发明创造名称：添加铁改善细胞培养
外观设计名称：
决定号：189079
决定日：2019-09-02
委内编号：1F248755
优先权日：2011-10-21
申请（专利）号：201280051721.4
申请日：2012-10-09
复审请求人：辉瑞公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：王启扬
合议组组长：李振鹏
参审员：王慧梅
国际分类号：C12N5/00
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在判断创造性时，首先要将权利要求的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别特征，确定所述技术方案实际解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别特征引入到所述最接近的现有技术中以解决上述技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201280051721.4，名称为“添加铁改善细胞培养”的发明专利申请。申请人为辉瑞公司。本申请的申请日为2012年10月09日，优先权日为2011年10月21日，公开日为2014年06月25日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年01月05日以权利要求1-29不符合专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为2014年04月21日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件的中文译文的说明书第1-180段（即第1-34页）、说明书附图图1-图14（即第1-14页）、说明书摘要、摘要附图；以及2017年07月28日提交的权利要求第1-29项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价的方法，包括步骤：
(a)提供在细胞培养基中的细胞以起始细胞培养过程，其中所述细胞培养基包括铁作为微量元素；及
(b)在细胞培养过程的第3天或第3天之后或者在第3天和第3天之后将含铁组合物添加至所述细胞培养基，从而在所述细胞培养基中的铁浓度在细胞培养过程期间增加。
2. 权利要求1的方法，其中所述含铁组合物选自FeSO4、Fe-柠檬酸盐、Fe-运铁蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸盐、Fe-EDTA、Fe(NO3)3、FeCl2、FeCl3及其组合。
3. 权利要求1的方法，其中所述含铁组合物在细胞培养过程的第6天或第6天之后添加。
4. 权利要求1的方法，其中所述含铁组合物在细胞培养过程期间的多个时间点添加。
5. 权利要求1的方法，其中在添加所述含铁组合物后，所述细胞培养基中的铁浓度范围在100μM和5mM之间。
6. 权利要求1的方法，其中在添加所述含铁组合物后，所述细胞培养基中的铁浓度范围在300μM和1mM之间。
7. 权利要求1的方法，其中在添加所述含铁组合物后，所述细胞培养基中的铁浓度是1mM。
8. 权利要求1的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
9. 权利要求8的方法，其中所述哺乳动物细胞选自BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系、人成视网膜细胞(PER.C6)、猴肾细胞、人胚肾细胞系(293)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、中华仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠睾丸支持细胞、非洲绿 猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HeLa)、犬肾细胞、buffalo大鼠肝细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺肿瘤细胞、TRI细胞、MRC 5细胞、FS4细胞或者人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。
10. 权利要求9的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
11. 权利要求1的方法，其中所述细胞培养过程是补料分批培养过程。
12. 权利要求1的方法，其中所述细胞培养过程是分批-再流加培养过程。
13. 权利要求1的方法，其中所述细胞培养过程是灌注培养过程。
14. 权利要求1的方法，其中所述细胞培养过程是大规模生产培养过程。
15. 权利要求14的方法，其中所述细胞培养基的体积是至少大约500L。
16. 权利要求1的方法，其中所述细胞培养基不含水解物。
17. 权利要求1的方法，其中所述细胞培养基含有水解物。
18. 权利要求1的方法，其中所述细胞携带编码重组蛋白的基因。
19. 权利要求18的方法，其中所述重组蛋白是抗体或其片段。
20. 权利要求19的方法，其中所述抗体是抗IL-22抗体。
21. 权利要求19的方法，其中所述抗体是抗GDF-8抗体。
22. 权利要求19的方法，其中所述抗体是Myo29。
23. 权利要求19的方法，其中所述抗体是单域抗体。
24. 权利要求23的方法，其中所述单域抗体是抗TNF纳米抗体。
25. 权利要求18的方法，其中所述重组蛋白是糖蛋白。
26. 权利要求18的方法，其中所述重组蛋白是治疗性蛋白。
27. 权利要求26的方法，其中所述治疗性蛋白是生长因子、凝血因子、细胞因子、融合蛋白、药物物质、疫苗、酶或Small Modular ImmunoPharmaceuticalTM(SMIP)。
28. 权利要求18-27任一项的方法，其中所述方法进一步包括纯化所述重组蛋白。
29. 从根据权利要求18-28任一项的方法培养的细胞生产的重组蛋白。”
驳回决定中认为：1.权利要求1请求保护增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价的方法。对比文件1（WO2009087087A1，公开日：2009年07月16日）涉及一种使用包括多胺和铁的细胞培养添加剂提高细胞生长、细胞活力或细胞产率的方法（参见摘要），并具体公开了以下技术特征：在培养基中培养细胞的方法，其中，a)准备细胞和第一次用的培养基，b)在适宜维持所述细胞和所述第一次用培养基的条件下，在所述第一次用培养基中培养细胞，c)在所述第一次用培养基接种细胞的培养过程中，其中至少一种多胺或铁或两者（为本申请权利要求1中的“含铁组合物”的下位概念）加入到第一次用培养基中，已有的多胺及加入到步骤a)，b)，c)中的所有多胺的总量和已有的铁及加入到步骤a)，b)，c)中的所有铁的总量形成如下浓度，含有至少一种多胺的浓度至少为20mg/ml和至少一种铁的浓度至少为2mg/l；术语“铁”是指确定的过渡金属Fe，原子量为55.845；术语“铁”是一通用术语，即含有一种或多种铁离子的所有分子，例如Fe3 离子和/或Fe2 离子；Fe3 离子和/或Fe2 离子可以以铁盐的形式存在；铁盐可以含有结晶水和不含结晶水；优选地，铁包含铁(II)和/或Fe(III)离子；优选地，所用铁选自以下组的物质：磷酸铁，焦磷酸铁，硝酸铁，硫酸亚铁，三氯化铁，乳酸亚铁，柠檬酸铁，柠檬酸铁铵，右旋糖酐铁，乙二胺四乙酸铁钠盐或上述物质含结晶水或不含结晶水的形式（参见说明书第16页第4-17行，第14页第9行至第15页第11行）。其中，在细胞培养过程中于细胞培养基中单独添加铁，或者添加多胺和铁二者后，细胞培养基中的铁浓度增加，对于本领域技术人员来说，是对比文件1隐含的且可直接地、毫无疑义地确定的技术内容。
权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1所公开的技术内容相比，其区别在于：
（1）权利要求1中限定了起始细胞培养基包括铁作为微量元素，而对比文件1中未公开上述特征；
（2）权利要求1中限定了含铁组合物的添加时机为在细胞培养过程的第3天或第3天之后或者在第3天和第3天之后，而对比文件1中未公开上述特征；
（3）权利要求1中限定了所述方法增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价，而对比文件1公开了其方法能够提高细胞生长、细胞活力或细胞产率。
基于上述区别特征，权利要求1实际要解决的技术问题是提供一种增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价的方法。对于区别技术特征（1），如前所述，对比文件1已经公开了已有的铁及加入到步骤a)，b)，c)中的所有铁的总量形成如下浓度，含有至少一种铁的浓度至少为2mg/l；即对比文件1公开了第一次用的培养基中可含有铁，该已有铁与后加入铁形成的所有铁可为一种且所有铁的总量形成浓度可为2mg/L。此时，以铁原子量为55.845来计算，所有铁的总量摩尔浓度为2mg/l÷55.845g/mol=0.036mmol/L=36μM（即为微摩尔浓度）。在此基础上，第一次用的培养基即起始细胞培养基可包括铁作为微量元素，对于本领域技术人员来说是显而易见的。对于区别技术特征（2），对比文件1还公开了以下技术特征：制备一种不含铁和多胺的细胞培养基，所制备的培养基进行细胞接种，该试验以流加的方式进行，使用的富集培养基中不含铁和多胺，图1表示铁是细胞生长必不可少的物质（参见说明书实施例1、附图1）；并且，由附图1可以看出，在细胞培养过程的第2天以后，相对于不添加FePO4和精胺，于培养基中单独添加300mg/l FePO4（对应于300mg/l FePO4、0mg/l精胺），或者添加300mg/l FePO4及40mg/l精胺，活细胞浓度明显提高。同时，对比文件1还公开了细胞培养基中不含铁和多胺，细胞转移到准备好的培养基中，在第6天（落在权利要求1中限定的“第3天之后”的范围内），所有培养基以柠檬酸铁（III）进行补充以达到最终浓度400mg/L（参见说明书第27页第10-15行）；图6表示细胞高密度流加方法中单独添加400mg/l柠檬酸铁（对应于0mg/l精胺＋400mg/l柠檬酸铁）、添加40mg/l精胺及400mg/l柠檬酸铁的影响（参见说明书第20页第5-6行，附图6）；并且，由附图6可以看出，在第6天于细胞培养基中加入柠檬酸铁（III）后细胞活力出现了一个正峰，其中第7-9天细胞活力的增加并在第9天达到最高值。由此，在对比文件1公开的上述内容的基础上，本领域技术人员可以基于实际操作中所添加的含铁组合物中铁源及其浓度的不同，通过有限的试验确定含铁组合物的适宜添加的时机，且不存在技术障碍。对于区别技术特征（3），对比文件1已经公开了其方法能够提高细胞生长、细胞活力或细胞产率，而细胞生长、细胞活力或细胞产率的提高，会使得细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价增加，是本领域技术人员可以合理预期并能够通过有限的试验加以确定的。因此，在对比文件1的基础上结合本技术领域中常用的技术手段以获得权利要求1所要求保护的技术方案，对所属技术领域的技术人员来说是显而易见的，因此权利要求1所要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。对比文件1公开了在利用不含铁和多胺的细胞培养基培养细胞的过程中，流加FePO4和/或精胺（参见针对权利要求1的评述），并且，由附图1可以看出，在细胞培养过程的第2天以后，相对于不添加FePO4和精胺，于培养基中单独添加300mg/l FePO4（对应于300mg/l FePO4、0mg/l精胺），活细胞浓度明显提高。由此，无需添加精胺，仅单独添加铁即可达到提高活细胞浓度，对于本领域技术人员来说是显而易见的。同时，对比文件1已经公开了铁源的可选范围（参见针对权利要求1的意见评述），使用本技术领域中常用的其它铁源作为替换手段以及使用多种铁源组合成含铁组合物是本领域技术人员容易想到的。实际操作中于细胞培养过程中加入含铁组合物的具体时间点以及时间点的数目，可由本领域技术人员结合本技术领域中常用的技术手段通过有限的试验加以确定。与此同时，对比文件1已经公开了培养基中加入柠檬酸铁（III）至最终浓度400mg/L（参见针对权利要求1的意见评述）。本技术领域中公知，柠檬酸铁（III）的分子量为245，经过换算，培养基中柠檬酸铁（III）的终浓度400mg/L=400/245mM=1.63 mM（落入权利要求5限定的浓度范围内）。同时，对比文件1已经公开了至少一种铁源的浓度至少为2mg/l（参见针对权利要求1的意见评述），由此，本领域技术人员可以在对比文件1公开的浓度范围的基础上基于实际使用的具体铁源进行常规选择或调整铁源的浓度，进而确定细胞培养基中铁的摩尔浓度。由此，在其引用的在先权利要求不具备创造性时，权利要求2-7请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求8-28均直接或间接引用权利要求1，其附加技术特征被对比文件1公开或为本领域技术人员容易想到的或为常规选择（参见说明书第18页第3-13行，第22-26行，第17页第9-11行，第11页第19行至第12页第10行，第21页第4-9行）。因此，权利要求8-28请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求29请求保护“从根据权利要求18-28任一项的方法培养的细胞生产的重组蛋白”。理由同针对权利要求18-28的意见评述，权利要求18-28请求保护的技术方案对于本领域技术人员来说是显而易见的；在此基础上，能够培养细胞生产重组蛋白是本领域技术人员容易想到的。因此，权利要求29所要求保护的技术方案，对所属技术领域的技术人员来说是显而易见的，不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、针对申请人的意见陈述，审查员认为：在对比文件1公开内容的基础上，第一次用的培养基即起始细胞培养基可包括铁作为微量元素，对于本领域技术人员来说是显而易见的；对比文件1已经公开了在第一次用培养基接种细胞的培养过程中，将铁加入到第一次用培养基中，并且还给出了在培养的第6天添加柠檬酸铁以增加细胞活力的实例。在对比文件1公开内容的基础上，本领域技术人员可以基于实际操作中所添加的含铁组合物中铁源及其浓度的不同，通过有限的试验确定含铁组合物的适宜添加的时机，且不存在技术障碍；对比文件1已经公开了其方法能够提高细胞生长、细胞活力或细胞产率，而细胞生长、细胞活力或细胞产率的提高，会使得细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价增加，是本领域技术人员可以合理预期并通过有限的试验加以确定的，不属于预料不到的技术效果。综上所述，申请人在意见陈述中认为本申请符合专利法第22条第3款规定的理由不能成立。
申请人辉瑞公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年04月12日向国家知识产权局提出了复审请求，未提交修改的申请文件。复审请求人认为：对比文件1的附图1,2,4以及相应实施例显示在培养当天就含有铁，且实施例6教导在培养第6天，向在培养开始时已含有400mg/l柠檬酸铁的培养基加铁，因此教导了在细胞培养开始时在培养基中需要添加大量的铁，没有公开将铁以微量元素存在于起始培养基中，在细胞培养过程的第3天或第3天之后或者在第3天和第3天之后将含铁组合物添加至所述细胞培养基。根据对比文件1的教导，本领域技术人员将在细胞培养过程开始时在培养基中包含铁，而没有任何理由等到“在细胞培养过程的第3天或第3天之后或者在第3天和第3天之后”再向培养基添加铁。本申请发现了在细胞培养过程的第3天和第6天后添加高浓度铁，分别导致细胞密度、存活和效价的显著增加，相对于在第0天添加高浓度铁时观察到的毒性是出人意料的。因此，权利要求1-29具有创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月20日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：1）对比文件1明确公开了第一次用培养基中已有铁，并在细胞培养过程中加入铁，且已有铁与后加入铁形成的所有铁的总量为2mg/L；以铁原子量为55.845来计算，所有铁的总量摩尔浓度为36μM（即为微摩尔浓度）（详见针对权利要求1的评述）。在此基础上，第一次用的培养基即起始细胞培养基可包括铁作为微量元素，对于本领域技术人员来说是显而易见的。同时，对比文件1还给出了在培养的第6天添加柠檬酸铁以增加细胞活力的实例。由此，本领域技术人员可以基于实际操作中所添加的含铁组合物中铁源及其浓度的不同，通过有限的试验确定细胞培养过程中含铁组合物的适宜添加的时机，且不存在技术障碍。（2）对比文件1已经公开了其方法能够提高细胞生长、细胞活力或细胞产率，而细胞生长、细胞活力或细胞产率的提高，会使得细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价增加，是本领域技术人员可以合理预期并通过有限的试验加以确定的，并不属于预料不到的技术效果。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年01 月28 日向复审请求人发出复审通知书，指出：1.权利要求1请求保护增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价的方法。对比文件1涉及一种使用包括多胺和铁的细胞培养添加剂提高细胞生长、细胞活力或细胞产率的方法（参见摘要，说明书第16页第4-17行，第14页第9行至第15页第11行）。权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1所公开的技术内容相比，其区别特征在于：（1）权利要求1中限定了起始细胞培养基包括铁作为微量元素，而对比文件1中未明确公开上述特征；（2）权利要求1中限定了含铁组合物的添加时机为在细胞培养过程的第3天或第3天之后或者在第3天和第3天之后；（3）权利要求1中限定了所述方法增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价，而对比文件1公开了其方法能够提高细胞生长、细胞活力或细胞产率。基于上述区别特征，权利要求1实际解决的技术问题是提供一种增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价的方法。对于区别特征（1），如前所述，对比文件1已经公开了已有的铁及加入到步骤a)，b)，c)中的所有铁的总量形成如下浓度，含有至少一种铁的浓度至少为2mg/l；即对比文件1公开了第一次用的培养基中再加入额外的铁之前就可含有铁，该已有铁与后加入铁形成的所有铁可为一种且所有铁的总量形成浓度可至少为2mg/L。本领域技术人员公知的是在细胞培养中，铁是细胞培养所需的微量元素（单长民等主编，《医用生物学实验与技术》，第85页，第11-12行，人民卫生出版社，1999年08月），因此对于本领域技术人员来说起始培养基中含有作为微量元素的铁是显而易见的；对于区别技术特征（2），对比文件1还公开了以下技术特征：制备一种不含铁和多胺的细胞培养基，相应量的储备液吸入到培养基中以调整测试物质（即多胺和铁）的最终浓度。然后所制备的培养基进行细胞接种，该试验以流加的方式进行，使用的富集培养基中不含铁和多胺，图1表示铁是细胞生长必不可少的物质（参见说明书实施例1、附图1）；并且，由附图1可以看出，在细胞培养过程的第2天以后，相对于不添加FePO4和精胺，于培养基中单独添加300mg/l FePO4（对应于300mg/l FePO4、0mg/l精胺），或者添加300mg/l FePO4及40mg/l精胺，活细胞浓度明显提高。同时，对比文件1还公开了细胞培养基中不含铁和多胺，细胞转移到准备好的培养基中，在第6天（落在权利要求1中限定的“第3天之后”的范围内），所有培养基以柠檬酸铁（III）进行补充以达到最终浓度400mg/L（参见说明书第27页第10-15行）；图6表示细胞高密度流加方法中单独添加400mg/l柠檬酸铁（对应于0mg/l精胺＋400mg/l柠檬酸铁）、添加40mg/l精胺及400mg/l柠檬酸铁的影响（参见说明书第20页第5-6行，附图6）；并且，由附图6可以看出，在第6天于细胞培养基中加入柠檬酸铁（III）后细胞活力出现了一个正峰，其中第7-9天细胞活力的增加并在第9天达到最高值。由此，在对比文件1公开的上述内容的基础上，本领域技术人员可以基于实际操作中所添加的含铁组合物中铁源及其浓度的不同，通过有限的试验确定含铁组合物的适宜添加的时机，且不存在技术障碍；对于区别特征（3），对比文件1已经公开了其方法能够提高细胞生长、细胞活力或细胞产率，而细胞生长、细胞活力或细胞产率的提高，会使得细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价增加，是本领域技术人员可以合理预期并能够通过有限的试验加以确定的，且本申请说明书在第8页第二段记载：“典型地，铁以大于‘微量浓度’的浓度提供在培养基中”，第10页第三段记载：“在一些实施方案中，铁（亚铁或铁盐）可以以微摩尔浓度作为微量元素被包括在初始细胞培养基中。如上讨论，本发明提供了方法，其包括在初始细胞培养基中存在的微量铁以外还添加铁”，然而对于这些实施方案说明书并未提供具体实验，实施例中均未记载起始培养过程中培养基的具体成分，因此其中是否含有作为微量元素的铁并不清楚，因此其也并不能证明权利要求1所要求保护的技术方案能够产生预料不到的技术效果。因此，在对比文件1的基础上结合公知常识以及本领域中常用的技术手段以获得权利要求1所要求保护的技术方案，对所属技术领域的技术人员来说是显而易见的，因此权利要求1所要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。对比文件1已经公开了在利用不含铁和多胺的细胞培养基培养细胞的过程中，流加FePO4和/或精胺（参见针对权利要求1的评述），并且，由附图1可以看出，在细胞培养过程的第2天以后，相对于不添加FePO4和精胺，于培养基中单独添加300mg/l FePO4（对应于300mg/l FePO4、0mg/l精胺），活细胞浓度明显提高。由此，无需添加精胺，仅单独添加铁即可达到提高活细胞浓度，对于本领域技术人员来说是显而易见的。同时，对比文件1已经公开了铁源的可选范围（参见针对权利要求1的意见评述），使用本技术领域中常用的其它铁源作为替换手段以及使用多种铁源组合成含铁组合物是本领域技术人员容易想到的。因此，在其引用的在先权利要求不具备创造性时，权利要求2请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。如前面针对权利要求1的评述，在对比文件1公开的上述内容的基础上，本领域技术人员可以基于实际操作中所添加的含铁组合物中铁源及其浓度的不同，通过有限的试验确定细胞培养过程中加入含铁组合物的具体时间点以及时间点的数目，且不存在技术障碍。与此同时，对比文件1已经公开了培养基中加入柠檬酸铁（III）至最终浓度400mg/L（参见针对权利要求1的意见评述）。本技术领域中公知，柠檬酸铁（III）的分子量为245，经过换算，培养基中柠檬酸铁（III）的终浓度400mg/L=400/245mM=1.63 mM（落入权利要求5限定的浓度范围内）。同时，对比文件1已经公开了至少一种铁源的浓度至少为2mg/l（参见针对权利要求1的意见评述），由此，本领域技术人员可以在对比文件1公开的浓度范围的基础上基于实际使用的具体铁源进行常规选择或调整铁源的浓度，进而确定细胞培养基中铁的摩尔浓度。由此，在其引用的在先权利要求不具备创造性时，权利要求3-7请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求8-28的附加技术特征或是被对比文件1公开（参见说明书第18页第3-13行，第22-26行，第17页第9-11行，第11页第19行至第12页第10行，第18页第21页第4-9行），或是本领域技术人员容易想到的或是常规选择。因此，在其引用的在先权利要求不具备创造性时，权利要求8-28请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对于复审请求人的意见，合议组认为：（1）对比文件1公开了第一次用的培养基中再加入额外的铁之前就可含有铁。本领域技术人员公知的是在细胞培养中，铁是细胞培养所需的微量元素（单长民等主编，《医用生物学实验与技术》，第85页，第11-12行，人民卫生出版社 , 1999年08月），因此对于本领域技术人员来说起始培养基中含有作为微量元素的铁是显而易见的；附图中显示的第0天实质是按照添加铁/多胺日起算，并不能排除添加铁/多胺之前细胞未经培养，实施例6中记载的并非在培养开始时培养基已含有400mg/l柠檬酸铁，而是在培养第6天进一步向培养基中添加柠檬酸铁，使得柠檬酸铁在培养基的终浓度达到400mg/l，可见这里的柠檬酸铁浓度是培养第六日加入柠檬酸铁后达到的，而非培养初始时，此外对比文件1实施例7公开了将细胞接种在不含多胺和铁的培养基中3天，实施例9也公开了在开始试验之前细胞在没有铁的培养基中培养2天，由此可见对比文件1公开的内容并不会使得本领域技术人员在细胞培养初始阶段就加入高浓度的铁，况且对比文件1已经公开了在第一次用培养基接种细胞的培养过程中，将铁加入到第一次用培养基中，并且还给出了在培养的第6天添加柠檬酸铁以增加细胞活力的实例。在对比文件1公开内容的基础上，本领域技术人员可以基于实际操作中所添加的含铁组合物中铁源及其浓度的不同，通过有限的试验确定含铁组合物的适宜添加的时机，且不存在技术障碍；（2）对比文件1已经公开了其方法能够提高细胞生长、细胞活力或细胞产率，而细胞生长、细胞活力或细胞产率的提高，会使得细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价增加，是本领域技术人员可以合理预期并通过有限的试验加以确定的。也就是说，本申请说明书中记载的在细胞培养过程中添加高浓度铁不仅没有毒性，反而导致细胞密度、存活和效价的显著增加的技术效果是本领域技术人员在显而易见的技术方案的基础上通过有限的试验即可验证获得的，并不属于预料不到的技术效果。
复审请求人于2019年05 月13 日提交了意见陈述书，以及经修改的权利要求书全文替换页（共3页29项），其中所作修改在于：在原权利要求1的（a）步骤中细胞培养基限定“至少10L”，增加“其中铁的浓度低于100μM的限定。复审请求人认为：（1）对比文件1的实施例6,7,9均不会使本领域技术人员有动机获得权利要求1的技术方案，相反，根据对比文件1，本领域技术人员在改善细胞存活性时，将在培养开始时在培养基中包括铁，理由是：实施例6中培养细胞的最初“制备培养基”含有400mg/l柠檬酸铁，当细胞在制备培养基中培养时，将不含铁的流加培养基形式的额外培养基加入到细胞培养物中，这降低了培养基中铁的浓度，在第六天向培养物中加入额外的柠檬酸铁使培养基中的柠檬酸铁浓度回升到400mg/l；对比文件1实施例7和9在无铁培养基中生长细胞的目的是耗尽细胞内铁，可以测试特定铁源(相对于其它不同铁源)的作用，未显示或提示在无铁培养基中开始培养的任何益处，实施例9还指出预先的细胞铁饥饿对于精胺和葡聚糖铁功能性是不必需的；对比文件1图1-2均显示在培养开始时含有铁的细胞培养物与不含铁的细胞培养物比具有提高的细胞存活性，图4显示具有较高铁浓度的细胞培养物具有更高的细胞存活性，在相应于图1,2,4的实施例中在细胞培养开始时均存在铁。（2）权利要求1的技术方案产生了出人意料的技术效果，即在第3天或之后添加铁，培养细胞的细胞密度、存活性和效价显著增加。新提交的权利要求1如下：
“1. 增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价的方法，包括步骤：
(a)提供在至少10L的细胞培养基中的细胞以起始细胞培养过程，其中所述细胞培养基包括铁作为微量元素，其中铁的浓度低于100μM；及
(b)在细胞培养过程的第3天或第3天之后或者在第3天和第3天之后将含铁组合物添加至所述细胞培养基，从而在所述细胞培养基中的铁浓度在细胞培养过程期间增加。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
复审请求人于2019年05月13日答复复审通知书时，提交了经修改的权利要求书全文替换页（共3页29项）。经审查，所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审请求审查决定针对的文本是2014年04月21日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件的中文译文的说明书第1-180段（即第1-34页）、说明书附图图1-图14（即第1-14页）、说明书摘要、摘要附图；以及2019年05月13日提交的权利要求第1-29项。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果请求保护的发明相对于最接近的现有技术所公开的技术方案存在区别技术特征，且现有技术整体上给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术公开的技术方案以解决其存在的技术问题的启示，同时该发明的技术方案也未取得预料不到的技术效果，则该请求保护的发明相对于现有技术不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
1、权利要求1请求保护增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价的方法。对比文件1涉及一种使用包括多胺和铁的细胞培养添加剂提高细胞生长、细胞活力或细胞产率的方法（参见摘要），并具体公开了以下技术特征：在培养基中培养细胞的方法，其中，a)准备细胞和第一次用的培养基，b)在适宜维持所述细胞和所述第一次用培养基的条件下，在所述第一次用培养基中培养细胞，c)在所述第一次用培养基接种细胞的培养过程中，其中至少一种多胺或铁或两者（为本申请权利要求1中的“含铁组合物”的下位概念）加入到第一次用培养基中，已有的多胺及加入到步骤a)，b)，c)中的所有多胺的总量和已有的铁及加入到步骤a)，b)，c)中的所有铁的总量形成如下浓度，含有至少一种多胺的浓度至少为20mg/ml和至少一种铁的浓度至少为2mg/l；术语“铁”是指确定的过渡金属Fe，原子量为55.845；术语“铁”是一通用术语，即含有一种或多种铁离子的所有分子，例如Fe3 离子和/或Fe2 离子；Fe3 离子和/或Fe2 离子可以以铁盐的形式存在；铁盐可以含有结晶水和不含结晶水；优选地，铁包含铁(II)和/或Fe(III)离子；优选地，所用铁选自以下组的物质：磷酸铁，焦磷酸铁，硝酸铁，硫酸亚铁，三氯化铁，乳酸亚铁，柠檬酸铁，柠檬酸铁铵，右旋糖酐铁，乙二胺四乙酸铁钠盐或上述物质含结晶水或不含结晶水的形式（参见说明书第16页第4-17行，第14页第9行至第15页第11行）。其中，在细胞培养过程中于细胞培养基中单独添加铁，或者添加多胺和铁二者后，细胞培养基中的铁浓度增加，对于本领域技术人员来说，是对比文件1隐含的且可直接地、毫无疑义地确定的技术内容。权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1所公开的技术内容相比，其区别特征在于：（1）权利要求1中限定了起始细胞培养基包括铁作为微量元素且浓度低于100μM，培养基体积为10L，而对比文件1中未明确公开上述特征；（2）权利要求1中限定了含铁组合物的添加时机为在细胞培养过程的第3天或第3天之后或者在第3天和第3天之后；（3）权利要求1中限定了所述方法增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价，而对比文件1公开了其方法能够提高细胞生长、细胞活力或细胞产率。基于上述区别特征，权利要求1实际解决的技术问题是提供一种增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价的方法。
对于区别特征（1），如前所述，对比文件1已经公开了已有的铁及加入到步骤a)，b)，c)中的所有铁的总量形成如下浓度，含有至少一种铁的浓度至少为2mg/l；即对比文件1公开了第一次用的培养基中再加入额外的铁之前就可含有铁，该已有铁与后加入铁形成的所有铁可为一种且所有铁的总量形成浓度可至少为2mg/L。本领域技术人员公知的是在细胞培养中，铁是细胞培养所需的微量元素（单长民等主编，《医用生物学实验与技术》，第85页，第11-12行，人民卫生出版社, 1999年08月），因此对于本领域技术人员来说起始培养基中含有作为微量元素的铁是显而易见的，至于培养基中铁的具体浓度和培养基体积，本领域技术人员可以通过常规技术手段来确定合适的范围；对于区别特征（2），对比文件1还公开了以下技术特征：制备一种不含铁和多胺的细胞培养基，相应量的储备液吸入到培养基中以调整测试物质（即多胺和铁）的最终浓度。然后所制备的培养基进行细胞接种，该试验以流加的方式进行，使用的富集培养基中不含铁和多胺，图1表示铁是细胞生长必不可少的物质（参见说明书实施例1、附图1）；并且，由附图1可以看出，在细胞培养过程的第2天以后，相对于不添加FePO4和精胺，于培养基中单独添加300mg/l FePO4（对应于300mg/l FePO4、0mg/l精胺），或者添加300mg/l FePO4及40mg/l精胺，活细胞浓度明显提高。同时，对比文件1还公开了细胞培养基制备时不含铁和多胺，细胞转移到准备好的培养基中，在第6天（落在权利要求1中限定的“第3天之后”的范围内），所有培养基以柠檬酸铁（III）进行补充以达到最终浓度400mg/L（参见说明书第27页第10-15行）；图6表示细胞高密度流加方法中单独添加400mg/l柠檬酸铁（对应于0mg/l精胺＋400mg/l柠檬酸铁）、添加40mg/l精胺及400mg/l柠檬酸铁的影响（参见说明书第20页第5-6行，附图6）；并且，由附图6可以看出，在第6天于细胞培养基中加入柠檬酸铁（III）后细胞活力出现了一个正峰，其中第7-9天细胞活力的增加并在第9天达到最高值。由此，在对比文件1公开的上述内容的基础上，本领域技术人员可以基于实际操作中所添加的含铁组合物中铁源及其浓度的不同，通过有限的试验确定含铁组合物的适宜添加的时机，且不存在技术障碍；对于区别特征（3），对比文件1已经公开了其方法能够提高细胞生长、细胞活力或细胞产率，而细胞生长、细胞活力或细胞产率的提高，会使得细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价增加，是本领域技术人员可以合理预期并能够通过有限的试验加以确定的，且本申请说明书在第8页第二段记载：“典型地，铁以大于‘微量浓度’的浓度提供在培养基中”，第10页第三段记载：“在一些实施方案中，铁（亚铁或铁盐）可以以微摩尔浓度作为微量元素被包括在初始细胞培养基中。如上讨论，本发明提供了方法，其包括在初始细胞培养基中存在的微量铁以外还添加铁”，然而对于这些实施方案说明书并未提供具体实验，实施例中均未记载起始培养过程中培养基的具体成分，因此其中是否含有作为微量元素的铁并不清楚，因此其也并不能证明权利要求1所要求保护的技术方案能够产生预料不到的技术效果。因此，在对比文件1的基础上结合公知常识以及本领域中常用的技术手段以获得权利要求1所要求保护的技术方案，对所属技术领域的技术人员来说是显而易见的，因此权利要求1所要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2.权利要求2引用权利要求1，并限定了其中所述含铁组合物选自FeSO4、Fe-柠檬酸盐、Fe-运铁蛋白、Fe-氯化物、Fe-硝酸盐、Fe-EDTA、Fe(NO3)3、FeCl2、FeCl3及其组合。对比文件1已经公开了在利用不含铁和多胺的细胞培养基培养细胞的过程中，流加FePO4和/或精胺（参见针对权利要求1的评述），并且，由附图1可以看出，在细胞培养过程的第2天以后，相对于不添加FePO4和精胺，于培养基中单独添加300mg/l FePO4（对应于300mg/l FePO4、0mg/l精胺），活细胞浓度明显提高。由此，无需添加精胺，仅单独添加铁即可达到提高活细胞浓度，对于本领域技术人员来说是显而易见的。同时，对比文件1已经公开了铁源的可选范围（参见针对权利要求1的意见评述），使用本技术领域中常用的其它铁源作为替换手段以及使用多种铁源组合成含铁组合物是本领域技术人员容易想到的。因此，在其引用的在先权利要求不具备创造性时，权利要求2请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3. 权利要求3-7均引用权利要求1，其中权利要求3、4进一步限定了含铁组合物的添加时机，权利要求5-7进一步限定了在添加所述含铁组合物后所述细胞培养基中的铁浓度范围。如前面针对权利要求1的评述，在对比文件1公开的上述内容的基础上，本领域技术人员可以基于实际操作中所添加的含铁组合物中铁源及其浓度的不同，通过有限的试验确定细胞培养过程中加入含铁组合物的具体时间点以及时间点的数目，且不存在技术障碍。与此同时，对比文件1已经公开了培养基中加入柠檬酸铁（III）至最终浓度400mg/L（参见针对权利要求1的意见评述）。本技术领域中公知，柠檬酸铁（III）的分子量为245，经过换算，培养基中柠檬酸铁（III）的终浓度400mg/L=400/245mM=1.63 mM（落入权利要求5限定的浓度范围内）。同时，对比文件1已经公开了至少一种铁源的浓度至少为2mg/l（参见针对权利要求1的意见评述），由此，本领域技术人员可以在对比文件1公开的浓度范围的基础上基于实际使用的具体铁源进行常规选择或调整铁源的浓度，进而确定细胞培养基中铁的摩尔浓度。由此，在其引用的在先权利要求不具备创造性时，权利要求3-7请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
4.权利要求8-17均直接或间接引用权利要求1，并分别作了进一步限定。对比文件1还公开了以下技术特征：对细胞的类型并不限定，细胞类型例子包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌细胞和酵母细胞，细胞还可以是原代细胞或干细胞，这些细胞可能是自然产生的细胞而不是被转化或转染的细胞，这些细胞也可以是与一个或更多的重组基因表达载体转染或转化的重组细胞，这些细胞可以用病毒转化以产生任何产物，例如病毒产物；这些细胞可来源于仓鼠、老鼠、人类或其他动物；这些细胞也可以是细胞株，例如但不限于CHO细胞、NS0细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、SP2/0细胞；优选的实施方式是连续过程、分批过程、分批流加过程、分批补料过程或灌注过程；优选的培养基包含由动物来源、植物来源或酵母的水解物；首选培养基是不含水解物的（参见说明书第18页第3-13行，第17页第9-11行，第11页第19行至第12页第10行）。至于实际操作中所具体使用的哺乳动物细胞类型、细胞培养过程的方式及规模、培养基体积、培养基中是否含有水解物，可由本领域技术人员进行常规选择。由此，在其引用的在先权利要求不具备创造性时，权利要求8-17请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
5.权利要求18-28均直接或间接引用权利要求1，并分别作了进一步限定。对比文件1还公开了以下技术特征：在培养基中培养细胞的方法是一个过程，所述过程是指一个细胞产物产生的过程，尤其是一个表达蛋白，尤其是从细胞表达和分泌；所有实验使用的是CHO DG44宿主细胞系，宿主细胞系经携有lgG抗体基因的载体转染，培养基中使用MTX进行转染扩增，生产一种抗体克隆分离和克隆，一种抗体的克隆被分离出来，然后这种克隆可应用于所有实验（参见说明书第18页第22-26行，第21页第4-9行）。同时，使用其他的重组蛋白或抗体或其片段作为替换手段以及在方法中加入重组蛋白的纯化步骤是本领域技术人员容易想到的；至于具体的重组蛋白或抗体种类，可由本领域技术人员进行常规选择。由此，在其引用的在先权利要求不具备创造性时，权利要求18-28请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
6.权利要求29请求保护“从根据权利要求18-28任一项的方法培养的细胞生产的重组蛋白”。对比文件1（参见实施例，说明书第21页）中公开了CHO DG44宿主细胞系转染了携带一种IgG抗体基因的载体，分离产生了抗体的克隆，并在所有的实验中使用该克隆。虽然具体实施例中未明确实验中分离得到该抗体，但根据上述公开可见其利用所述培养方法培养了所述宿主细胞，产生了IgG抗体，其属于重组抗体，本领域技术人员基于此能够想到利用该方法能够培养细胞生产重组蛋白。基于前述审查意见，权利要求29所要求保护的技术方案，对所属技术领域的技术人员来说是显而易见的，不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）对复审请求人相关意见的评述
针对复审请求人的意见陈述，合议组认为：
（1）对比文件1的实施例6中第一段中明确表明细胞培养基在制备时不含铁和多胺，并不是最初就含有400mg/l柠檬酸铁，在第六天向培养基中补充柠檬酸铁（III）使最终浓度达到400mg/l，也就说明柠檬酸铁的浓度在培养之初更低。实施例6对于本领域技术人员的启示主要在于本领域技术人员可以基于实际操作中所添加的含铁组合物中铁源及其浓度的不同，通过有限的试验根据细胞的生长和活力来确定含铁组合物的适宜添加的时机，尽管实施例7和9在无铁培养基中生长细胞的目的是耗尽细胞内铁以测定特定铁源的作用，但无论其实验目的如何，该实验都说明了即使初始培养基不含有铁元素而通过培养过程中后续补充铁元素对细胞培养的可行性，即使预先的细胞铁饥饿对于精胺和葡聚糖铁功能性是不必需的，也不意味着预先的铁饥饿是有害的，因此并不会阻碍本领域技术人员从对比文件1中除所述实施例外其它部分已经得到的明确启示（参见针对权利要求1的评述），即培养起始时培养基中可不含铁或只含有微量的铁，相似的，即使其它实施例中存在起始时培养基中含铁的方案也无法阻碍上述启示。（2）对比文件1已经公开了其方法能够提高细胞生长、细胞活力或细胞产率，而细胞生长、细胞活力或细胞产率的提高，会使得细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价增加，是本领域技术人员可以合理预期并通过有限的试验加以确定的。也就是说，本申请说明书中记载的在细胞培养过程中添加高浓度铁不仅没有毒性，反而导致细胞密度、存活和效价的显著增加的技术效果是本领域技术人员在显而易见的技术方案的基础上通过有限的试验即可验证获得的，并不属于预料不到的技术效果，况且本申请实施例中均未记载起始培养过程中培养基的具体成分和培养基体积，因此其中是否含有权利要求中限定含量的铁及其体积并不清楚，因此其也并不能证明权利要求1所要求保护的技术方案能够产生预料不到的技术效果。
根据上述事实和理由，本案合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年01 月05 日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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