发明创造名称：基因I型草鱼呼肠孤病毒的检测方法及检测试剂盒
外观设计名称：
决定号：187878
决定日：2019-08-26
委内编号：1F242630
优先权日：
申请（专利）号：201410841375.0
申请日：2014-12-29
复审请求人：浙江省淡水水产研究所
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：彭郁葱
合议组组长：邢维玲
参审员：李娟娟
国际分类号：C12Q1/70，C12Q1/68，C12R1/93
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果发明相对于最接近的现有技术存在区别技术特征，而现有技术给出了将区别技术特征应用于最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，这种启示会使本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术从而获得要求保护的发明，并且所获得的发明的技术效果没有超出合理预期的范围，则该发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410841375.0，名称为“基因I型草鱼呼肠孤病毒的检测方法及检测试剂盒”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请人为浙江省淡水水产研究所，申请日为2014年12月29日，公开日为2015年04月29日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年08月09日以权利要求1-5不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为，申请日2014年12月29日提交的说明书摘要、说明书第1-6页（即第1-55段）、说明书附图第1-4页、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-2页；2016年06月22日提交的权利要求第1-5项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 基因I型草鱼呼肠孤病毒的检测试剂盒，其特征在于包含恒温扩增预混反应液，由以下组份组成：0.15-0.25μM GCRVI-F3和GCRVI-B3，1-2μM GCRVI-FIP和GCRVI-BIP，0.02-0.08μM GCRVI-FITC-Probe，15-25mM pH8.0～9.0Tris-HCl，8-15mM氯化钾，10-25mM硫酸铵，5-15mM硫酸镁，0.1-0.3％Triton X-100，0.4-0.8M甜菜碱，1-3mM dNTP，1-3U逆转录酶AMV和5-15U Bst DNA聚合酶大片段，预混液体积为20-25μL；其中，引物GCRVI-F3序列SEQ ID No：1、引物GCRVI-B3序列SEQ ID No：2；引物GCRVI-FIP序列SEQ ID No：3、引物GCRVI-BIP序列SEQ ID No：4；并标记FITC探针，探针GCRVI-FITC-Probe序列SEQ ID No：5；其中其中GCRVI-BIP为5’端生物素(biotin)标记引物；GCRVI-FITC-Probe为5’端FITC标记探针。
2. 根据权利要求1的检测试剂盒，其特征在于恒温扩增预混反应液由以下组份组成：0.2μM GCRVI-F3和GCRVI-B3，1.6μM GCRVI-FIP和GCRVI-BIP，0.05μM GCRVI-FITC-Probe，20mM Tris-HCl，10mM氯化钾，15mM硫酸铵，8mM硫酸镁，0.1％Triton X-100，0.6M甜菜碱，1.4mM dNTP，1U逆转录酶AMV和8U Bst DNA聚合酶大片段，预混液体积为21μL。
3. 根据权利要求1的检测试剂盒，其特征在于还包括样品裂解液、去蛋白液、漂洗液和70％无水乙醇、RNase free water、核酸吸附柱，其中样品裂解液组成为40-60mMpH7.4Tris-HCL，3-6M的异硫氰酸胍，8-15mM EDTA；去蛋白液组成为20-40mMpH7.4的Tris-HCL，0.3-0.5M异硫氰酸胍和15-30％无水乙醇；漂洗液组成为20-40mMpH7.4的Tris-HCL，100-150mM NaCl和75％的无水乙醇。
4. 根据权利要求3的检测试剂盒，其特征在于样品裂解液组成为50mMpH7.4 Tris-HCL，4M的异硫氰酸胍，10mM EDTA；去蛋白液组成为30mMpH7.4的Tris-HCL，0.4M异硫氰酸胍和20％无水乙醇；漂洗液组成为30mMpH7.4的Tris-HCL，130mM NaCl和75％的无水乙醇。
5. 根据权利要求1的检测试剂盒，其特征在于还包括阴性对照品、阳性对照品、LFD检测试纸条、LFD检测试纸条缓冲液。”
驳回决定认为，权利要求1与对比文件4（“基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan Real-Time PCR检测方法的建立及应用”，殷亮等，水产科学，第38卷第4期，第569-575页，2014年04月30日）的区别在于：（1）本申请以LAMP法检测I型GCRV，对比文件4是以TaqMan Real-Time PCR法检测，两者采用的引物和探针序列不同。（2）本申请将GCRV的检测引物、探针以及其他LAMP反应所需溶液制备了试剂盒。然而，对比文件1（“A one-step molecular biology method for simple and rapid detection of grass carp Ctenopharyngodon idella reovirus(GCRV)HZ08 strain”,W.W.Zeng,等，Journal of Fish Biology，第82卷, 第1545–1555页，公开日：2013年04月16日）给出了以RT-LAMP技术检测GCRV更具优势的启示，而LAMP的引物设计方法及其扩增原理是本领域技术人员的公知常识，例如参考书（《现代食品微生物检测技术》，张伟，袁耀武主编，化学工业出版社，2007年9月第1版第1次印刷，第161-165页，下称公知常识证据1）。进一步，对比文件3（CN103409555A，公开日期：2013年11月27日）公开了一种以RT-LAMP-LFD法检测罗氏沼虾野田村病毒的方法及其试剂盒。在对比文件3所公开范围内选择某一浓度是容易做到的，且并未产生预料不到的技术效果。而且基于对比文件3选择以FIP或是BIP作为生物素标记对象都是常规的。因此权利要求1不具备创造性。权利要求2-5的附加技术特征或者被对比文件3公开，或者是在对比文件3公开的相应组分浓度基础上常规选择获得的，且并未产生预料不到的技术效果，因此也不具备创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2018年01月11日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书全文替换页（共2页4项）,相对于驳回决定针对的文本，将原权利要求3并入权利要求1，并相应删除原权利要求3，适应性修改其余权利要求的编号和引用关系。复审请求人认为：本申请第4段中指出并非所有的RT-LAMP检测技术都能与LFD检测技术相结合，只有引物高效扩增出特异性好的基因I型GCRV才能实现RTLAMP检测技术与LFD检测技术相结合，故本申请中利用RT-LAMP检测病毒的难点和关键在于引物的设计和反应体系条件的设置，这些都不能从对比文件4、1或3中获得启示，需要本领域技术人员付出创造性劳动。此外本申请不含氯仿、巯基乙醇等有害物质。复审请求时新修改的权利要求1如下：
“1. 基因I型草鱼呼肠孤病毒的检测试剂盒，其特征在于包含恒温扩增预混反应液，由以下组份组成：0.15-0.25μM GCRVI-F3和GCRVI-B3，1-2μM GCRVI-FIP和GCRVI-BIP，0.02-0.08μM GCRVI-FITC-Probe，15-25mM pH8.0～9.0Tris-HCl，8-15mM氯化钾，10-25mM硫酸铵，5-15mM硫酸镁，0.1-0.3％Triton X-100，0.4-0.8M甜菜碱，1-3mM dNTP，1-3U逆转录酶AMV和5-15U Bst DNA聚合酶大片段，预混液体积为20-25μL；其中，引物GCRVI-F3序列SEQ ID No：1、引物GCRVI-B3序列SEQ ID No：2；引物GCRVI-FIP序列SEQ ID No：3、引物GCRVI-BIP序列SEQ ID No：4；并标记FITC探针，探针GCRVI-FITC-Probe序列SEQ ID No：5；其中GCRVI-BIP为5’端生物素(biotin)标记引物；GCRVI-FITC-Probe为5’端FITC标记探针；还包括样品裂解液、去蛋白液、漂洗液和70％无水乙醇、RNase free water、核酸吸附柱，其中样品裂解液组成为40-60mM pH7.4的Tris-HCL，3-6M的异硫氰酸胍，8-15mM EDTA；去蛋白液组成为20-40mM pH7.4的Tris-HCL，0.3-0.5M异硫氰酸胍和15-30％无水乙醇；漂洗液组成为20-40mM pH7.4的Tris-HCL，100-150mM NaCl和75％的无水乙醇。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年02月09日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年05月06日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件4的区别在于，（1）本申请以RT-LAMP-LFP法检测I型GCRV，对比文件4是以TaqMan Real-Time PCR法检测，两者采用的引物和探针序列不同。（2）本申请将GCRV的检测引物、探针以及其他LAMP反应所需溶液制备了试剂盒，对比文件4未公开。然而，对比文件1给出了以RT-LAMP技术检测GCRV更具优势的启示；LAMP的引物设计方法及其扩增原理是本领域技术人员的公知常识，例如公知常识证据1第161-165页；对比文件3公开了一种以RT-LAMP-LFD法检测罗氏沼虾野田村病毒的方法及其试剂盒，公开了LFD利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，减少了电泳环节、染料颜色的人为目测差异以及由非特异性扩增造成的假阳性问题，并公开了试剂盒的具体组成。在对比文件4、1、3的基础上结合常规技术手段经过有限的试验获得权利要求1的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备创造性。权利要求2-3的附加技术特征是在对比文件3公开的有效浓度范围内常规选择的一种，权利要求4的附加技术特征被对比文件1公开，因此权利要求2-4也不具备创造性。针对复审请求人的意见陈述进一步指出，（1）对比文件4提出以GCRVI型病毒的S6基因片段为靶分子，可特异性检测该病毒。虽然对比文件4的RT-PCR方法不同于本申请，但是对比文件1也是针对GCRV病毒检测的方法，由于其披露了RT-LAMP较之RT-PCR具有优势，故本领域技术人员以公知的RT-LAMP技术改进对比文件4的RT-PCR是容易想到的。（2）本申请说明书记载了“CN201210186709.6”采用的引物无法有效扩增基因I型GCRV,无法用于LFD试纸条检测。这是因为前述所指试剂盒的检测对象是III型GCRV，其不能对I型GCRV产生有效的扩增产物进而通过LFD检测到。这并不能表明仅有针对GCRV基因I型病毒设计的LAMP引物产生的扩增产物可以LFD试纸检测。相反，对比文件2指出，LFD检测相对于其他检测手段，有操作简便且安全的特点。该方法具有安全、快捷、高效、高灵敏度且对实验条件要求不高，适合应用推广（参见对比文件2说明书第5段）。也即现有技术并未给出何种靶分子的LAMP可与LFD技术相结合的限制。本领域技术人员根据对比文件4提供的以S6基因片段为检测靶标，采用常规技术手段设计LAMP引物和探针，进而用LFD技术检测是显而易见的。（3）本申请的引物和反应体系与对比文件3大部分相同，个别成分浓度是在对比文件3的范围内常规选择可以获得的，引物和探针的浓度也是经过有限实验例如正交实验根据实际效果可以确定的，并且没有超出常规使用范围。氯仿和β-巯基乙醇是核酸提取中常用的变性剂和还原剂，但不是必须使用的，对比文件3也公开了其病毒RNA提取方法简单快捷，而且不用氯仿、巯基乙醇等有害物质(参见对比文件3第0021段)。
复审请求人于2019年05月24日提交了意见陈述书，未修改申请文件。复审请求人认为：对比文件1并未给出检测所有GCRV病毒时RT-LAMP皆具有优势的技术启示，以RT-LAMP技术检测基因II型GCRV病毒的效果推断到I型GCRV病毒值得商榷；试剂盒引物的设计和反应体系条件的设置更非显而易见，本申请与对比文件3中检测的病毒并不相同，探针、Tris-HCI、氯化钾等组分的浓度也不同，既认为对比文件3提供了明确的技术教导，意味着不因所检测病毒不同而不同，又认为可以有限次实验调整各组分的浓度，这值得商榷。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审程序中，复审请求人于提出复审请求时提交了权利要求书全文替换页（共2页4项），经审查，所述修改符合专利法第33条以及专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审请求审查决定针对的文本为，2018年01月11日提交的权利要求第1-4项，申请日2014年12月29日提交的说明书摘要、说明书第1-6页（即第1-55段）、说明书附图第1-4页、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-2页。
专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果发明相对于最接近的现有技术存在区别技术特征，而现有技术给出了将区别技术特征应用于最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，这种启示会使本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术从而获得要求保护的发明，并且所获得的发明的技术效果没有超出合理预期的范围，则该发明不具备创造性。
具体到本申请，权利要求1请求保护基因I型草鱼呼肠孤病毒的检测试剂盒。对比文件4公开了在所有已分离的草鱼呼肠孤病毒（GCRV）中，S6节段推测编码的外衣壳蛋白是普遍存在的，是病毒重要的结构蛋白，具有相对保守性。根据目前已发表的GCRV序列分析得出，同一个基因型内结构蛋白的同源性较高，序列保守性强。对比文件4还公开了针对基因I型GCRV S6片段保守区域设计引物，建立TaqMan Real-Time PCR检测方法，证明该方法可特异性检测基因I型GCRV毒株（参见对比文件4第569-570，573页）。权利要求1与对比文件4的区别在于：（1）本申请以RT-LAMP-LFP法检测I型GCRV，对比文件4是以TaqMan Real-Time PCR法检测，两者采用的引物和探针序列不同。（2）本申请将GCRV的检测引物、探针以及其他LAMP反应所需溶液制备了试剂盒,对比文件1未公开。基于上述区别所带来的效果，本申请实际解决的技术问题是提供另一种I型GCRV的检测方法及其试剂盒。
然而，对比文件1公开了一种以RT-LAMP技术检测GCRV病毒HZO8亚型（即基因II型GCRV）的方法，其中具体披露了针对该病毒的第6基因片段（segment6）的保守区设计F3,B3,FIP,BIP,FLP,BLP扩增引物用于检测。对比文件1也公开了针对该区段设计RT-PCR检测引物进行的检测，并指出RT-LAMP较之RT-PCR的效果更好，其是RT-PCR检测灵敏度的10倍。尽管其灵敏度略低于real-time PCR，但是却具有简单、快速、方便观察结果的特点，因此更具优势（参见对比文件1摘要，第1548，1553页）。由此可知，对比文件1给出以RT-LAMP技术检测GCRV更具优势的启示，本领域技术人员容易想到以该方法改进对比文件4，针对I型GCRV的S6基因区设计LAMP扩增引物以及探针。至于LAMP的引物设计方法及其扩增原理是本领域技术人员的公知常识，例如公知常识证据1公开了LAMP法原理以及针对靶基因的4条引物设计方法，包括可通过PrimerExplore来设计引物，同时需要考虑引物之间的距离，引物的Tm值，引物的末端稳定性，GC含量，二级结构等因素（参见第163-164页）。因此，本领域技术人员容易结合上述LAMP引物设计原理和方法获得针对I型GCRV进行LAMP扩增的4条引物。进一步，对比文件3公开了一种以RT-LAMP-LFD法检测罗氏沼虾野田村病毒的方法及其试剂盒。其指出，LFD利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，减少了电泳环节、染料颜色的人为目测差异以及由非特异性扩增造成的假阳性问题。因此具有安全、快捷、高效、高灵敏度且无高实验要求的特点。该方法的检测试剂盒中包括RT- LAMP预反应液，16-21μL的RT- LAMP扩增反应液包括： 1.4-2.0mmol/L 引物MrNV-FIP，1.4-2.0mmol/L引物MrNV-BIP，0.2mmol/L 引物MrNV-F3，0.2mmol/L引物MrNV-B3，0.05-0.15μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，10-30mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl（包含了本申请15-25mM的范围），10-20mmol/L 氯化钾，10-20 mmol/L 硫酸铵，5-10mmol/L 硫酸镁，0.1-0.3% Triton X-100，0.4-0.8mol/L 甜菜碱，1.4-1.6mmol/L dNTP，1-2U逆转录酶AMV，6-10U Bst DNA 聚合酶大片段（其中下划线表示其数值范围落在本申请相应制剂的数值范围内、数值范围有交叉或有相同的端点值）。其中引物MrNV-FIP为5’端生物素标记引物，探针MrNV－FITC-PROBE为5’端FITC标记探针（参见对比文件3权利要求6，说明书第1页，第[0008]、[0013]、[0065]段），对比文件3还披露了试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品；以及在病毒RNA提取过程中使用裂解液裂解罗氏沼虾幼虾或成虾肌肉组织，将裂解后的混合物离心，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液转入带有玻璃纤维素膜的吸附柱中；再用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素，最后用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA。所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L 的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol/L EDTA，其余为RNase free water；所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL（包含了本申请的pH7.4），浓度为0.4-0.6mol/L异硫氰酸胍，以及体积浓度为10-30%的无水乙醇，其余为RNase free water。所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL（包含了本申请20-40ml、pH7.4的范围），50-150mmol/L NaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇（其中下划线表示其数值范围落在本申请相应制剂的数值范围内、数值范围有交叉或有相同的端点值），其余为RNase free water（参见对比文件3权利要求8，说明书第[0031]-[0039]段）。为获得LFD的前述优点，本领域技术人员有动机将LFD技术与前述LAMP的检测方法相结合，进而制备检测I型GCRV的试剂盒是显而易见的，可以基于对比文件3公开的LFD常规选择利用生物素标记LAMP扩增产物，以及用生物素标记FIP或是BIP，根据在对比文件3所公开范围内选择试剂浓度，本申请的引物和探针的浓度也是经过有限实验例如正交实验根据实际效果可以确定的，并且没有超出常规使用范围。综上所述，在对比文件4、1、3的基础上结合常规技术手段获得权利要求1的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2-4以权利要求1为引用基础，作了进一步限定。权利要求2、3所限定的特定浓度的试剂盒组分也仅是本领域技术人员在对比文件3公开的有效浓度范围内常规选择的一种，且并未产生预料不到的技术效果。权利要求4的附加技术特征被对比文件1公开，所以，在引用的权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2-4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对复审请求人相关意见的评述
对于复审请求人相关意见，合议组认为，对比文件1公开了 RT-LAMP技术在II型草鱼呼肠孤病毒的检测中的应用以及与RT-PCR的比较，事实上，LAMP技术简单、快速、特异、经济的优点已经为本领域公知，公知常识证据1（参见第161页倒数第1段）以及对比文件1也有公开（参见第1546页倒数第1-2段），而RT-LAMP能直接以RNA作为模板而不需要先合成cDNA再进行扩增，其合成cDNA和扩增是在同一时间，从而进一步省去了反转录步骤和改变温度所需的时间，并且将RT-LAMP技术应用于I型草鱼呼肠孤病毒的检测并不存在技术障碍，因此本领域技术人员以RT-LAMP技术改进对比文件4的RT-PCR是容易想到的。在已有的反应体系的基础上，针对不同的模板和引物对个别成分进行浓度调整是本领域常规采用的技术手段，获得技术教导和进行常规调整并不矛盾。综上所述，复审请求人的意见陈述不具有说服力。
基于上述事实和理由，作出如下复审决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017 年08月09日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
郑重声明：本文版权归原作者所有，转载文章仅为传播更多信息之目的，如作者信息标记有误，请第一时间联系我们修改或删除，多谢。
