯和/或脂肪酸乙酯；而实施例7和8中产生了脂肪酸乙酯的微生物中未转入乙酰辅酶A羧化酶基因。因此，根据原说明书和权利要求书记载的上述内容，不能直接地、毫无疑义地确定过表达蜡酯合酶和乙酰辅酶A羧化酶的微生物能够产生除说明书中记载的特定碳链长度以外的其他碳链长度的脂肪酸甲酯和/或脂肪酸乙酯。因此，权利要求1的修改超出了原始申请文件记载的范围，不符合专利法第33条的规定。同理，权利要求2-21也不符合专利法第33条的规定。(2) 基于权利要求书中的脂肪酸甲酯和/或脂肪酸乙酯修改为脂肪酸衍生物或脂肪酸酯的假设，评述了创造性，具体为：权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：权利要求1中使乙酰辅酶A羧化酶基因过表达。根据上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题是：提高微生物脂肪酸衍生物的产量。本领域技术人员普遍已知：乙酰辅酶A羧化酶是催化脂肪酸生物合成通路中第一个关键步骤的酶，是脂肪酸合成的关键调控点（B.D.黑姆斯等著，《生物化学》（第二版），科学出版社，公开日：2004年09月30日，参见正文第368-369页K3节“脂肪酸合成要点”），因此，根据常规知识可知，在制备用于生产脂肪酸及其衍生物的微生物时，本领域技术人员都有动机提高该酶的表达量（例如过表达）以加快该关键步骤，并预期其对脂肪酸及其衍生物的合成将产生有利的影响。因此，权利要求1相对于对比文件1与本领域常规知识和技术的结合不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。从属权利要求2，8，12-13，18进一步限定微生物的种类、含量、酯键两侧基团的来源等，其附加技术特征或者已经被对比文件1公开或者是本领域常规选择或者是本领域通过常规手段能够测定获得的，因此，在其直接或间接引用的权利要求1不具备创造性的情况下，从属权利要求2，8，12-13，18也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。从属权利要求3，5，20进一步限定所述微生物中的其他外源核酸序列，所述外源核酸序列编码的酶均是参与微生物脂肪酸代谢的常见酶，本领域技术人员可以根据宿主微生物脂肪酸合成代谢能力以及对脂肪酸衍生物产物的需要选择转入编码所述酶的外源核酸序列。因此，在其引用的权利要求1，18不具备创造性的情况下，从属权利要求3，5，20也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。从属权利要求4，6，7进一步限定所述微生物表达硫酯酶、弱化fadE、过表达fadD。对比文件2公开了一种利用重组大肠杆菌生产不饱和中链游离脂肪酸的方法，将植物中链硫酯酶编码基因导入宿主菌细胞，所述宿主菌细胞是脂肪酸降解缺陷的，所述宿主菌是乙酰辅酶A缺陷的、可选自大肠杆菌fadD和fadE（参见权利要求1-10）。本领域技术人员在制备用于生产脂肪酸或其衍生物，特别是中链脂肪酸或其衍生物的重组微生物时，有动机表达植物源硫酯酶编码基因、调节fadD和fadE。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，从属权利要求4，6，7也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求9-11，14-17分别请求保护权利要求1或权利要求12所述微生物用于产生脂肪酸衍生物的用途，并对酯键两侧基团的来源、双键数量、碳链长度、分枝点数量、包含环丙基的数量等进行了限定，其附加技术特征或者已经被对比文件1公开，或者是本领域常规选择或者是根据需要可以常规确定的，同时基于评述权利要求1和12的理由，权利要求9-11，14-17也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求19，21要求保护利用权利要求1-18所述微生物产生脂肪酸酯的方法，所述方法包括培养所述微生物和相应产物的常规分离步骤，因此，当涉及的微生物不具有创造性时，权利要求19，21也不具有专利法第22条第3款规定的创造性。
复审请求人于2019年05 月16 日提交了意见陈述书，并提交了经修改的权利要求书全文替换页（共4页19项），其中所作修改在于：权利要求1中增加技术特征“(b)编码EC 3.1.2.-或EC 3.1.1.-的硫酯酶的一种或多种外源核酸序列”，删除技术特征“其中所述核酸序列被过表达”，并将权利要求2并入权利要求1中，将权利要求1，3，5，8-12，14-17，19，21中的“脂肪酸甲酯（FAME）和/或脂肪酸乙酯（FAEE）” 或“FAME和/或FAEE”修改为“脂肪酸乙酯（FAEE）”或“FAEE”，删除权利要求4，并对权利要求编号和引用关系进行适应性修改。复审请求人认为：本申请实施例8和表8中明确证实，转入了蜡酯合酶编码序列和硫酯酶编码序列的大肠杆菌（内源性表达乙酰辅酶A羧化酶）能高效产生各种碳链长度的FAEE，其次，本申请说明书第[0100]段也明确教导了：“……在结构上脂肪酸酯具有A侧和B侧……酯的A侧用于描述醇提供的碳链，而酯的B侧用于描述酰基辅酶A提供的碳链……本文使用的脂肪酸酯是来自脂酰基硫酯和醇的酯，其中所述酯的A侧和B侧的长度可以独立的不同。通常，酯的A侧的长度至少为1，2，3，4，5，6，7或者8个碳，而酯的B侧的长度是8，10，12，14，16，18，20，24或者26个碳……”。因此，修改后的权利要求1-19在原始申请记载的范围内。新提交的权利要求书如下：
“1. 微生物，所述微生物包含：
(a)一种或多种编码包含EC 2.3.1.75的蜡酯合酶的多肽的外源核酸序列，
(b)编码EC 3.1.2.-或EC 3.1.1.-的硫酯酶的一种或多种外源核酸序列，和
(c)编码包含EC 6.4.1.2的乙酰辅酶A羧化酶的多肽的核酸序列，
其中所述微生物从碳水化合物碳源产生脂肪酸乙酯(FAEE)，并且
其中所述微生物是大肠杆菌(E.coli)。
2. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物表达一种或多种编码酶的外源核酸序列，所述酶选自EC 1.2.4.4的支链酮酸脱氢酶复合物的一种或者多种组分，EC 2.6.1.42的Ilve，EC 1.8.1.4的lpd，EC 1.1.19的Ccr，EC 5.4.99.2的IcmA，EC 5.4.99.13的IcmB，EC 2.3.1.180的fabH，EC 2.3.1.179的fabF，EC 2.3.1.180的fabH3，登录号NP_823468的fabC3，EC 2.3.1.180的β-酮酰-ACP合酶II，EC 1.3.1.34的烯酰辅酶A还原酶，EC 4.2.1.-的烯酰辅酶A异构酶，及其组合，其中所述FAEE是分枝的。
3. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物表达一种或多种编码酶的外源核酸序列，所述酶选自EC 2.3.1.41的fabB，EC 1.2.1.9的fabK，EC 1.2.1.9的fabL，EC 5.3.3.14的fabM，EC 1.3.99.3或1.3.99.-的fadE，及其组合，并且其中所述FAEE是不饱和的。
4. 如权利要求1所述的微生物，其中fadE是弱化的。
5. 如权利要求1所述的微生物，其中fadD是过表达的。
6. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物位于包含发酵肉汤的容器中，所述发酵肉汤包含至少10mg/LFAEE。
7. 如权利要求1所述的微生物用于产生FAEE的用途，其中所述FAEE包括1至5个双键。
8. 如权利要求1所述的微生物用于产生FAEE的用途，其中所述FAEE包括约8至约30的碳链长度。
9. 如权利要求1所述的微生物用于产生FAEE的用途，其中所述FAEE包括约1至约5个分枝点。
10. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物还包括具有A侧和B侧的FAEE，其中所述A侧由醇提供，所述B侧由酰基辅酶A提供。
11. 如权利要求10所述的微生物，其中所述A侧和B侧由所述微生物产生。
12. 如权利要求10所述的微生物用于产生FAEE的用途，其中所述FAEE的A侧，B侧，或A侧和B侧包含约1至约5个双键。
13. 如权利要求10所述的微生物用于产生FAEE的用途，其中FAEE的A侧，B侧，或A侧和B侧包含约1至约26的碳链长度。
14. 如权利要求10所述的微生物用于产生FAEE的用途，其中所述FAEE的A侧，B侧，或A侧和B侧包含约1至约5个碳分枝点。
15. 如权利要求10所述的微生物用于产生FAEE的用途，其中所述FAEE的A侧，B侧，或A侧和B侧包含约1至5个环丙基部分。
16. 如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是节杆菌(Arthrobacter sp.),芽孢杆菌(Bacillus sp.),布朗葡萄藻(Botryococcus braunii),着色菌(Chromatium sp.),树脂枝孢霉(Cladosporium resina)(ATCC22711),巴斯德梭状芽胞杆菌VKM(Clostridium pasteurianum VKM),破伤风形梭菌(Clostridium tenanomorphum),尿酸棱菌(Clostridium acidiurici),棒状杆菌(Corynebacterium species),蓝藻(cyanobacterial species),蓝藻(cyanobacterial species)(灰色念珠藻(Nostoc muscorum),组囊藻(Anacystis(Synechococcus)nidulans),丝状蓝藻(Phormidium luridum),佛氏绿胶蓝细菌(Chlorogloea fritschii),红海束毛藻(Trichodesmium erythaeum),Oscillatoria williamsii,微鞘藻(Microcoleus chthonoplaseis),Coccochloris elabens,Agmenellum quadruplicatum,Plectonema terebrans,具鞘微鞘藻(M vaginatus),和岩生眉藻(C.scopulorum)),脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)(ATCC29577),Kineococcus radiotolerans(BAA-149),藤黄微球菌(Micrococcus luteus)(FD533,ATCC 272,381,382,ISU,540,4698,7468,27141),小球菌(Micrococcus sp.)(ATCC 146,398,401,533),玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 412,416,516),溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus),分支杆菌(Mycobacterium species),青霉(Penicillium sp.),曲霉(Aspergillus sp.),绿色木霉(Trichoderma virida),出芽短梗霉(Pullularia pullulans),Jeotgalicoccus sp.(M.candicans)(ATCC 8456),红假单胞菌球状绿菌(Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp.),深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170),万尼氏红微菌(Rhodomicrobium vannielii),嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637,17444,17445,17666,17668,17673,17674,17679,17677),路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711),类酵母(Saccharomyces sp.)(oviformus,ludwiggi,tropicalis),弗尼斯弧菌M1(Vibrio furnissii M1),海产弧菌MP-1(Vibrio marinus MP-1),Vibrio ponticus,海红沙雷氏菌(Serratia marinorubra),玉米黑粉菌(Ustilago maydis),麦散黑粉菌(Ustilago nuda),小麦条黑粉菌(Urocystis agropyri),高粱丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)或腥黑粉菌(Tilletia sp.)(foetida,caries,controversa)。
17. 产生FAEE的方法，包括在足以产生FAEE的条件下培养权利要求1～16中任一项所述的微生物；和分离FAEE。
18. 如权利要求16所述的微生物，其中所述微生物还表达选自下列的酶：EC 2.3.1.84的醇乙酰转移酶，EC 1.1.1.1的醇脱氢酶，和EC 1.1.1.*的脂肪醇形成性酰基辅酶A还原酶。
19. 如权利要求17所述的方法，还包括：
使FAEE分离进入有机相；和
从所述有机相纯化所述FAEE。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人于2019年05月16日答复复审通知书时，提交了经修改的权利要求书全文替换页（共4页19项）。因此，本复审请求审查决定所针对的文本为：2016年02月15日提交的说明书第1-284段（即第1-57页）、说明书摘要、说明书附图图1-图10续（即第1-21页）、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-33页，以及2019年05月16日提交的权利要求第1-19项。
专利法第33条
专利法第33条规定，申请人可以对其专利申请文件进行修改，但是，对发明专利申请文件的修改不得超出原说明书和权利要求书记载的范围。
如果修改的内容没有记载在原说明书和权利要求书中，也不能由原说明书和权利要求书文字记载的内容以及说明书附图直接地、毫无疑义地确定，则该修改超范围。
本案中，利要求1请求保护一种微生物，所述微生物包含：
(a)一种或多种编码包含EC 2.3.1.75的蜡酯合酶的多肽的外源核酸序列，
(b)编码EC 3.1.2.-或EC 3.1.1.-的硫酯酶的一种或多种外源核酸序列，和
(c)编码包含EC 6.4.1.2的乙酰辅酶A羧化酶的多肽的核酸序列，
其中所述微生物从碳水化合物碳源产生脂肪酸乙酯(FAEE)，并且
其中所述微生物是大肠杆菌(E.coli)。
新修改的权利要求1的技术内容不是原说明书和权利要求书记载的内容。权利要求1包括两个并列技术方案，即：（1）所述大肠杆菌包含一种或多种编码包含EC 2.3.1.75的蜡酯合酶的多肽的外源核酸序列、编码EC 3.1.2.-或EC 3.1.1.-的硫酯酶的一种或多种外源核酸序列和编码包含EC 6.4.1.2的乙酰辅酶A羧化酶的多肽的外源核酸序列，与（2）所述大肠杆菌包含一种或多种编码包含EC 2.3.1.75的蜡酯合酶的多肽的外源核酸序列、编码EC 3.1.2.-或EC 3.1.1.-的硫酯酶的一种或多种外源核酸序列和包含编码包含EC 6.4.1.2的乙酰辅酶A羧化酶的多肽的内源核酸序列。虽然本申请说明书第105段记载了“在一个实施方式中，脂肪酯产物具有24-32个碳原子的碳原子含量。在另一个实施方式中，脂肪酯产物具有14和20个碳的碳含量。在另一个实施方式中， 脂肪酯是C16:1的乙酯。在另一个实施方式中，脂肪酸酯是辛醇的十八烷酯”；第215段也对脂肪酸衍生物进行了举例，其为C16:1乙酯或者C18:1乙酯；而且实施例7和8涉及产生脂肪酸乙酯，但实施例7中记载C16乙酯是最主要的酯，实施例8产生的特定脂肪酸乙酯种类如表8所示，而实施例7和8中产生了特定碳链程度的脂肪酸乙酯的微生物中并未转入外源的乙酰辅酶A羧化酶基因。即原说明书中仅在发明内容部分记载了产生特定碳链长度的脂肪酸乙酯，未记载包含外源蜡酯合酶、外源硫酯酶和内源乙酰辅酶A羧化酶的微生物产生除上述特定碳链长度以外的其他碳链长度的脂肪酸乙酯；也未记载包含外源蜡酯合酶、外源硫酯酶和外源乙酰辅酶A羧化酶的微生物产生脂肪酸乙酯。因此，根据原说明书和权利要求书记载的内容，不能直接地、毫无疑义地确定包含外源蜡酯合酶、外源硫酯酶和内源乙酰辅酶A羧化酶的微生物产生除说明书中记载的特定碳链长度以外的其他碳链长度的脂肪酸乙酯，也不能直接地、毫无疑义地确定包含外源蜡酯合酶、外源硫酯酶和外源乙酰辅酶A羧化酶的微生物产生脂肪酸乙酯。因此，权利要求1的修改超出了原始申请文件记载的范围，不符合专利法第33条的规定。基于同样理由，权利要求2-19也不符合专利法第33条的规定。
针对复审请求人的意见陈述，合议组认为：如前所述，本申请实施例8和表8中虽然证实了转入了蜡酯合酶和硫酯酶的大肠杆菌能产生脂肪酸乙酯，但是实施例8中所述的重组大肠杆菌中并未转入外源的乙酰辅酶A羧化酶基因，而且其只产生了C12:1，C14:1，C16:1，C18:1乙酯等特定碳链长度的脂肪酸乙酯。本申请说明书第[0100]段中也记载了酯的A侧和B侧的长度为特定长度的碳，如酯的A侧的长度至少为1，2，3，4，5，6，7或者8个碳，而酯的B侧的长度是8，10，12，14，16，18，20，22，24或者26个碳，也即本申请中重组微生物产生的脂肪酸酯仅为上述特定碳链长度的脂肪酸酯。因此，根据原说明书和权利要求书记载的内容，仍然不能直接地、毫无疑义地确定包含外源蜡酯合酶、外源硫酯酶和内源乙酰辅酶A羧化酶的微生物产生除说明书中记载的特定碳链长度以外的其它碳链长度的脂肪酸乙酯，也不能直接地、毫无疑义地确定包含外源蜡酯合酶、外源硫酯酶和外源乙酰辅酶A羧化酶的微生物产生脂肪酸乙酯。综上，复审请求人陈述的关于本发明的修改符合专利法第33条的规定的理由不具备说服力。
根据以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018 年01 月29 日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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