发明创造名称：牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法
外观设计名称：
决定号：188674
决定日：2019-09-02
委内编号：1F272140
优先权日：
申请（专利）号：201710904037.0
申请日：2017-09-29
复审请求人：中国农业科学院农产品加工研究所
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：尹昕
合议组组长：韩世炜
参审员：吴文英
国际分类号：C12P21/06，C07K1/30
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：对于方法权利要求而言，当发明相对于现有技术的区别技术特征涉及材料、试剂、参数和条件等的选择和调整时，虽然现有技术没有记载上述具体内容，但如果本领域技术人员通过有限的试验就能够引入这样的区别技术特征，则不能认定该发明相对于所述现有技术具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201710904037.0，名称为“牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法”的发明专利申请。申请人为中国农业科学院农产品加工研究所。本申请的申请日为2017年09月29日，公开日为2018年01月26日。
经实质审查，针对申请人于申请日提交的说明书摘要、说明书第1-46、48-108段、说明书附图图1-9、摘要附图；申请日提交的经初审审查员依职权修改的说明书第47和109段；2018年9月28日提交的权利要求第1项，国家知识产权局原审查部门于2018年12月05日以本申请不符合专利法第22条第3款的规定为由，驳回了本发明专利申请。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将冷冻牦牛骨原料经过优选和清理后通过硬质骨破碎机破碎制得牦牛骨破碎料，所述冷冻牦牛骨原料的冷冻温度为-18℃，所述牦牛骨破碎料的粒径为10-20mm；
步骤二：将所述牦牛骨破碎料进行清洗去杂；
步骤三：将经过清洗去杂的所述牦牛骨破碎料采用乙醚脱脂处理后，再使用EDTA或HCl的方法进行脱钙处理得到脱脂脱钙牦牛骨；所述乙醚脱脂处理为采用乙醚低温回流4～5h进行脱脂；所述脱钙处理为采用0.50mol/L EDTA或浓度为0.5或1.0mol/L的HCl；
步骤四：将脱脂脱钙牦牛骨使用乙酸进行溶解并加入胃蛋白酶进行酶解处理；所述乙酸溶液与所述脱脂脱钙牦牛骨的重量份比例为1：8-10；所述乙酸溶液的摩尔浓度为0.3-0.5mol/L；所述胃蛋白酶与所述乙酸溶液的重量份比例为1-1.8：100；所述酶解处理为进行震摇浸提，时间为24h-120h；
步骤五：将酶解后所得上清液加入NaCl溶液进行盐析，所述NaCl溶液的摩尔浓度为0.5-1.0mol/L；
步骤六：将盐析后产物进行离心得到沉淀物，离心温度为4℃，离心转速为10000rmp，离心时间为30min；
步骤七：将沉淀物冻干得到牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白成品，冻干温度为-40℃--47℃，冻干时间为12h-24h，真空度为-0.08Mpa--0.09Mpa。”
驳回决定认为：本申请权利要求1请求保护一种牦牛骨I型胶原蛋白的制备方法，对比文件1（“牛骨I型胶原蛋白提取及结构表征”，刘丽莉 等，《食品科学》，第31卷，第2期，第87-91页，公开日2010年12月31日）公开了一种牛骨I型胶原蛋白的提取方法，两者的区别技术特征在于：1）权利要求1限定的是从牦牛骨中制备I型胶原蛋白，对比文件1公开的是从牛骨中制备I型胶原蛋白；2）二者的制备方法不完全相同。基于上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题是如何高效从牦牛骨中制备纯度高的I型胶原蛋白。针对区别技术特征1），对比文件1还公开了牛骨中含有丰富的I型胶原蛋白和钙、磷等矿物质，牛骨总质量的20%-30%为蛋白质，主要为胶原蛋白，可见牛骨是非常好的胶原蛋白生产材料。而牦牛作为重要的畜牧资源，被广泛饲养，用于生产和食用，存栏量大。则为拓宽胶原蛋白的来源，提高产量，本领域技术人员有动机采用牦牛骨作为原料。
针对区别技术特征2），具体地，对于步骤一，将牛骨进行冷冻存储主要是为了确保牛骨中胶原蛋白等物质的活性，-18℃是常规的冷冻保鲜温度；硬质骨破碎机是骨质品处理中常用的机器，本领域技术人员根据生产实际有能力进行相应处理和选择；由于对比文件1公开了不同粒径对脱钙量的研究，可见，对比文件1给出了骨粒径大小与脱钙程度相关的技术启示，在此基础上，本领域技术人员有动机通过常规试验确定合适范围的粒径。
对于步骤二，对比文件1还公开了牛长骨含有约18.45%的脂肪，脂肪的存在明显影响提取胶原蛋白的品质，同时可能使蛋白产生异味。经流动水清洗后的碎骨原料采用不同的方法脱脂。因此，为提高胶原蛋白的品质，本领域技术人员有动机对破碎料进行清洗去杂。
对于步骤三，对比文件1已经公开了采用乙醚低温回流脱脂，对于其回流时间，本领域技术人员有能力根据脱脂效果，通过常规试验确定合适的时间范围。此外，对比文件1还公开了采用0.48mol/L的盐酸进行脱钙处理，对比文件2（“牛骨胶原多肽的制备及其清除自由基活性研究”，王晨，《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》，第3期，B024-33，公开日2011年03月15日）公开了采用不同浓度的EDTA溶液和盐酸溶液脱钙的技术方案，由此本领域技术人员有动机选择使用0.5mol/L EDTA或浓度为0.5mol/L或1.0mol/L的盐酸进行脱钙处理。
对于步骤四，对比文件1已经公开了采用柠檬酸和胃蛋白酶对骨破碎料进行处理。此外，对比文件1还公开了传统的胶原蛋白所用的提取介质为0.01mol/L盐酸或0.5mol/L醋酸。因此，为提高胶原蛋白的得率，本领域技术人员有动机尝试采用醋酸替换柠檬酸和胃蛋白酶进行复合使用，并通过常规试验调整试剂的用量及浓度。
对于步骤五，对比文件1已经公开了向胶原蛋白组织液中加入NaCl固体并不停搅拌，使浓度达到2mol/L进行盐析。本领域技术人员可常规选择NaCl的形态以及合适浓度。
对于步骤六，对比文件1也已经公开了对盐析后产物进行离心得沉淀。而在低温离心能够保护胶原蛋白活性，且4℃也是本领域常用的低温离心温度，且本领域技术人员有能力通过常规试验确定离心速度和时间。
对于步骤七，对比文件2公开了对抽提获得絮状沉淀直接进行冷冻干燥。为简化制备工艺、节约生产成本，本领域技术人员有动机在对比文件1公开采用NaCl盐析获得沉淀后，直接进行冷冻干燥并调整具体参数。
综上所述，在对比文件1的基础上，结合对比文件2和本领域的惯用手段得到权利要求1所要求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2019年01月24日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了修改后的权利要求书（1页，共1项），其中对步骤三中盐酸的浓度、步骤四中胃蛋白酶和乙酸溶液的重量份比例以及步骤五中氯化钠溶液的摩尔浓度进行了修改，并增加了对制得的胶原蛋白成品进行分析和微观结构观察的步骤八。修改后的权利要求具体如下：
“1. 牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将冷冻牦牛骨原料经过优选和清理后通过硬质骨破碎机破碎制得牦牛骨破碎料，所述冷冻牦牛骨原料的冷冻温度为-18℃，所述牦牛骨破碎料的粒径为10-20mm；
步骤二：将所述牦牛骨破碎料进行清洗去杂；
步骤三：将经过清洗去杂的所述牦牛骨破碎料采用乙醚脱脂处理后，再使用EDTA或HCl的方法进行脱钙处理得到脱脂脱钙牦牛骨；所述乙醚脱脂处理为采用乙醚低温回流4～5h进行脱脂；所述脱钙处理为采用0.50mol/L EDTA或浓度为1.0mol/L的HCl；
步骤四：将脱脂脱钙牦牛骨使用乙酸进行溶解并加入胃蛋白酶进行酶解处理；所述乙酸溶液与所述脱脂脱钙牦牛骨的重量份比例为1：8-10；所述乙酸溶液的摩尔浓度为0.3-0.5mol/L；所述胃蛋白酶与所述乙酸溶液的重量份比例为1.6：100；所述酶解处理为进行震摇浸提，时间为24h-120h；
步骤五：将酶解后所得上清液加入NaCl溶液进行盐析，所述NaCl溶液的摩尔浓度为0.9mol/L；
步骤六：将盐析后产物进行离心得到沉淀物，离心温度为4℃，离心转速为10000rmp，离心时间为30min；
步骤七：将沉淀物冻干得到牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白成品，冻干温度为-40℃--47℃，冻干时间为12h-24h，真空度为-0.08Mpa--0.09Mpa；
步骤八：对制得的牦牛骨I型胶原蛋白成品进行UV光谱分析、FT-IR分析、DSC分析和SDS-PAGE分析，并进行微观结构观察。”
复审请求人认为：本申请权利要求1以下技术特征没有被对比文件1公开：1）权利要求1限定了制备牦牛骨I型胶原蛋白及其制备过程和参数；2）权利要求1限定了对制得的牦牛骨I型胶原蛋白进行分析和观察。因此本发明权利要求1实际要解决的问题是如何提供一种结构完整且纯度高的牦牛骨胶原蛋白的制备方法。针对区别技术特征1），权利要求1对牦牛骨进行处理制备胶原蛋白，而对比文件1和对比文件2均是对普通牛骨进行处理，牦牛和普通牛骨头的密度以及营养元素均是不同的，对普通牛骨的处理方法并不能简单的拿来运用至处理牦牛骨；本发明权利要求1中还限定了牦牛骨的冷冻条件和粒径大小，采用冷冻处理和这样的粒径大小有利于后续处理，使得清洗更加干净，除杂更加彻底，并不只是为了保鲜；此外，权利要求1中脱钙处理采用0.5mol/L的EDTA，不同于对比文件2中0.25mol/L的EDTA浓度，而采用盐酸脱钙时浓度为1.0mol/L，也不同于对比文件1中的盐酸的浓度，另外在本申请说明书中也公开了采用不同浓度的脱钙剂对胶原蛋白得率的影响，明显看出采用本发明的浓度相对于对比文件1和2取得了更好的脱钙效果；本发明权利要求1中采用乙酸和胃蛋白酶的组合进行蛋白的提取并采用NaCl进行盐析，进而通过离心和冻干得到成品，并限定了胃蛋白酶与乙酸溶液的重量份比例为1.6:100，这样制得的胶原蛋白中Gly比例是最高的。本发明权利要求1中还限定了盐析时的NaCl溶液的摩尔浓度为0.9mol/L，并验证了其浓度与胶原蛋白得率的关系。针对区别技术特征2），本申请权利要求1中还限定了对制得的牦牛骨I型胶原蛋白成品进行UV光谱分析、FT-IR分析、DSC分析和SDS-PAGE分析，并进行微观结构观察，从而验证制得的牦牛骨I型胶原蛋白的各种性能和结构。由说明书中的验证试验说明以及附图中可以明确看出采用本发明制得的牦牛骨I型胶原蛋白的结构分布均匀，保持了完成了胶原蛋白结构。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年02月20日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见中除了进一步重申其在驳回决定中提出的意见外，还进一步指出，对比文件1已经公开了采用终浓度达到2mol/L 的NaCl盐析，虽然这与本申请限定的浓度不相同，但对比文件2公开了采用5.0% NaCl（经换算约为0.86 mol/L）进行盐析。因此，为降低NaCl使用量以便于后期除盐操作，在对比文件1和2公开内容的教导下，本领域技术人员有动机根据获得的胶原蛋白得率和纯度等进行常规选择和调整NaCl浓度。针对有关技术效果的内容，对比文件1公开了对获得牛胶原蛋白进行紫外扫描、FT-IR、热收缩温度分析（DSC）和电泳分析（SDS-PAGE）得出，所提胶原蛋白纯度较高，达到了电泳纯，较好的保持了胶原蛋白的三螺旋结构。此外，对比文件1还公开了胶原蛋白中甘氨酸和特征氨基酸羟脯氨酸和脯氨酸含量高，因此，本领域技术人员可以合理预期获得的胶原蛋白中Gly含量应处于较高水平，并可通过常规试验确定其具体比例。本申请胶原蛋白得率最高为3.4%左右；而对比文件1和2的技术效果则分别为5.6%和9.93%，可见本申请也未取得更好的技术效果。综上所述，坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年07月04日向复审请求人发出复审通知书，其中指出：
本申请权利要求1要求保护一种牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其与对比文件1的区别技术特征在于：1）权利要求1制备I型胶原蛋白的原料为牦牛骨，对比文件1记载的原料为牛骨；2）二者限定的参数不同。具体包括：对原材料的处理步骤中权利要求1限定了冷冻温度，且采用硬质骨破碎机破碎，同时两者破碎的粒径不同；脱脂脱钙步骤中权利要求1中限定了脱脂的时间，同时两者盐酸脱钙的浓度不同，此外还限定了采用EDTA脱钙的并列技术方案；酶解步骤中权利要求1采用乙酸，对比文件1采用了柠檬酸，同时两者的胃蛋白浓度、料液比、处理时间等具体参数不同；盐析步骤中权利要求1和对比文件1分别采用了0.9mol/L和2mol/L的NaCl溶液；盐析后离心、冷冻干燥的具体条件不同；产品检测的方法不同。基于上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题是提供一种从牦牛骨中制备I型胶原蛋白的新方法。
针对区别技术特征1），根据对比文件1的记载，牛骨总质量的20%-30%为蛋白质，其中主要为胶原蛋白，是非常好的胶原蛋白生产材料。为拓宽胶原蛋白的来源，本领域技术人员有动机采用牦牛骨作为原料，且没有任何技术上的障碍。
针对区别技术特征2），首先，日常生活、生产中一般需要将肉类冷冻冷藏保存，权利要求1中限定的“-18℃”是本领域常规的冷冻保鲜温度，硬质骨破碎机也是骨质品处理中常用的机器。对于骨粒径，对比文件1公开了骨粒径大小与脱钙程度的关系，本领域技术人员通过常规试验可以获得本申请的粒径。其次, 乙醚低温回流脱脂是本领域提取胶原蛋白的常规脱脂办法，本领域技术人员有能力通过常规试验确定合适的时间范围。对于脱钙时采用的EDTA或盐酸溶液的浓度，对比文件2公开的制备牛骨胶原蛋白的方法中同样采用了1.0 mol/L的盐酸溶液，并指出在该浓度下效果较好。其作用都是为了取得更好的脱钙效果。对于酶解步骤，对比文件1除记载采用柠檬酸和胃蛋白酶对骨破碎料处理外，还公开了醋酸可以作为传统的提取介质，其得率约为3.0。乙酸和柠檬酸都是本领域常用的酸性试剂，同时其浓度或用量等具体参数也可以通过常规试验获得。第四，对于盐析步骤中NaCl溶液的浓度，本申请的NaCl溶液的盐析效果的对比数据显示胶原蛋白得率最好为2.7左右，对比文件1盐析采用2mol/L的NaCl溶液，其制备方法最终测得的胶原蛋白得率约为2.8-5.6（参见对比文件1第89页表2）。因此，本领域技术人员可以对NaCl溶液的浓度进行常规选择，且没有证据显示本申请取得了更好的技术效果。
第五，对于离心沉淀和冷冻干燥的参数，本领域技术人员已知低温离心能保护胶原蛋白活性，离心速度和时间，冷冻干燥的参数都可以由本领域技术人员通过常规试验予以确定，其产生的技术效果也可以预期。
第六，对胶原蛋白产品的检测方法，本申请权利要求1除了对比文件1公开的紫外扫描和红外光谱分析、DSC分析、SDS-PAGE分析外所采用的FT-IR分析、微观结构观察也都是本领域常用的分析检测胶原蛋白的办法，且其意义仅在于检测，对制备方法的产率和产品性状都没有影响。
此外，针对复审请求的理由，合议组指出，1）对比文件1中未限定其牛骨的具体种类，应该理解为市场上常见的的畜牧业饲养的牛。牦牛在生物学分类中属于偶蹄目牛科、牛属，属于我国青海、西藏、四川、新疆等省区的常见畜牧动物，我国是世界上拥有牦牛最多的国家（参见本申请说明书第0003段）。虽然牦牛和其他牛类的具体特征存在差异，骨密度和营养元素不完全相同，但是没有证据表明牛骨胶原蛋白的制备需要采取和其他牛骨胶原蛋白制度完全不同的方法，本申请也未记载任何涉及牦牛骨胶原蛋白提取的特定方法。2）如前所述，冷冻状态下处理牦牛骨以及合理的破碎粒径都可以由本领域技术人员在对比文件1的基础上进行常规选择和合理调整，其技术效果也可以合理预期。3）本申请脱钙步骤中采用的EDTA和HCl的浓度已经被对比文件2公开并验证了效果，0.25mol/L EDTA和0.5mol/L EDTA对牛骨脱钙处理，骨胶原蛋白的粗提率分别为13.8%和14.1%；0.5mol/L或1.0mol/L的盐酸对牛骨脱钙处理，骨胶原蛋白的粗提率分别为9.5%和12.3%。因此，为最大程度降低骨破碎料中的钙含量，在对比文件2公开内容的教导下，本领域技术人员有动机选择使用0.5mol/L EDTA或浓度为1.0mol/L的盐酸进行脱钙处理。4）对比文件1已经给出了乙酸可以作为提取介质、酸与胃蛋白酶复合使用相较于单一使用酸可以提高胶原蛋白得率的技术启示，柠檬酸和醋酸为常见的弱酸，为提高胶原蛋白的得率，本领域技术人员有动机尝试采用醋酸替换柠檬酸和胃蛋白酶进行复合使用。5）对比文件1已经公开了采用终浓度达到2mol/L 的NaCl盐析，虽然这与本申请限定的浓度不相同，为降低NaCl使用量以便于后期除盐操作，在对比文件1公开内容的教导下，本领域技术人员有动机根据获得的胶原蛋白得率和纯度等进行常规选择和调整NaCl浓度。6）针对复审请求人有关技术效果的陈述，对比文件1公开了对获得牛胶原蛋白进行紫外扫描、FT-IR、热收缩温度分析（DSC）和电泳分析（SDS-PAGE）得出，所提胶原蛋白纯度较高，达到了电泳纯，较好的保持了胶原蛋白的三螺旋结构。此外，对比文件1还公开了胶原蛋白中甘氨酸和特征氨基酸羟脯氨酸和脯氨酸含量高，因此，本领域技术人员可以合理预期获得的胶原蛋白中Gly含量应处于较高水平。因此复审请求人的复审理由不具有说服力。
综上所述，在对比文件1的基础上，结合对比文件2和本领域的常规技术手段得到权利要求1所要求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具有突出的实质性特点，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
复审请求人于2019年08月02日提交了意见陈述书，其中指出：1）权利要求1是针对-18℃冷冻处理过的冷冻牦牛骨，UV光谱分析中，牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白强吸收峰在234nm波长处，而对比文件1中公开的牛骨胶原蛋白和牛腱Ⅰ型胶原蛋白强吸收峰分别在228nm和230nm处，这说明本发明提供的牦牛骨和对比文件1所提供的牛骨所制备的胶原蛋白的氨基酸结构和组成存在较大的差异。2）本申请权利要求1各步骤之间存在协同作用。超低温处理过的牦牛骨，其Ⅰ型胶原蛋白中的各氨基酸结构和组成处于稳定状态，所以乙醚低温回流脱脂过程必须控制在4~5h，既达到脱脂完全，各种氨基酸仍处于非活跃状态，进一步的脱钙过程采用0.5mol/L的EDTA或者1.0mol/L的盐酸，其溶度远高于对比文件1中公开的最优溶度，这是因为普通牛骨钙含量低于牦牛骨，因此采用0.48~0.6mol/L的盐酸就可以使得脱钙达到平衡，而对牦牛骨而言，溶度较低的溶剂会使得脱钙处理不完全，影响所制备的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的品质；脱钙完全是提高所得胶原蛋白中定向氨基酸含量的必要条件，牦牛骨经过脱脂、脱钙、酶解后，其Ⅰ型胶原蛋白中的各氨基酸已经处于活跃状态，较高溶度的NaCl溶液会影响Gly、Lys、Pro的析出，只有合理的NaCl溶液溶度才能析出更多的氨基酸。3）参考文献“5个品种牛骨的营养组成及其含量差异分析，吴婷等，食品工业科技，2017年第02期，第342~348页”中公开了拉萨牦牛骨具有相对高的营养价值，其氨基酸含量明显高于其他黄牛品种的不同部位骨，其中Gly、Pro、Glu、Ala、Arg等5种氨基酸含量均显著高于其他品种牛骨，鲜味氨基酸（Asp、Glu、Gly和Ala）也是5种牛骨中最高的），证明牦牛骨和其他牛类在氨基酸的结构和组成存在较大差异，其制备途径必然不同于其他牛骨胶原蛋白制备途径。4）本申请实际解决的技术问题是，在制备牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白时，最大量地获取定向的氨基酸组成。对于本申请的技术效果，上述参考文献中公开了从拉萨牦牛骨中制备胶原蛋白中获取到的氨基酸的组成和含量，本申请获取得到的氨基酸含量远远高于现有技术所得到的氨基酸含量，例如Phe含量是现有技术的5倍多，Gly、Glu含量是现有技术的4倍多，Ala、Pro、Arg、Asp、Leu、Lys、Val含量是现有技术的3倍多。因此本申请具备创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人于2019年01月24日提出复审请求时提交了修改的权利要求书全文替换页（共1项1页），经审查，其修改符合专利法第33条以及专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审决定针对的文本为：申请日2017年9月29日提交的说明书摘要及其附图、说明书第1-46、48-108段、说明书附图1-9，经初审审查员依职权修改的说明书第47和109段；以及2019年01月24日提交的权利要求第1项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
对于方法权利要求而言，当发明相对于现有技术的区别技术特征涉及材料、试剂、参数和条件等的选择和调整时，虽然现有技术没有记载上述具体内容，但如果本领域技术人员通过有限的试验就能够引入这样的区别技术特征，则不能认定该发明相对于所述现有技术具备创造性。
本案中，权利要求1要求保护一种牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，根据本申请说明书的记载，采用权利要求1的方法制备的I型胶原蛋白得率约为2.7-3%（参见说明书第0084段表1-1，说明书附图3、4）；同时其氨基酸的组成具有典型的I型胶原蛋白的特征，且基本保留了完整的三螺旋结构（参见说明书第0092-0108段）。
对比文件1公开了一种牛骨I型胶原蛋白的提取方法。其中公开的优选的具体工艺条件包括：破碎的粒径为5mm×10mm牛骨经水洗后（相当于权利要求1步骤一、步骤二），采用乙醚低温回流脱脂，0.48mol/L的HCl脱钙处理（相当于权利要求1步骤三），1%柠檬酸和1%胃蛋白酶（m/V）为提取介质，料液比为1:8（mg/mL）（相当于权利要求1步骤四），之后将获得的上清液采用2mol/L NaCl盐析（相当于权利要求1步骤五），使胶原蛋白充分沉淀，采用8500r/min离心20min，用0.5mol/L 冰醋酸重新溶解，重复盐析一次，离心后得沉淀（相当于权利要求1步骤六）；最后将沉淀物冷冻干燥得到胶原样品（相当于权利要求1步骤七）；此外，对比文件1还对制得的产物采用紫外扫描和红外光谱分析、DSC分析、SDS-PAGE分析等手段进行了鉴定（相当于权利要求1步骤八）。根据对比文件1的记载，采用上述方法制得的牛骨胶原蛋白得率达到5.6%，牛骨胶原蛋白保留了大量的三股螺旋结构，氨基酸的组成和含量也符合Ⅰ型胶原蛋白的特点（参见第88页第1.3.2——1.3.5节，第1.6节，第89页图1、图3，第89页表2，第90页第2.4.2和2.4.4节）。
权利要求1的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于：1）权利要求1制备I型胶原蛋白的原料为牦牛骨，对比文件1记载的原料为牛骨；2）二者限定的参数不同。具体包括：对原材料的处理步骤中权利要求1限定了冷冻温度，且采用硬质骨破碎机破碎，同时两者破碎的粒径不同；脱脂脱钙步骤中权利要求1中限定了脱脂的时间，同时两者盐酸脱钙的浓度不同，此外还限定了采用EDTA脱钙的并列技术方案；酶解步骤中权利要求1采用乙酸，对比文件1采用了柠檬酸，同时两者的胃蛋白浓度、料液比、处理时间等具体参数不同；盐析步骤中权利要求1和对比文件1分别采用了0.9mol/L和2mol/L的NaCl溶液；盐析后离心、冷冻干燥的具体条件不同；产品检测的方法不同。基于上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题是提供一种从牦牛骨中制备I型胶原蛋白的新方法。
针对区别技术特征1），根据对比文件1的记载，牛骨总质量的20%-30%为蛋白质，其中主要为胶原蛋白，是非常好的胶原蛋白生产材料（参见对比文件1第87页左栏倒数第1段和右栏第1段）。为拓宽胶原蛋白的来源，本领域技术人员有动机采用牦牛骨作为原料，且没有任何技术上的障碍。因此权利要求1在对比文件1公开的牛骨的基础上选择牦牛骨作为提取胶原蛋白的原料并不能为其带来创造性。
针对区别技术特征2），首先，本领域公知蛋白质较易变性，所以日常生活、生产中一般需要将肉类冷冻冷藏保存，权利要求1中限定的“-18℃”也是本领域常规的冷冻保鲜温度。硬质骨破碎机是骨质品处理中常用的机器，本领域技术人员可以根据实际情况选择。同时对比文件1还公开了不同的碎骨粒径对脱钙量的研究，给出了骨粒径大小与脱钙程度的关系（参见对比文件1第89页右栏第2.2.2节），并记载了5*10mm的优选粒径，这与权利要求1中限定的10-20mm的粒径虽然有一定区别，但仍然在本领域技术人员通过常规试验可以调整的范围。且没有证据表明本申请对温度、粒径等参数的选择取得了预料不到的技术效果。
其次, 乙醚低温回流脱脂是本领域提取胶原蛋白的常规脱脂办法，本领域技术人员有能力根据脱脂效果，通过常规试验确定合适的时间范围。对于脱钙时采用的EDTA或盐酸溶液的浓度，对比文件2公开的制备牛骨胶原蛋白的方法中同样采用了1.0 mol/L的盐酸溶液，并指出在该浓度下效果较好。具体而言，对比文件2比较了不同浓度的EDTA溶液和盐酸溶液的脱钙效果，结果发现0.25mol/L EDTA和0.5mol/L EDTA处理牛骨的胶原蛋白粗提率分别为13.8%和14.1%，0.5mol/L或1.0mol/L盐酸处理牛骨的胶原蛋白粗提率分别为9.5%和12.3%（参见对比文件2第19页第2.4.3节，第18页表2-1）。可见，EDTA和盐酸在对比文件2中所起的作用与其在本申请中所起的作用是相同的，都是为了取得更好的脱钙效果从而提高制备牛骨胶蛋白的效率。因此，为最大程度降低骨破碎料中的钙含量，本领域技术人员有动机选择使用0.5mol/L EDTA或浓度为1.0mol/L的盐酸进行脱钙处理。
第三，对于酶解的步骤，对比文件1除记载采用柠檬酸和胃蛋白酶对骨破碎料处理外，还公开了醋酸可以作为传统的提取介质，其得率约为3.0，同时酸与胃蛋白酶复合使用相较于单一使用酸可以提高胶原蛋白得率（参见对比文件1第89页表2和第90页左栏第1段）。乙酸和柠檬酸都是本领域常用的酸性试剂，没有证据表明选择乙酸可取得预料不到的技术效果。乙酸浓度、料液比、胃蛋白酶用量等具体参数也可以通过常规试验获得。
第四，对于盐析步骤中NaCl溶液的浓度，本申请对不同浓度的NaCl溶液的盐析效果的对比数据显示采用0.9mol/L、1.8mol/L、2.25mol/L的NaCl溶液的胶原蛋白得率分别为2.7、2.0和2.2左右，对比文件1盐析过程采用2mol/L的NaCl溶液，其制备方法最终测得的胶原蛋白得率约为2.8-5.6（参见对比文件1第89页表2）。因此，本领域技术人员可以对NaCl溶液的浓度进行常规选择，且没有证据显示本申请取得了更好的技术效果。
第五，对于离心沉淀和冷冻干燥的参数，本领域技术人员已知低温离心能保护胶原蛋白活性，离心速度和时间，冷冻干燥的参数都可以由本领域技术人员通过常规试验予以确定，其产生的技术效果也可以预期。
第六，对胶原蛋白产品的检测方法，本申请权利要求1除了对比文件1公开的紫外扫描和红外光谱分析、DSC分析、SDS-PAGE分析外所采用的FT-IR分析、微观结构观察也都是本领域常用的分析检测胶原蛋白的办法，且其意义仅在于检测，对制备方法的产率和产品性状都没有影响。
综上所述，在对比文件1的基础上，结合对比文件2和本领域的常规技术手段得到权利要求1所要求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具有突出的实质性特点，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
3、对复审请求人相关意见的评述
1）关于本发明的方法制备的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白与对比文件1制备的牛骨胶原蛋白的区别。
首先，根据本申请说明书第0031段的记载，“牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的紫外吸收峰234nm与黄牛骨胶原蛋白一致，符合牛骨胶原蛋白的吸收特征。”可见，本发明原始申请文件的记载认为牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白与一般的牛骨胶原蛋白并没有本质上的区别。其次，对比文件1中公开的牛骨胶原蛋白和牛腱Ⅰ型胶原蛋白强吸收峰分别在228nm和230nm处，两者不完全一致的“可能的原因是氨基酸组成和结构存在一定差别。”（参见对比文件1第90页左栏第2.4.1节第2段以及图5）。本领域技术人员已知不同动物组织来源的原料中的氨基酸组成和含量会有一定差异，但没有证据表明这种差异会导致提取方法发生本质改变。本发明的牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白紫外吸收峰与对比文件1中的牛骨胶原蛋白存在的差异可能是牦牛骨和对比文件1的牛骨本身的区别造成的，并不能说明本发明的方法会导致提取的骨胶原蛋白的氨基酸组成或结构会发生明显改变。
2）关于本申请权利要求1各步骤之间的协同作用。
方法步骤中的协同作用一般是指各个步骤采取的试剂和/或参数需要相互协调，发挥的总体作用要大于各自单独的作用。但本申请说明书中并没有任何相关的记载，也没有证据能够表明权利要求1中各个步骤之间产生了所述的协同作用。如前所述，本申请的各个参数都是本领域技术人员在现有技术中通过有限的实验可以调整从而获得相对更优的技术效果。对比文件1中未记载具体的乙醚低温回流脱脂时间，但这是本领域技术人员可以根据具体情况进行的常规选择。虽然本申请脱钙过程采用0.5mol/L的EDTA或者1.0mol/L的盐酸，其浓度高于对比文件1，但对比文件2中已经公开了所述脱钙试剂的浓度，且对比文件2采用EDTA或者盐酸的目的和本申请相同，本领域技术人员可以从中获得采取所述浓度的试剂进行脱钙的技术启示。
3）关于氨基酸含量。
对于复审请求人在意见陈述中提及的参考文献“5个品种牛骨的营养组成及其含量差异分析，吴婷等，食品工业科技，2017年第02期，第342~348页”，其表2对牛“不同品种后股骨氨基酸含量”的对比显示拉萨牦牛骨具有相对高的营养价值，整体而言其氨基酸含量高于其他的牛品种。所述内容是对牦牛骨总体营养物质的研究，并非针对单独提取的胶原蛋白。而且氨基酸含量的差异是牦牛骨本身的特点带来的，作为现有技术，请求人提供的参考文献也说明了本领域对牦牛骨的氨基酸含量比较清楚，选择牦牛骨作为提取胶原蛋白的对象无需本领域技术人员需要付出创造性劳动，同时也没有证据能够表明不同品种牛骨氨基酸含量的差异必然会导致其制备途径不同。
4）关于技术效果。
复审请求人认为本申请实际解决的技术问题是，在制备牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白时最大量地获取定向的氨基酸组成，但本申请说明书中记载了本申请的胶原蛋白具有典型的Ⅰ型胶原蛋白组成特点，除此之外并没有强调定向获取某种特定的氨基酸。复审请求人提及的上述参考文献中氨基酸的组成和含量采用酸法水解制备获得（参见其第1.2.3小节样品的处理过程），其目的是鉴定不同牛骨中氨基酸的组成和含量，其具体步骤不同于本申请提取牛骨胶原蛋白的方法。对本申请的技术效果更具参考价值的是最接近的现有技术即对比文件1。如前所述，对比文件1中牛骨胶原蛋白得率达到5.6%，且保留了大量的三股螺旋结构，氨基酸的组成和含量也符合Ⅰ型胶原蛋白的特点，而本申请采用权利要求1的方法制备的I型胶原蛋白得率约为2.7-3%；同时其氨基酸的组成具有典型的I型胶原蛋白的特征，且基本保留了完整的三螺旋结构。相关的实验数据不能说明本申请相对于现有技术取得了预料不到的技术效果。
综上所述，复审请求人的理由不能说明本申请具备创造性。
基于以上事实和理由，合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年12月05日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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