发明创造名称：提高免疫检测准确性和线性范围的方法及试剂
外观设计名称：
决定号：189265
决定日：2019-09-02
委内编号：1F249740
优先权日：
申请（专利）号：201510952436.5
申请日：2015-12-17
复审请求人：艾康生物技术（杭州）有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：徐恩波
合议组组长：张礅
参审员：安晶
国际分类号：G01N33/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求请求保护的技术方案相对于一份对比文件存在区别技术特征，该区别技术特征是本领域的公知常识，那么本领域技术人员在上述对比文件以及本领域公知常识结合的基础上得到该权利要求请求保护的技术方案是显而易见的，该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510952436.5、名称为“提高免疫检测准确性和线性范围的方法及试剂”的发明专利申请（下称本申请），其申请日为2015年12月17日，公开日为2016年02月24日，申请人为艾康生物技术（杭州）有限公司。
经实质审查，国家知识产权局专利实质审查部门于2017年12月20日以权利要求1-2、4-6、8不具备专利法第22条第3款所规定的创造性为由驳回了本申请。并在其他说明中指出：权利要求3、7不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。在驳回决定中，引用了如下对比文件：
对比文件1：US 2003/0027234A1，公开日为2003年02月06日。
驳回决定所针对的文本为：2017年11月07日提交的权利要求第1-8项；申请日2015年12月17日提交的说明书第1-22页、说明书附图第1页和说明书摘要。
驳回决定所针对的权利要求如下：
“1. 一种提高免疫分析仪检测准确性的方法，其步骤包括：(1)提供免疫分析仪；(2)将样本与生物素标记抗体和亲和素类物质固定的固相孵育，形成反应混合液；(3)往所述反应混合液中加入吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体，再进行孵育；(4)除去步骤(3)中未结合的生物素标记抗体和未结合的吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体；(5)加入促发液后，化学发光信号产生，利用所述免疫分析仪检测所述化学发光信号的发光量。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体中的抗体同时选自抗铁蛋白抗体或抗CA19-9抗体。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中的免疫分析仪含有反应杯；步骤(2)的亲和素类物质固定的固相为Dynabeads M-270链霉亲和素磁珠，其具体过程为：往反应杯中加入10μl样本、50μl 0.1～5.0μg/ml生物素标记抗体和50μl 1.0mg/mL Dynabeads M-270链霉亲和素磁珠悬浮液，在37℃下孵育20min，形成反应混合液，其中所述链霉亲和素磁珠悬浮液为0.01M PBS缓冲液，pH 7.4，含有0.1％BSA和0.02％叠氮钠；步骤(3)的具体过程为：往所述反应混合液中加入50μl 0.1～5.0μg/ml吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体，在37℃下孵育10min；步骤(4)涉及使用磁场和清洗液，其具体过程为：在磁场的作用下，将磁珠吸附到反应杯的内壁上，除去反应杯内的溶液，接着往反应杯中加入清洗液重悬磁珠，然后再在磁场的作用下，除去反应杯内的溶液，利用所述清洗液重复洗涤磁珠3次，从而除去未结合的生物素标记抗体和吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体，其中所述清洗液为0.01M PBST缓冲液；步骤(5)中的促发液包括促发液A和促发液B，其具体过程为：先后加入250μl促发液A和250μl促发液B，化学发光信号产生，利用所述免疫分析仪检测所述化学发光信号的发光量，其中促发液A为含质量浓度0.25％过氧化氢的0.1N硝酸溶液，促发液B为含体积浓度0.5％Triton X-100的0.25N氢氧化钠溶液。
4. 如权利要求1～3之一所述的方法，所述生物素标记抗体的浓度为0.4～0.8μg/ml，所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体的浓度为2.5～5.0μg/ml。
5. 一种提高样本中分析物化学发光免疫检测线性范围的方法，其步骤包括：(1)往所述样本中加入生物素标记抗体和亲和素类物质固定的固相，进行孵育，形成 反应混合液；(2)往所述反应混合液中加入吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体，再进行孵育；(3)加入清洗液除去步骤(2)中未结合的生物素标记抗体和未结合的吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体；(4)加入促发液后，化学发光信号产生，测定其发光量。
6. 如权利要求5所述的方法，所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体中的抗体同时选自抗铁蛋白抗体或抗CA19-9抗体。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(1)的亲和素类物质固定的固相为Dynabeads M-270链霉亲和素磁珠，且步骤(1)涉及使用反应杯，其具体过程为：往反应杯中加入10μl样本、50μl 0.1～5.0μg/ml生物素标记抗体和50μl 1.0mg/mL Dynabeads M-270链霉亲和素磁珠悬浮液，在37℃下孵育20min，形成反应混合液，其中所述链霉亲和素磁珠悬浮液为0.01M PBS缓冲液，pH 7.4，含有0.1％BSA和0.02％叠氮钠；步骤(2)的具体过程为：往所述反应混合液中加入50μl 0.1～5.0μg/ml吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体，在37℃下孵育10min；步骤(3)涉及使用磁场和清洗液，其具体过程为：在磁场的作用下，将磁珠吸附到反应杯的内壁上，除去反应杯内的溶液，接着往反应杯中加入清洗液重悬磁珠，然后再在磁场的作用下，除去反应杯内的溶液，利用所述清洗液重复洗涤磁珠3次，从而除去未结合的生物素标记抗体和吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体，其中所述清洗液为0.01M PBST缓冲液；步骤(4)中的促发液包括促发液A和促发液B，其具体过程为：先后加入250μl促发液A和250μl促发液B，化学发光信号产生，利用所述免疫分析仪检测所述化学发光信号的发光量，其中促发液A为含质量浓度0.25％过氧化氢的0.1N硝酸溶液，促发液B为含体积浓度0.5％Triton X-100的0.25N氢氧化钠溶液。
8. 如权利要求5～7之一所述的方法，所述生物素标记抗体的浓度为0.4～0.8μg/ml，所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体的浓度为2.5～5.0μg/ml。”
驳回决定中指出：（1）权利要求1请求保护一种提高免疫分析仪检测准确性的方法。对于吖啶酯标记抗体的技术方案，权利要求1要求保护的技术方案和对比文件1的区别技术特征在于：在步骤（2）后无清洗步骤。上述区别技术特征是本领域的常用技术手段，因此在对比文件1的基础上结合本领域的常用技术手段得到权利要求1要求保护的技术方案对本领域的技术人员来说是显而易见的，所以权利要求1不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。此外，吖啶磺酰胺属于免疫检测中常用化学发光剂，因此权利要求1中吖啶磺酰胺标记抗体的技术方案也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。（2）从属权利要求2、4的附加技术特征或被对比文件1公开，或属于本领域的常用技术手段，因此在引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求2、4也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。（3）权利要求5请求保护一种提高样本中分析物化学发光免疫检测线性范围的方法。对于吖啶酯标记抗体的技术方案，权利要求5要求保护的技术方案和对比文件1的区别技术特征在于：在步骤（2）后无清洗步骤。上述区别技术特征是本领域的常用技术手段，因此在对比文件1的基础上结合本领域的常用技术手段得到权利要求5要求中吖啶酯标记抗体的技术方案对本领域的技术人员来说是显而易见的，所以权利要求5不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。此外，吖啶磺酰胺属于免疫检测中常用化学发光剂，因此权利要求5中吖啶磺酰胺标记抗体的技术方案也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。（4）从属权利要求6、8的附加技术特征或被对比文件1公开，或属于本领域的常用技术手段，因此在引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求6、8也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。（5）在其他说明中指出：从属权利要求3、7的附加技术特征或被对比文件1公开，或属于本领域的常用技术手段，因此在引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求3、7也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。
申请人艾康生物技术（杭州）有限公司（下称复审请求人）不服上述驳回决定，于2018年04月03日向国家知识产权局提出复审请求，同时提交了权利要求书的全文修改替换页，修改具体涉及：将权利要求1中的“(1)提供免疫分析仪；(2)将样本与生物素标记抗体和亲和素类物质固定的固相孵育，形成反应混合液；(3)往所述反应混合液中加入吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体，再进行孵育；(4)除去步骤(3)中未结合的生物素标记抗体和未结合的吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体；(5)加入促发液后，化学发光信号产生，利用所述免疫分析仪检测所述化学发光信号的发光量”修改为“(1)提供免疫分析仪，所述免疫分析仪含有反应杯；(2)往反应杯中加入10μl样本、50μl 0.1～5.0μg/ml生物素标记抗体和50μl 1.0mg/mL Dynabeads M-270链霉亲和素磁珠悬浮液，在37℃下孵育20min，形成反应混合液，其中所述链霉亲和素磁珠悬浮液为0.01M PBS缓冲液，pH 7.4，含有0.1％BSA和0.02％叠氮钠；(3)往所述反应混合液中加入50μl 0.1～5.0μg/ml吖啶酯标记抗体，在37℃下孵育10min；(4)在磁场的作用下，将磁珠吸附到反应杯的内壁上，除去反应杯内的溶液，接着往反应杯中加入清洗液重悬磁珠，然后再在磁场的作用下，除去反应杯内的溶液，利用所述清洗液重复洗涤磁珠3次，从而除去未结合的生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体，其中所述清洗液为0.01M PBST缓冲液；(5)先后加入250μl促发液A和250μl促发液B，化学发光信号产生，利用所述免疫分析仪检测所述化学发光信号的发光量，其中促发液A为含质量浓度0.25％过氧化氢的0.1N硝酸溶液，促发液B为含体积浓度0.5％Triton X-100的0.25N氢氧化钠溶液；(6)根据步骤(5)中的发光量和事先制定好的标准曲线，计算出样本中分析物的浓度；所述分析物为铁蛋白或CA19-9”，并增加了铁蛋白和CA19-9的标准曲线的制定过程，以及生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体的选择和制备过程；删除了原权利要求2和3，修改了原权利要求4的编号和引用关系；根据说明书实施例5的内容增加新的权利要求3-5；将原权利要求5的编号修改为权利要求6，将其中的“(1)往所述样本中加入生物素标记抗体和亲和素类物质固定的固相，进行孵育，形成 反应混合液；(2)往所述反应混合液中加入吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体，再进行孵育；(3)加入清洗液除去步骤(2)中未结合的生物素标记抗体和未结合的吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体；(4)加入促发液后，化学发光信号产生，测定其发光量”修改为“(1)往反应杯中加入10μl样本、50μl 0.1～5.0μg/ml生物素标记抗体和50μl 1.0mg/mL Dynabeads M-270链霉亲和素磁珠悬浮液，在37℃下孵育20min，形成反应混合液，其中所述链霉亲和素磁珠悬浮液为0.01M PBS缓冲液，pH 7.4，含有0.1％BSA和0.02％叠氮钠；(2)往所述反应混合液中加入50μl 0.1～5.0μg/ml吖啶酯标记抗体，在37℃下孵育10min；(3)在磁场的作用下，将磁珠吸附到反应杯的内壁上，除去反应杯内的溶液，接着往反应杯中加入清洗液重悬磁珠，然后再在磁场的作用下，除去反应杯内的溶液，利用所述清洗液重复洗涤磁珠3次，从而除去未结合的生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体，其中所述清洗液为0.01M PBST缓冲液； (4)先后加入250μl促发液A和250μl促发液B，化学发光信号产生，利用所述免疫分析仪检测所述化学发光信号的发光量，其中促发液A为含质量浓度0.25％过氧化氢的0.1N硝酸溶液，促发液B为含体积浓度0.5％Triton X-100的0.25N氢氧化钠溶液；(5)根据步骤(4)中的发光量和事先制定好的标准曲线，计算出样本中分析物的浓度；所述分析物为铁蛋白或CA19-9”，并增加了铁蛋白和CA19-9的标准曲线的制定过程，以及生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体的选择和制备过程；删除了原权利要求6和7，修改原权利要求8的编号和引用关系；根据说明书实施例5的内容增加新的权利要求8-10。 复审请求人认为：1）本申请中，生物素与抗体的摩尔比过量和吖啶酯与抗体的摩尔比过量，使得参与反应的抗体充分利用，提高生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体的产量，降低抗体的使用成本，同时使得生物标记抗体上携带的生物素和吖啶酯标记抗体上携带的吖啶酯数量显著增加，使得单个生物素标记抗体可以结合更多的链霉亲和素磁珠，导致最终的反应产物携带的吖啶酯数量显著增加，扩了化学发光信号，使得检测结果更加准确。本申请实施例6和7证明，本申请的方法与罗氏电化学发光平台的准确性不相上下，达到了业内规定的正常范围；2）本申请的清洗步骤和次数少于对比文件1，且使用的试剂用量也小于对比文件1，从而检测成本低，检测时间短，且该些特征与采用的生物素标记抗体和吖啶酯标记的制备过程结合在一起，检测准确性好，且能够更为准确的计算出高浓度的铁蛋白和CA19-9；3）本申请通过增加高浓度校准品的比值，能够更好地判断所绘制的标准曲线是否能够更好地将高浓度的校准品发光量区分开来，从而确保在检测高浓度临床样品时也具有不错的准确性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年06月28日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年06月12日向复审请求人发出复审通知书，指出：（1）权利要求1和权利要求6中的表述：“其中当生物素标记抗体的浓度为0.4～0.8μg/ml，吖啶酯标记抗体的浓度为2.5～5μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值为1.566～1.891” 没有在原说明书和权利要求书中记载，并且本领域技术人员也不能从原说明书和权利要求书记载的内容中直接地、毫无疑义地确定，所以权利要求1、6的修改超范围，不符合专利法第33条的规定。（2）假设复审请求人将权利要求1、6中的上述表述修改为：“当生物素标记抗体的浓度和吖啶酯标记抗体的浓度分别为0.8μg/ml和5μg/ml、0.5μg/ml和4μg/ml、0.4μg/ml和2.5μg/ml、0.4μg/ml和4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值分别为1.658、1.891、1.566、1.823”。则权利要求1-10不具备专利法第22条第3款所规定的创造性，具体理由如下：a.权利要求1要求保护一种提高免疫分析仪检测准确性的方法，权利要求6要求保护一种提高样本中分析物化学发光免疫检测线性范围的方法。权利要求1、6与对比文件1的区别特征在于：①分析物为铁蛋白或CA19-9；②加入10μl样本、50μl抗体、50μl 1.0mg/mL的链霉亲和素磁珠悬浮液，链霉亲和素磁珠悬浮液为0.01M PBS缓冲液，pH7.4，含有0.1% BSA和0.02%叠氮钠；反应混合液孵育时间为30分钟；先后加入250μl促发液A和250μl促发液B，促发液A为含质量浓度0.25％过氧化氢的0.1N硝酸溶液，促发液B为含体积浓度0.5％Triton X-100的0.25N氢氧化钠溶液；③形成反应混合液后不包括清洗步骤，加入吖啶酯之后的清洗步骤中在除去反应杯内的溶液后，接着往反应杯中加入清洗液重悬磁珠，然后再在磁场的作用下，除去反应杯内的溶液，利用所述清洗液重复洗涤磁珠3次，从而除去未结合的生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体，其中所述清洗液为0.01M PBST缓冲液；④根据步骤(5)中的发光量和事先制定好的标准曲线，计算出样本中分析物的浓度；当分析物为铁蛋白时，生物素标记抗体中的抗体和吖啶酯标记抗体中的抗体同时选自小鼠抗铁蛋白单克隆抗体，所述标准曲线的制定过程如下所示：a)首先利用小牛血清和铁蛋白配制出不同浓度的铁蛋白校准品，其浓度分别为0ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml和2000ng/ml；b)在反应杯中，按照步骤(1)～(5)检测不同浓度的铁蛋白校准品的发光量，其中每个浓度的铁蛋白校准品平行检测两次，求其平均发光量，然后利用与铁蛋白校准品浓度的函数关系，制作标准曲线，其中当生物素标记抗体的浓度和吖啶酯标记抗体的浓度分别为0.8μg/ml和5μg/ml、0.5μg/ml和4μg/ml、0.4μg/ml和2.5μg/ml、0.4μg/ml和4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值分别为1.658、1.891、1.566、1.823，能有效地将1000ng/ml和2000ng/ml铁蛋白校准品的发光量区分开来；当所述分析物为CA19-9时，生物素标记抗体中的抗体和吖啶酯标记抗体中的抗体同时选自或小鼠抗CA19-9单克隆抗体，所述标准曲线的制定过程如下所示：a)首先利用pH 7.4的0.01M PBS缓冲液和CA19-9配制浓度分别为5U/ml、50U/ml、200U/ml、600U/ml和1200U/ml的CA19-9校准品；b)在反应杯中，按照步骤(1)～(5)检测不同浓度的CA19-9校准品的发光量，其中每个浓度的CA19-9校准品平行检测两次，求其平均发光量，然后利用与CA19-9校准品浓度的函数关系，制作标准曲线，其中当所述生物素标记抗体的浓度为0.65μg/ml和所述吖啶酯标记抗体的浓度为3.0μg/ml时，1200U/mlCA19-9校准品溶液的发光量与600U/ml CA19-9校准品溶液的发光量的比值为1.722，能够更好地将高浓度CA19-9校准品的发光值区分开来；⑤所述生物素标记抗体的制备过程如下所示：1)取1mg抗体，加入适量0.01M PBS缓冲液(pH7.2～7.4)，获得终浓度为1mg/mL的抗体溶液，并加入透析袋中；2)往透析袋中加入不小于500ml的0.01M PBS缓冲液(pH7.2～7.4)进行透析，每次透析时间不小于4h，重复换透析液3～4次，然后将透析后的抗体溶液转移至Eppendorf管内；3)称取1mg NHS-LC-Biotin，加入适量水，获得终浓度为2mg/mL的NHS-LC-Biotin溶液；4)按5～50倍NHS-LC-Biotin与抗体的摩尔比例进行标记，取适当体积的NHS-LC-Biotin溶液加入到步骤2)中装有抗体的Eppendorf管中混匀，并置于旋转反应器上，室温反应30min，形成反应混合液；5)将步骤4)中的反应混合液转移入透析袋中，并将透析袋置入不小于500ml的0.01M PBS缓冲液(pH7.2～7.4)中进行透析，重复更换透析液3～4次，每次透析时间为不小于4h，然后收集生物素标记抗体原液，其体积为V1；6)往收集的原液中添加(0.1×V1)体积的含5％BSA的0.01M PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)，获得生物素标记抗体母液，于2～8℃下保存；7)利用生物素标记抗体稀释液对步骤6)中所获得的生物素标记抗体母液进行稀释，获得生物素标记抗体工作液，其中所述生物素标记抗体稀释液为pH 7.4 的0.01M PBS缓冲液；⑥所述吖啶酯标记抗体的制备过程如下所示：(a)取1mg抗体，加入适量0.1M NaHCO3溶液(pH8.0～9.6)，获得终浓度为1mg/mL的抗体溶液，并加入透析袋中；(b)往透析袋中加入不小于500ml的0.1M NaHCO3溶液(pH 8.0～9.6)进行透析，每次透析时间不小于4h，重复换透析液3～4次，然后将透析后的抗体溶液转移至Eppendorf管内；(c)称取1mg吖啶酯溶于适量的二甲基甲酰胺(DMF)试剂中，获得终浓度为1mg/mL的吖啶酯溶液；(d)按5～50倍吖啶酯与抗体的摩尔比例进行标记，取适当体积的吖啶酯溶液加入到步骤2中装有抗体的Eppendorf管中轻微混匀，并置于旋转反应器上，室温反应30min，形成反应混合液；(e)将步骤(d)中的反应混合液转移入透析袋中，并将透析袋置入不小于500ml的0.01M PBS缓冲液(pH6.0～6.5)中进行透析，重复更换透析液3～4次，每次透析时间为不小于4h，然后收集吖啶酯标记抗体原液，其体积为V2；(f)往收集的原液中添加(0.1×V2)体积的含5％BSA的0.01M PBS缓冲液(pH6.0～6.5)，获得吖啶酯标记抗体母液，于2～8℃下保存；(g)利用吖啶酯标记抗体稀释液对步骤(f)中所获得的吖啶酯标记抗体母液进行稀释，获得吖啶酯标记抗体工作液，其中所述吖啶酯标记抗体稀释液为pH7.4的0.01M PBS缓冲液。上述区别技术特征①-⑥是本领域的常用技术手段。因此在对比文件1的基础上结合本领域的常用技术手段得到权利要求1、6要求保护的技术方案对本领域的技术人员来说是显而易见的，所以权利要求1、6不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。b.从属权利要求2-5、7-10的附加技术特征或被对比文件1公开，或属于本领域的常用技术手段，因此在引用的权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求2-5、7-10也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。（3）合议组针对复审请求人的意见陈述进行了回应。
针对上述复审通知书，复审请求人于2019年07月08日提交了意见陈述书和经过修改的申请文件，修改具体涉及：将权利要求1、6中的“其中当生物素标记抗体的浓度为0.4～0.8μg/ml，吖啶酯标记抗体的浓度为2.5～5μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值为1.566～1.891”修改为：“其中当生物素标记抗体的浓度和吖啶酯标记抗体的浓度分别为0.8μg/ml，5μg/ml；0.5μg/ml，4μg/ml；0.4μg/ml，2.5μg/ml；0.4μg/ml，4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值分别为1.658、1.891、1.566、1.823”。复审请求人在意见陈述书中陈述了修改后的权利要求1、6符合专利法第33条的规定以及权利要求1-10具备专利法第22条第3款所规定的创造性的理由。
修改后的权利要求如下：
“1. 一种提高免疫分析仪检测准确性的方法，其步骤包括：(1)提供免疫分析仪，所述免疫分析仪含有反应杯；
(2)往反应杯中加入10μl样本、50μl 0.1~5.0μg/ml生物素标记抗体和50μl 1.0mg/mL Dynabeads M-270链霉亲和素磁珠悬浮液，在37℃下孵育20min，形成反应混合液，其中所述链霉亲和素磁珠悬浮液为0.01M PBS缓冲液，pH 7.4，含有0.1％BSA和0.02％叠氮钠；
(3)往所述反应混合液中加入50μl 0.1～5.0μg/ml吖啶酯标记抗体，在37℃下孵育10min；
(4)在磁场的作用下，将磁珠吸附到反应杯的内壁上，除去反应杯内的溶液，接着往反应杯中加入清洗液重悬磁珠，然后再在磁场的作用下，除去反应杯内的溶液，利用所述清洗液重复洗涤磁珠3次，从而除去未结合的生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体，其中所述清洗液为0.01M PBST缓冲液；
(5)先后加入250μl促发液A和250μl促发液B，化学发光信号产生，利用所述免疫分析仪检测所述化学发光信号的发光量，其中促发液A为含质量浓度0.25％过氧化氢的0.1N硝酸溶液，促发液B为含体积浓度0.5％Triton X-100的0.25N氢氧化钠溶液；
(6)根据步骤(5)中的发光量和事先制定好的标准曲线，计算出样本中分析物的浓度；所述分析物为铁蛋白或CA19-9；当所述分析物为铁蛋白时，所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯标记抗体中的抗体同时选自小鼠抗铁蛋白单克隆抗体，所述标准曲线的制定过程如下所示：
a)首先利用小牛血清和铁蛋白配制出不同浓度的铁蛋白校准品，其浓度分别为0ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml和2000ng/ml；
b)在反应杯中，按照步骤(1)～(5)检测不同浓度的铁蛋白校准品的发光量，其中每个浓度的铁蛋白校准品平行检测两次，求其平均发光量，然后利用与铁蛋白校准品浓度的函数关系，制作标准曲线，其中当生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体的浓度分别为0.8μg/ml，5μg/ml；0.5μg/ml，4μg/ml；0.4μg/ml、2.5μg/ml；0.4μg/ml，4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值分别为1.658、1.891、1.566和1.823，能有效地将1000ng/ml和2000ng/ml铁蛋白校准品的发光量区分开来；当所述分析物为CA19-9时，所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯标记抗体中的抗体同时选自小鼠抗CA19-9单克隆抗体，所述标准曲线的制定过程如下所示：
a)首先利用pH 7.4的0.01M PBS缓冲液和CA19-9配制浓度分别为5U/ml、50U/ml、200U/ml、600U/ml和1200U/ml的CA19-9校准品；
b)在反应杯中，按照步骤(1)～(5)检测不同浓度的CA19-9校准品的发光量，其中每个浓度的CA19-9校准品平行检测两次，求其平均发光量，然后利用与CA19-9校准品浓度的函数关系，制作标准曲线，其中当所述生物素标记抗体的浓度为0.65μg/ml和所述吖啶酯标记抗体的浓度为3.0μg/ml时，1200U/ml CA19-9校准品溶液的发光量与600U/ml CA19-9校准品溶液的发光量的比值为1.722，能够更好地将高浓度CA19-9校准品的发光值区分开来；
其中所述生物素标记抗体的制备过程如下所示：
1)取1mg抗体，加入适量0.01M PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)，获得终浓度为1mg/mL的抗体溶液，并加入透析袋中；
2)往透析袋中加入不小于500ml的0.01M PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)进行透析，每次透析时间不小于4h，重复换透析液3～4次，然后将透析后的抗体溶液转移至Eppendorf管内；
3)称取1mg NHS-LC-Biotin，加入适量水，获得终浓度为2mg/mL的NHS-LC-Biotin溶液；
4)按5～50倍NHS-LC-Biotin与抗体的摩尔比例进行标记，取适当体积的NHS-LC-Biotin溶液加入到步骤2)中装有抗体的Eppendorf管中混匀，并置于旋转反应器上，室温反应30min，形成反应混合液；
5)将步骤4)中的反应混合液转移入透析袋中，并将透析袋置入不小于500ml的0.01M PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)中进行透析，重复更换透析液3～4次，每次透析时间为不小于4h，然后收集生物素标记抗体原液，其体积为V1；
6)往收集的原液中添加(0.1×V1)体积的含5％BSA的0.01M PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)，获得生物素标记抗体母液，于2～8℃下保存；
7)利用生物素标记抗体稀释液对步骤6)中所获得的生物素标记抗体母液进行稀释，获得生物素标记抗体工作液，其中所述生物素标记抗体稀释液为pH 7.4 的0.01M PBS缓冲液；
其中所述吖啶酯标记抗体的制备过程如下所示：
(a)取1mg抗体，加入适量0.1M NaHCO3溶液(pH 8.0～9.6)，获得终浓度为1mg/mL的抗体溶液，并加入透析袋中；
(b)往透析袋中加入不小于500ml的0.1M NaHCO3溶液(pH 8.0～9.6)进行透析，每次透析时间不小于4h，重复换透析液3～4次，然后将透析后的抗体溶液转移至Eppendorf管内；
(c)称取1mg吖啶酯溶于适量的二甲基甲酰胺(DMF)试剂中，获得终浓度为1mg/mL的吖啶酯溶液；
(d)按5～50倍吖啶酯与抗体的摩尔比例进行标记，取适当体积的吖啶酯溶液加入到步骤2中装有抗体的Eppendorf管中轻微混匀，并置于旋转反应器上，室温反应30min，形成反应混合液；
(e)将步骤(d)中的反应混合液转移入透析袋中，并将透析袋置入不小于500ml的0.01M PBS缓冲液(pH 6.0～6.5)中进行透析，重复更换透析液3～4次，每次透析时间为不小于4h，然后收集吖啶酯标记抗体原液，其体积为V2；
(f)往收集的原液中添加(0.1×V2)体积的含5％BSA的0.01M PBS缓冲液(pH 6.0～6.5)，获得吖啶酯标记抗体母液，于2～8℃下保存；
(g)利用吖啶酯标记抗体稀释液对步骤(f)中所获得的吖啶酯标记抗体母液进行稀释，获得吖啶酯标记抗体工作液，其中所述吖啶酯标记抗体稀释液为pH 7.4的0.01M PBS缓冲液。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物素标记抗体的浓度为0.4～0.8μg/ml，所述吖啶酯标记抗体的浓度为2.5～5.0μg/ml。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分析物为铁蛋白，所述生物素标记抗体的浓度为0.8μg/ml，所述吖啶酯标记抗体的浓度为5μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值为1.659。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分析物为铁蛋白，所述生物素标记抗体的浓度为0.5μg/ml，所述吖啶酯标记抗体的浓度为4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平 均发光量的比值为1.891。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分析物为铁蛋白，所述生物素标记抗体的浓度为0.4μg/ml，所述吖啶酯标记抗体的浓度为4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值为1.823。
6. 一种提高样本中分析物化学发光免疫检测线性范围的方法，其步骤包括：
(1)往反应杯中加入10μl样本、50μl 0.1～5.0μg/ml生物素标记抗体和50μl 1.0mg/mL Dynabeads M-270链霉亲和素磁珠悬浮液，在37℃下孵育20min，形成反应混合液，其中所述链霉亲和素磁珠悬浮液为0.01M PBS缓冲液，pH 7.4，含有0.1％BSA和0.02％叠氮钠；
(2)往所述反应混合液中加入50μl 0.1～5.0μg/ml吖啶酯标记抗体，在37℃下孵育10min；
(3)在磁场的作用下，将磁珠吸附到反应杯的内壁上，除去反应杯内的溶液，接着往反应杯中加入清洗液重悬磁珠，然后再在磁场的作用下，除去反应杯内的溶液，利用所述清洗液重复洗涤磁珠3次，从而除去未结合的生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体，其中所述清洗液为0.01M PBST缓冲液；
(4)先后加入250μl促发液A和250μl促发液B，化学发光信号产生，利用所述免疫分析仪检测所述化学发光信号的发光量，其中促发液A为含质量浓度0.25％过氧化氢的0.1N硝酸溶液，促发液B为含体积浓度0.5％Triton X-100的0.25N氢氧化钠溶液；
(5)根据步骤(4)中的发光量和事先制定好的标准曲线，计算出样本中分析物的浓度；所述分析物为铁蛋白或CA19-9；当所述分析物为铁蛋白时，当所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯标记抗体中的抗体同时选自小鼠抗铁蛋白单克隆抗体，所述标准曲线的制定过程如下所示：
a)首先利用小牛血清和铁蛋白配制出不同浓度的铁蛋白校准品，其浓度分别为0ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml和2000ng/ml；
b)在反应杯中，按照步骤(1)～(4)检测不同浓度的铁蛋白校准品的发光量，其中每个浓度的铁蛋白校准品平行检测两次，求其平均发光量，然后利用与铁蛋白校准品浓度的函数关系，制作标准曲线，其中当生物素标记抗体和吖啶酯标记 抗体的浓度分别为0.8μg/ml，5μg/ml；0.5μg/ml，4μg/ml；0.4μg/ml、2.5μg/ml；0.4μg/ml，4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值分别为1.658、1.891、1.566和1.823，能有效地将1000ng/ml和2000ng/ml铁蛋白校准品的发光量区分开来；当所述分析物为CA19-9时，所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯标记抗体中的抗体同时选自小鼠抗CA19-9单克隆抗体，所述标准曲线的制定过程如下所示：
a)首先利用pH 7.4的0.01M PBS缓冲液和CA19-9配制浓度分别为5U/ml、50U/ml、200U/ml、600U/ml和1200U/ml的CA19-9校准品；
b)在反应杯中，按照步骤(1)～(4)检测不同浓度的CA19-9校准品的发光量，其中每个浓度的CA19-9校准品平行检测两次，求其平均发光量，然后利用与CA19-9校准品浓度的函数关系，制作标准曲线，其中当所述生物素标记抗体的浓度为0.65μg/ml和所述吖啶酯标记抗体的浓度为3.0μg/ml时，1200U/ml CA19-9校准品溶液的平均发光量与600U/ml CA19-9校准品溶液的平均发光量的比值为1.722，能够更好地将高浓度CA19-9校准品的发光值区分开来；
其中所述生物素标记抗体的制备过程如下所示：
1)取1mg抗体，加入适量0.01M PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)，获得终浓度为1mg/mL的抗体溶液，并加入透析袋中；
2)往透析袋中加入不小于500ml的0.01M PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)进行透析，每次透析时间不小于4h，重复换透析液3～4次，然后将透析后的抗体溶液转移至Eppendorf管内；
3)称取1mg NHS-LC-Biotin，加入适量水，获得终浓度为2mg/mL的NHS-LC-Biotin溶液；
4)按5～50倍NHS-LC-Biotin与抗体的摩尔比例进行标记，取适当体积的NHS-LC-Biotin溶液加入到步骤2)中装有抗体的Eppendorf管中混匀，并置于旋转反应器上，室温反应30min，形成反应混合液；
5)将步骤4)中的反应混合液转移入透析袋中，并将透析袋置入不小于500ml的0.01M PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)中进行透析，重复更换透析液3～4次，每次透析时间为不小于4h，然后收集生物素标记抗体原液，其体积为V1；
6)往收集的原液中添加(0.1×V1)体积的含5％BSA的0.01M PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)，获得生物素标记抗体母液，于2～8℃下保存；
7)利用生物素标记抗体稀释液对步骤6)中所获得的生物素标记抗体母液进行稀释，获得生物素标记抗体工作液，其中所述生物素标记抗体稀释液为pH 7.4的0.01M PBS缓冲液；
其中所述吖啶酯标记抗体的制备过程如下所示：
(a)取1mg小鼠单克隆抗体，加入适量0.1M NaHCO3溶液(pH 8.0～9.6)，获得终浓度为1mg/mL的抗体溶液，并加入透析袋中；
(b)往透析袋中加入不小于500ml的0.1M NaHCO3溶液(pH 8.0～9.6)进行透析，每次透析时间不小于4h，重复换透析液3～4次，然后将透析后的抗体溶液转移至Eppendorf管内；
(c)称取1mg吖啶酯溶于适量的二甲基甲酰胺(DMF)试剂中，获得终浓度为1mg/mL的吖啶酯溶液；
(d)按5～50倍吖啶酯与抗体的摩尔比例进行标记，取适当体积的吖啶酯溶液加入到步骤2中装有抗体的Eppendorf管中轻微混匀，并置于旋转反应器上，室温反应30min，形成反应混合液；
(e)将步骤(d)中的反应混合液转移入透析袋中，并将透析袋置入不小于500ml的0.01M PBS缓冲液(pH 6.0～6.5)中进行透析，重复更换透析液3～4次，每次透析时间为不小于4h，然后收集吖啶酯标记抗体原液，其体积为V2；
(f)往收集的原液中添加(0.1×V2)体积的含5％BSA的0.01M PBS缓冲液(pH 6.0～6.5)，获得吖啶酯标记抗体母液，于2～8℃下保存；
(g)利用吖啶酯标记抗体稀释液对步骤(f)中所获得的吖啶酯标记抗体母液进行稀释，获得吖啶酯标记抗体工作液，其中所述吖啶酯标记抗体稀释液为pH 7.4的0.01M PBS缓冲液。
7. 如权利要求6所述的方法，所述生物素标记抗体的浓度为0.4～0.8μg/ml，所述吖啶酯标记抗体的浓度为2.5～5.0μg/ml。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分析物为铁蛋白，所述生物素标记抗体的浓度为0.8μg/ml，所述吖啶酯标记抗体的浓度为5μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平 均发光量的比值为1.659。
9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分析物为铁蛋白，所述生物素标记抗体的浓度为0.5μg/ml，所述吖啶酯标记抗体的浓度为4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值为1.891。
10. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述分析物为铁蛋白，所述生物素标记抗体的浓度为0.4μg/ml，所述吖啶酯标记抗体的浓度为4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值为1.823。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）、审查文本的认定
复审请求人在2019年07月08日答复复审通知书时提交了权利要求书的全文修改替换页，将复审通知书中指出的修改超范围的权利要求1、6中的“其中当生物素标记抗体的浓度为0.4～0.8μg/ml，吖啶酯标记抗体的浓度为2.5～5μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值为1.566～1.891”修改为：“其中当生物素标记抗体的浓度和吖啶酯标记抗体的浓度分别为0.8μg/ml，5μg/ml；0.5μg/ml，4μg/ml；0.4μg/ml，2.5μg/ml；0.4μg/ml，4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值分别为1.658、1.891、1.566、1.823”，上述修改后的内容记载在原说明书第0104段，因此上述修改符合专利法第33条的规定。本复审请求审查决定所针对的文本为：2019年07月08日提交权利要求第1-10项；申请日2015年12月17日提交的说明书第1-22页、说明书附图第1页和说明书摘要。
（二）、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果一项权利要求请求保护的技术方案相对于一份对比文件存在区别技术特征，该区别技术特征是本领域的公知常识，那么本领域技术人员在上述对比文件以及本领域公知常识结合的基础上得到该权利要求请求保护的技术方案是显而易见的，该权利要求不具备创造性。
具体到本案：
1.权利要求1要求保护一种提高免疫分析仪检测准确性的方法，权利要求6请求保护一种提高样本中分析物化学发光免疫检测线性范围的方法。对比文件1公开了一种免疫分析方法（参见说明书第43-59段）：该方法采用Nichols Advantage免疫系统进行（即提供免疫分析仪），该免疫分析仪必然含有反应杯；将15μl样本、260μl检测缓冲液、70μl 4.2μg/mL生物素偶联的捕获抗体溶液和25μl 4mg/mL磁性颗粒溶液加入板的孔或者反应杯中，在37℃下孵育30分钟，形成反应混合液，其中磁性颗粒溶液为包含链霉亲和素包被的磁性颗粒（M-270，Dynal Biothech）的正常小鼠血清；孵育后，将反应混合液置于磁场以固定ITA/捕获抗体/磁性颗粒，移去上清液并用清洗液清洗孔或杯，清洗缓冲液为含有Tween和叠氮钠的PBS。在充分洗涤后，加入50μl检测抗体溶液和250μl正常小鼠血清，检测抗体溶液为包含0.1μg/test吖啶酯标记的抗体（检测中加入的体积为50μl，计算可得吖啶酯标记抗体的浓度为2μg/ml）、0.4%BSA的0.1M PBS，pH6.0，37℃孵育10分钟；在磁场的作用下，固定检测抗体/ITA/捕获抗体/磁性颗粒复合物，去除上清液，清洗孔或杯。接着加入包含过氧化氢的稀释酸溶液（相当于促发液A）和包含稀释氢氧化钠的碱溶液（相当于促发液B）以引发吖啶酯的化学发光信号，发光仪测量发光信号的发光量。根据发光量，计算出样本中分析物的浓度。对比文件1还公开了其化学发光方法灵敏度增加，自动化方法改善可重复性，且灵敏范围为0.1-300nm/mL，即具有良好的检测线性范围（参见说明书第43段、第50段）。
由此可见，权利要求1、6与对比文件1的区别特征在于：①分析物为铁蛋白或CA19-9；②加入10μl样本、50μl抗体、50μl 1.0mg/mL的链霉亲和素磁珠悬浮液，链霉亲和素磁珠悬浮液为0.01M PBS缓冲液，pH7.4，含有0.1% BSA和0.02%叠氮钠；反应混合液孵育时间为30分钟；先后加入250μl促发液A和250μl促发液B，促发液A为含质量浓度0.25％过氧化氢的0.1N硝酸溶液，促发液B为含体积浓度0.5％Triton X-100的0.25N氢氧化钠溶液；③形成反应混合液后不包括清洗步骤，加入吖啶酯之后的清洗步骤中在除去反应杯内的溶液后，接着往反应杯中加入清洗液重悬磁珠，然后再在磁场的作用下，除去反应杯内的溶液，利用所述清洗液重复洗涤磁珠3次，从而除去未结合的生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体，其中所述清洗液为0.01M PBST缓冲液；④根据步骤(5)中的发光量和事先制定好的标准曲线，计算出样本中分析物的浓度；当分析物为铁蛋白时，生物素标记抗体中的抗体和吖啶酯标记抗体中的抗体同时选自小鼠抗铁蛋白单克隆抗体，所述标准曲线的制定过程如下所示：a)首先利用小牛血清和铁蛋白配制出不同浓度的铁蛋白校准品，其浓度分别为0ng/ml，10ng/ml，25ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml和2000ng/ml；b)在反应杯中，按照步骤(1)～(5)检测不同浓度的铁蛋白校准品的发光量，其中每个浓度的铁蛋白校准品平行检测两次，求其平均发光量，然后利用与铁蛋白校准品浓度的函数关系，制作标准曲线，其中当生物素标记抗体的浓度和吖啶酯标记抗体的浓度分别为0.8μg/ml，5μg/ml，0.5μg/ml，4μg/ml；0.4μg/ml，2.5μg/ml；0.4μg/ml，4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值分别为1.658、1.891、1.566、1.823，能有效地将1000ng/ml和2000ng/ml铁蛋白校准品的发光量区分开来；当所述分析物为CA19-9时，生物素标记抗体中的抗体和吖啶酯标记抗体中的抗体同时选自或小鼠抗CA19-9单克隆抗体，所述标准曲线的制定过程如下所示：a)首先利用pH 7.4的0.01M PBS缓冲液和CA19-9配制浓度分别为5U/ml、50U/ml、200U/ml、600U/ml和1200U/ml的CA19-9校准品；b)在反应杯中，按照步骤(1)～(5)检测不同浓度的CA19-9校准品的发光量，其中每个浓度的CA19-9校准品平行检测两次，求其平均发光量，然后利用与CA19-9校准品浓度的函数关系，制作标准曲线，其中当所述生物素标记抗体的浓度为0.65μg/ml和所述吖啶酯标记抗体的浓度为3.0μg/ml时，1200U/mlCA19-9校准品溶液的发光量与600U/ml CA19-9校准品溶液的发光量的比值为1.722，能够更好地将高浓度CA19-9校准品的发光值区分开来；⑤所述生物素标记抗体的制备过程如下所示：1)取1mg抗体，加入适量0.01M PBS缓冲液(pH7.2～7.4)，获得终浓度为1mg/mL的抗体溶液，并加入透析袋中；2)往透析袋中加入不小于500ml的0.01M PBS缓冲液(pH7.2～7.4)进行透析，每次透析时间不小于4h，重复换透析液3～4次，然后将透析后的抗体溶液转移至Eppendorf管内；3)称取1mg NHS-LC-Biotin，加入适量水，获得终浓度为2mg/mL的NHS-LC-Biotin溶液；4)按5～50倍NHS-LC-Biotin与抗体的摩尔比例进行标记，取适当体积的NHS-LC-Biotin溶液加入到步骤2)中装有抗体的Eppendorf管中混匀，并置于旋转反应器上，室温反应30min，形成反应混合液；5)将步骤4)中的反应混合液转移入透析袋中，并将透析袋置入不小于500ml的0.01M PBS缓冲液(pH7.2～7.4)中进行透析，重复更换透析液3～4次，每次透析时间为不小于4h，然后收集生物素标记抗体原液，其体积为V1；6)往收集的原液中添加(0.1×V1)体积的含5％BSA的0.01M PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)，获得生物素标记抗体母液，于2～8℃下保存；7)利用生物素标记抗体稀释液对步骤6)中所获得的生物素标记抗体母液进行稀释，获得生物素标记抗体工作液，其中所述生物素标记抗体稀释液为pH 7.4 的0.01M PBS缓冲液；⑥所述吖啶酯标记抗体的制备过程如下所示：(a)取1mg抗体，加入适量0.1M NaHCO3溶液(pH8.0～9.6)，获得终浓度为1mg/mL的抗体溶液，并加入透析袋中；(b)往透析袋中加入不小于500ml的0.1M NaHCO3溶液(pH 8.0～9.6)进行透析，每次透析时间不小于4h，重复换透析液3～4次，然后将透析后的抗体溶液转移至Eppendorf管内；(c)称取1mg吖啶酯溶于适量的二甲基甲酰胺(DMF)试剂中，获得终浓度为1mg/mL的吖啶酯溶液；(d)按5～50倍吖啶酯与抗体的摩尔比例进行标记，取适当体积的吖啶酯溶液加入到步骤2中装有抗体的Eppendorf管中轻微混匀，并置于旋转反应器上，室温反应30min，形成反应混合液；(e)将步骤(d)中的反应混合液转移入透析袋中，并将透析袋置入不小于500ml的0.01M PBS缓冲液(pH6.0～6.5)中进行透析，重复更换透析液3～4次，每次透析时间为不小于4h，然后收集吖啶酯标记抗体原液，其体积为V2；(f)往收集的原液中添加(0.1×V2)体积的含5％BSA的0.01M PBS缓冲液(pH6.0～6.5)，获得吖啶酯标记抗体母液，于2～8℃下保存；(g)利用吖啶酯标记抗体稀释液对步骤(f)中所获得的吖啶酯标记抗体母液进行稀释，获得吖啶酯标记抗体工作液，其中所述吖啶酯标记抗体稀释液为pH7.4的0.01M PBS缓冲液。基于上述区别技术特征可以确定，权利要求1、6实际解决的技术问题是：①提供一种检测铁蛋白和CA19-9的方法；②选择合适的试剂浓度及用量以使得检测结果更准确；③选择合适的清洗步骤从而使得检测结果更加准确；④提供一种制定标准曲线的方法；⑤提供一种制备生物素标记抗体的方法；⑥提供一种制备吖啶酯标记抗体的方法。
关于区别技术特征①，虽然对比文件1的检测对象是ITA，但是将其检测方法用于检测铁蛋白或CA19-9，是本领域技术人员容易想到的。关于区别技术特征②，为了获得准确的检测结果，本领域技术人员有动机对采用的试剂浓度和量进行调整，并且该调整通过本领域的常规实验方法即可以进行，不需要付出创造性的劳动，因此加入10μl样本、50μl抗体、50μl 1.0mg/mL的链霉亲和素磁珠悬浮液，链霉亲和素磁珠悬浮液为0.01M PBS缓冲液，pH7.4，含有0.1% BSA和0.02%叠氮钠，反应混合液的孵育时间为30分钟，是本领域的常用技术手段；先后加入250μl促发液A和250μl促发液B，促发液A为含质量浓度0.25％过氧化氢的0.1N硝酸溶液，促发液B为含体积浓度0.5％Triton X-100的0.25N氢氧化钠溶液，也是本领域技术人员可以根据实际需要选择的，属于本领域的常用技术手段。关于区别技术特征③，对本领域的技术人员而言，在免疫检测领域，通过缩减清洗步骤缩短检测时间对于本领域技术人员来说是容易想到的，因此形成反应混合液后不包括清洗步骤，是本领域的常用技术手段；而为了充分除去未结合的生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体，加入吖啶酯之后的清洗步骤中在除去反应杯内的溶液后，接着往反应杯中加入清洗液重悬磁珠，然后再在磁场的作用下，除去反应杯内的溶液，利用所述清洗液重复洗涤磁珠3次，从而除去未结合的生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体，其中所述清洗液为0.01M PBST缓冲液，是本领域的常用技术手段。关于区别技术特征④，对本领域的技术人员而言，根据计算出的发光量和事先制定好的标准曲线，计算出样本中分析物的浓度，是本领域所通常采用的计算分析物浓度的方式；当分析物为铁蛋白或CA19-9时，生物素标记抗体中的抗体和吖啶酯标记抗体中的抗体同时选自小鼠抗铁蛋白单克隆抗体或者CA19-9单克隆抗体，是本领域的常规技术选择；而标准曲线的具体制定过程包括配制不同浓度的校准品，并检测不同浓度校准品的发光量，利用发光量与校准品浓度的函数关系制作标准曲线，是本领域的常用技术手段；为了获得更加准确的检测结果，每个浓度的校准品平行检测两侧，求平均发光量，是本领域的常规技术选择；为了检测高浓度样品，选择在特定的抗体浓度下，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值以及1200U/mlCA19-9校准品溶液的发光量与600U/ml CA19-9校准品溶液的发光量的比值作为判断标准曲线的标准，是本领域技术人员容易想到的；关于区别技术特征⑤，对本领域的技术人员就而言，生物素标记抗体的制备过程中，抗体溶液中各成分的用量、配制方法以及透析方法，NHS-LC-Biotin溶液的中各成分的用量、配制方法以及透析方法，抗体和NHS-LC-Biotin反应混合液的配制方法、透析方法，生物素标记抗体的原液、母液以及工作液的具体配制方法，均是本领域技术人员通过本领域常规的实验手段可以获得的，属于本领域的常用技术手段。关于区别技术特征⑥，对本领域的技术人言而言，吖啶酯标记抗体的制备过程中，抗体溶液中各成分的用量、配制方法以及透析方法，吖啶酯溶液中各成分的用量、配制方法以及透析方法，抗体和吖啶酯反应混合液的配制方法、透析方法，吖啶酯标记抗体的原液、母液以及工作液的具体配制方法，均是本领域技术人员通过本领域常规的实验手段可以获得的，属于本领域的常用技术手段。
因此在对比文件1的基础上结合本领域的常用技术手段得到权利要求1、6要求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，所以权利要求1、6不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。
2.从属权利要求2对权利要求1作了进一步限定，从属权利要求7对权利要求6作了进一步限定。对比文件1公开了（参见说明书第56段）：生物素偶联的捕获抗体浓度为4.2μg/ml，吖啶酯标记检测抗体的用量为0.1μg/测试，检测中加入的体积为50μl（计算可得吖啶酯标记抗体的浓度为2μg/ml）；在此基础上，根据实际需要，生物素标记抗体的浓度设置为0.4～0.8μg/ml，所述吖啶酯标记抗体的浓度设置为2.5～5.0μg/ml，是本领域的常用技术手段。所以当引用的权利要求不具备创造性时，从属权利要求2、7也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。
3.从属权利要求3-5分别对权利要求2作了进一步限定，从属权利要求8-10分别对权利要求6作了进一步限定。然而对本领域的技术人言而言，所述分析物为铁蛋白，所述生物素标记抗体的浓度为0.8μg/ml，所述吖啶酯标记抗体的浓度为5μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值为1.659，所述生物素标记抗体的浓度为0.5μg/ml，所述吖啶酯标记抗体的浓度为4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值为1.891，所述生物素标记抗体的浓度为0.4μg/ml，所述吖啶酯标记抗体的浓度为4μg/ml时，2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量与1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的平均发光量的比值为1.823，是本领域技术人员可以通过常规的实验手段获得的，属于本领域的常用技术手段。所以当引用的权利要求不具备创造性时，从属权利要求3-5、8-10也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。
（三）、针对复审请求人提出的陈述意见的答复
复审请求人认为：针对区别技术特征④，常规的方法根据标准曲线的斜率、截距和R值来判断标准曲线的好坏，无法有效地区分开较高浓度的校准品发光值，本申请通过增加较高浓度校准品的发光值的比值，能够更好地判断常规方法制作的标准曲线的好坏，通过排除比值相对较低的选择，留下比值相对较高的选择，可以很好地解决利用常规方法制作标准曲线时所遇到的不能将较高浓度校准品的发光值区分开来的问题，该技术特征在现有技术中没有公开，并且也不是本领域的常用技术手段。
合议组经查认为：本领域技术人员熟知，在常规的方法中，通常是根据标准曲线的斜率、截距和R值来判断标准曲线的好坏，而能够检测高浓度待测物的一项指标就是标准曲线在沿X轴延伸的高浓度方向上能够保持良好的线性，对本领域的技术人员而言，为了表达标准曲线在沿X轴延伸的高浓度方向上的线性度，设置高浓度校准品的发光量比值这一参数，是本领域技术人员容易想到的；而为了更好地将高浓度的校准品的发光值区分开来，排除高浓度校准品的发光值的比值相对较低的选择，留下比值相对较高的选择，是本领域的常用技术手段。综上所述，复审请求人所陈述的本申请具备创造性的理由没有说服力。
基于以上事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年12月20日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本复审请求审查决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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