发明创造名称：一株在低pH值下产丁二酸工程菌株及其发酵生产丁二酸的方法
外观设计名称：
决定号：187857
决定日：2019-08-21
委内编号：1F241855
优先权日：
申请（专利）号：201410442254.9
申请日：2014-09-02
复审请求人：南京工业大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：彭郁葱
合议组组长：安玉苹
参审员：王慧
国际分类号：C12N1/21，C12N15/70，C12P7/46，C12R1/19
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术存在区别技术特征，而现有技术给出了将上述区别技术特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，这种启示会使本领域的技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术从而获得要求保护的发明，并且所获得的发明的技术效果没有超出合理预期的范围，则该发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410442254.9，名称为“一株在低pH值下产丁二酸工程菌株及其发酵生产丁二酸的方法”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为南京工业大学。本申请的申请日为2014年09月02日，公开日为2014年12月24日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年09月14日以权利要求1-3不具备创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为: 2016年11月16日提交的权利要求第1-3项；2014年10月9日提交的说明书第1-51段；申请日2014年09月02日提交的说明书附图第1-4幅、说明书摘要、摘要附图。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种利用大肠埃希氏菌 BA601（Escherichia coli BA601）发酵生产丁二酸的方法，所述的大肠埃希氏菌BA601（Escherichia coli BA601）的保藏号编号为CCTCC NO：M2014210，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸；所述的厌氧阶段发酵培养基是维持在pH 5.6；有氧阶段发酵培养基维持在pH5.6。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于将大肠埃希氏菌BA601按1%(v/v)接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，有氧培养菌体至OD600=3时，按接种量10%转接至含有厌氧阶段发酵培养基的血清瓶中，充CO2两分钟，并在37℃，200 r/min厌氧发酵48 h。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于将大肠埃希氏菌BA601按10％的接种量将种子液接入装有1.5 L发酵培养基的3L发酵罐中，37℃有氧培养至菌体生长达到稳定期，37℃、200 r/min以0.5 L/min的速率持续通入CO2，进行厌氧发酵。”
驳回决定认为，权利要求1与对比文件1（CN103937733，公开日期为2014年07月23日）的区别特征在于，权利要求1的大肠埃希氏菌转入了表达谷氨酸脱羧酶和γ-氨基丁酸反向转运蛋白的基因，并调节发酵培养基为pH5.6，对比文件1使用的是非转基因大肠杆菌。对比文件2（大肠杆菌抗酸机制研究进展，丁秋露等，淮南师范学院学报，2008年，第5期，第10卷，第23-25页）给出了如果是pH>2.5的酸性培养条件时，可以过表达GadA或GadB单基因（谷氨酸脱羧酶基因）和编码GadC蛋白的γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因的方法，提高大肠杆菌的抗酸能力，使其在低pH下生长的启示，而提高抗酸能力的大肠杆菌的适宜生长pH是本领域技术人员可以通过常规试验确定的。因此，权利要求1不具备创造性。从属权利要求2-3的附加技术特征已被对比文件1公开，因此也不具备创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年12月29日向国家知识产权局提出了复审请求，没有修改申请文件。复审请求人认为：对比文件1没有公开大肠杆菌可以在酸性环境产丁二酸，其对大肠杆菌基因工程改造的方向与本申请不同。对比文件2公开了大肠杆菌耐酸的客观事实，而不是如何实现对大肠杆菌进行可产酸的耐酸改造。大肠杆菌本身耐酸和大肠杆菌在酸性条件下的产酸能力是有区别的，由于酸性条件会大大影响大肠杆菌发酵产酸的能力，尽管大肠杆菌本身可以耐酸，但现有技术的大肠杆菌一直是在中性条件下发酵产酸的。由于中性条件下发酵生产丁二酸导致大量的碱、酸的消耗，本领域技术人员确实有动机要实现产丁二酸大肠杆菌在酸性条件下产酸，但并不知道大肠杆菌在低pH下丁二酸的产量可以提高多少，如果只有少量提高，那么和中性条件的产量差相比，反而无法弥补为营造中性环境投入的酸碱物料带来的成本差，从而实际上没有进步性。本申请通过基因工程改造 菌株驯化时产生的随机突变，获得了相较于未驯化菌株BA600可在酸性条件下高产丁二酸的大肠杆菌菌株BA601，菌株自然筛选过程没有规律可循，因此本申请菌株BA601不是显而易见可获得的。而本申请获得的BA601菌株可以在低pH下生产丁二酸，并且采用BA601在本申请条件下生产丁二酸相较于常规中性条件下产丁二酸可减少15%的酸碱消耗，大大节约物料成本。因此，本申请具备创造性。此外，对比文件1的本质也是结合了出发菌株的随机筛选、基因改造、后续驯化得到新菌株的技术方案，且已经授权。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年02月06日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2018年12月27日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于,权利要求1中用于发酵的大肠埃希氏菌转入了耐酸基因，即谷氨酸脱羧酶基因（gadB）和γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因（gadC），并调节发酵培养基为pH5.6。对于上述区别技术特征，对比文件1中公开的大肠杆菌用于生产丁二酸过程中随着丁二酸产物的积累，培养基中酸性增强，对大肠杆菌的生长会造成影响。对比文件2公开了酸能够诱导gadA、gadB和 gadC基因的高表达从而提高细菌的抗酸能力，在EG培养基pH5.5培养时，gadA、gadB和 gadC的表达量明显比在pH7.0培养时的量要多，而且经pH5.5培养的细菌在经历pH2的低酸耐受后存活率也明显比经pH7.0培养的细菌的存活率要高，因此本领域技术人员容易想到为了增强其耐酸能力而在大肠杆菌中过表达gadA和/或gadB，同时过表达gadC，并在pH5.5左右的酸性环境中诱导上述耐酸基因的表达，从而获得能够耐酸的菌株，用于丁二酸的生产。因此权利要求1不具备创造性。从属权利要求2-3的附加技术特征已被对比文件1公开，因此也不具备创造性。
复审请求人于2019年02月11日提交了意见陈述书以及权利要求书全文替换页（共1页3项），与复审通知书针对的文本相比，其修改在于，在权利要求1中补充限定了发酵培养基的成分。复审请求人认为：（1）利用生物技术生产丁二酸的过程中，60-70%的成本是用在将最终发酵产生的丁二酸盐分离得到游离丁二酸的纯化阶段，为了降低生产成本，最可行的方法是发酵过程中不用或用少量的碱滴定中和而使游离丁二酸成为主要产物，但用于丁二酸生产的细菌都不能在低pH值条件下有效的生长并产丁二酸，对比文件1的菌株可利用蔗糖和糖蜜发酵生产丁二酸，但其产丁二酸仍是常规的中性条件，其培养基中添加了碱式碳酸镁固体。（2）大肠杆菌耐酸是其本身性质，对比文件2揭示的大肠杆菌耐酸系统确保了大肠杆菌在极酸性环境下生存，但并不代表其能在低pH条件下有效生长并产丁二酸。（3）BA600是在前期菌株构建中对不同质粒和启动子选择获得的高效表达菌株，本申请通过基因改造 菌株驯化时产生的随机突变，获得了可在酸性条件下获得较高产量的产丁二酸大肠杆菌菌株BA601，生产及产酸性能明显优于未驯化的工程菌BA600，这并不是简单结合并且能显而易见获知的技术效果的，因为菌株自然筛选的过程并没有客观规律可循。因此，本申请具备创造性。复审请求人新修改的权利要求1如下：
“1. 一种利用大肠埃希氏菌BA601(Escherichia coli BA601)发酵生产丁二酸的方法，所述的大肠埃希氏菌BA601(Escherichia coli BA601)的保藏号编号为CCTCC NO：M2014210，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸；
其特征在于，所述的厌氧阶段发酵培养基是维持在pH 5.6；有氧阶段发酵培养基维持在pH5.6；
厌氧阶段培养基成分为：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4g·L-1，KH2PO4 8g·L-1，(NH4)2HPO4 8g·L-1，NH4Cl 0.2g·L-1，(NH4)2SO4 0.75g·L-1，MgSO4·7H2O 1g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75mg·L-1，H3BO3 0.12mg·L-1，Al2(SO4)3 1.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，20.0mg L-1VB1,2.0mg L-1生物素，葡萄糖30～65g/L，碳酸钙0.5g/L，氨苄青霉素100μg/mL，氯霉素25μg/mL，卡那霉素30μg/mL。”
经审查，合议组于2019年07月03日再次发出复审意见通知书，指出，权利要求1与对比文件1相比，其区别技术特征在于：权利要求1的方法中用于发酵的大肠埃希氏菌中转入了表达耐酸基因，即谷氨酸脱羧酶基因（gadB）和γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因（gadC），发酵培养基为pH5.6，碳源为葡萄糖，并含碳酸钙0.5g/L。对比文件2公开了酸能够诱导gadA、gadB和 gadC基因的高表达从而提高细菌的抗酸能力，在EG培养基pH5.5培养时，gadA、gadB和 gadC的表达量明显比在pH7.0培养时的量要多，而且经pH5.5培养的细菌在经历pH2的低酸耐受后存活率也明显比经pH7.0培养的细菌的存活率要高。本领域技术人员容易想到为了增强其耐酸能力而在大肠杆菌中过表达gadA和/或gadB，同时过表达gadC，并在pH5.5左右的酸性环境中诱导上述耐酸基因的表达。对比文件1为了能利用蔗糖作为碳源而用蔗糖通透酶等转化亲本菌株，但同时也保留了利用葡萄糖的能力，本申请菌株未进行上述转化，因而仍能利用葡萄糖。此外，加入适量碳酸钙是本领域技术人员的常规选择。因此权利要求1不具备创造性。从属权利要求2-3的附加技术特征已被对比文件1公开，因此也不具备创造性。针对复审请求人的意见陈述进一步指出，（1）对比文件1实施例4的厌氧培养基添加了碱式碳酸镁从而使得pH值为中性，而实施例5的发酵培养基除了未添加碱式碳酸镁外，其余成分与实施例4的厌氧培养基相同，说明对比文件1的BA501菌株在不加碱式碳酸镁调节pH值的条件下也可以高效生产丁二酸。此外，本申请实施例5发酵罐培养时的发酵培养基中并不含碳酸钙，可见该培养基并未调节pH为5.6，但其也可高效产丁二酸，说明培养基是否调节pH为5.6并不影响丁二酸的生产。（2）根据对比文件1可知，本申请以及对比文件1的亲本菌株AFP111可以产生丁二酸，对比文件1在亲本菌株的基础上转化能够摄取并利用蔗糖的一系列酶基因后，经驯化而获得的BA501也能在不经碱式碳酸镁调节酸碱性的条件下生产丁二酸，因此，在没有相反证据的情况下，可以合理预期本申请在同样的亲本菌株AFP111的基础上转化了可以缓解因细胞外低pH导致细胞内pH降低的压力与损害的gadB和gadC基因，并在酸性环境下驯化获得的BA601菌株能在酸性条件下生产丁二酸。（3）首先，本申请说明书中并没有记载BA600构建中使用的质粒和启动子。其次，与随机诱变和随机筛选不同，菌种驯化一般是指通过人工措施使微生物逐步适应某一条件，而定向选育微生物的方法，其驯化结果有一定的方向性和趋势。对比文件2也公开了，在EG培养基pH5.5培养时，gadA、gadB和 gadC的表达量明显比在pH7.0培养时的量要多，而且经pH5.5培养的细菌在经历pH2的低酸耐受后存活率也明显比经pH7.0培养的细菌的存活率要高，可见，对比文件2公开了酸能够诱导这几个基因的表达，同时其高表达能够很好地提高细菌的抗酸能力。因此，结合菌种驯化的常识以及对比文件2的启示，本领域技术人员可以合理预期本申请经过转化和驯化的菌株能够在酸性条件下生产丁二酸，并能够从中选择出丁二酸产量和转化率相对较高的菌株。
复审请求人于2019年08月12日提交了意见陈述书，没有修改申请文件。复审请求人认为，在重组菌BA600的构建中利用了gadBC操纵子自身启动子，因而表达效果最佳。对比文件2并没有给出明确的菌株改造以及如何提高菌株在酸性条件下产酸能力的方法。在模式大肠杆菌中通过表达外源基因来改变其生长和代谢性就不一定成功，而出发菌株大肠杆菌AFP111是一种自发突变株，是非模式菌株，其遗传改造的难度更大。本申请通过基因改造 菌株驯化时产生的随机突变，获得了可在酸性条件下获得较高产量的产丁二酸大肠杆菌菌株BA601，生产及产酸性能明显优于未驯化的工程菌BA600，这并不是简单结合并且能显而易见获知的技术效果的，因为菌株自然筛选的过程并没有客观规律可循。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人于2019年02月11日提交了权利要求书全文替换页（共1页3项），经审查，所作修改符合专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审请求审查决定针对的文本为：2019年02月11日提交的权利要求第1-3项，2014年10月09日提交的说明书第1-51段；申请日2014年09月02日提交的说明书附图第1-4幅、说明书摘要、摘要附图。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术存在区别技术特征，而现有技术给出了将上述区别技术特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，这种启示会使本领域的技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术从而获得要求保护的发明，并且所获得的发明的技术效果没有超出合理预期的范围，则该发明不具备创造性。
权利要求1请求保护“一种利用大肠埃希氏菌BA601(Escherichia coli BA601)发酵生产丁二酸的方法，所述的大肠埃希氏菌BA601(Escherichia coli BA601)的保藏号编号为CCTCC NO：M2014210，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸；其特征在于，所述的厌氧阶段发酵培养基是维持在pH5.6；有氧阶段发酵培养基维持在pH5.6；厌氧阶段培养基成分为：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4g·L-1，KH2PO4 8g·L-1，(NH4)2HPO4 8g·L-1，NH4Cl 0.2g·L-1，(NH4)2SO4 0.75g·L-1，MgSO4·7H2O 1g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75mg·L-1，H3BO3 0.12mg·L-1，Al2(SO4)3 1.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，20.0mg L-1VB1,2.0mg L-1生物素，葡萄糖30～65g/L，碳酸钙0.5g/L，氨苄青霉素100μg/mL，氯霉素25μg/mL，卡那霉素30μg/mL。”
对比文件1公开了一种利用基因工程大肠埃希氏菌发酵生产丁二酸的方法，并具体公开了大肠杆菌菌株AFP111在厌氧条件下能够利用葡萄糖，且主要产物为丁二酸，有氧厌氧两阶段发酵培养，丁二酸质量收率达到96%，生产强度为1.21g·L-1·h-1，进一步以AFP111为出发菌株，表达外源蔗糖通透酶等基因后，经连续驯化得到能够高效利用蔗糖和蜜二糖并产丁二酸的菌株BA501，并利用BA501发酵生产丁二酸，所述发酵方法采用两段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸，具体方法如下：将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA501按10％的接种量将种子液接入装有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，培养基中含有30g/L的蔗糖。37℃有氧培养至培养基中的残糖小于0.5g/L，37℃、200r/min以0.5L/min的速率持续通入CO2，进行厌氧发酵。种子培养基：LB(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L) Amp(氨苄青霉素100μg/mL) Chl(氯霉素25μg/mL) Kar(卡那霉素30μg/mL)。发酵培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4g·L-1，KH2PO4 8g·L-1，(NH4)2HPO4 8g·L-1，NH4Cl 0.2g·L-1，(NH4)2SO4 0.75g·L-1，MgSO4·7H2O 1g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75mg·L-1，H3BO3 0.12mg·L-1，Al2(SO4)3 1.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，20.0mg·L-1,VB 2.0mg·L-1生物素 蔗糖(60g/L) Amp(氨苄青霉素100μg/mL) Chl(氯霉素25μg/mL) Kar(卡那霉素30μg/mL)。发酵培养36h后检测到丁二酸的产量为51g/L，丁二酸转化率为87％（参见对比文件1说明书第4、19、24段，实施例5）。可见，对比文件1公开了对AFP111进行基因工程改造后连续驯化获得期望的菌株以及利用所述菌株在特定底物条件下经有氧厌氧两阶段发酵培养产丁二酸的方法。
权利要求1与对比文件1相比，其区别技术特征在于：权利要求1的方法用于发酵的大肠埃希氏菌中转入了耐酸基因，即谷氨酸脱羧酶基因（gadB）和γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因（gadC），发酵培养基为pH5.6，碳源为葡萄糖，并含碳酸钙0.5g/L。基于上述区别技术特征可以确定，权利要求1实际解决的技术问题是提供另一种生产丁二酸的方法。
对于上述区别技术特征，对比文件2公开了大肠杆菌具有很强的抗酸能力，谷氨酸依赖型抗酸系统是大肠杆菌最有效的抗酸系统，其中谷氨酸脱羧酶基因（gadA和gadB）和谷氨酸γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因（gadC）共同作用缓解因细胞外低pH导致细胞内pH降低的压力与损害，并且当pH >2.5时，gadA、gadB的单基因缺失对细菌的存活率影响不大。分析发现，在EG培养基pH5.5培养时，gadA、gadB和 gadC的表达量明显比在pH7.0培养时的量要多，而且经pH5.5培养的细菌在经历pH2的低酸耐受后存活率也明显比经pH7.0培养的细菌的存活率要高。可见，酸能够诱导这几个基因的表达，所述基因的高表达能够很好地提高细菌的抗酸能力（参见对比文件2摘要、第24页左栏1.4.1）。
然而，在对比文件1公开的对大肠杆菌AFP111进行基因工程改造后连续驯化获得期望的菌株以及利用所述菌株在特定底物条件下经有氧厌氧两阶段发酵培养产丁二酸的方法的基础上，本领域技术人员知晓，随着菌株生产丁二酸，丁二酸的积累会造成环境酸性增强，从而对菌株的存活或功能带来影响，因此，本领域技术人员有动机提高菌株的抗酸能力。结合对比文件2给出的启示，本领域技术人员容易想到为了增强其耐酸能力而在大肠杆菌AFP111中过表达gadA和/或gadB，同时过表达gadC，在pH5.5左右的酸性环境中驯化诱导上述耐酸基因的表达，从而经驯化获得能够耐酸的菌株，并结合对比文件1的启示将其在与驯化诱导相近的pH值下用于丁二酸的生产。对于碳源，葡萄糖是多数大肠杆菌的常规碳源，对比文件1以及本申请的亲本菌株 AFP111具有利用葡萄糖的能力，对比文件1为了能利用蔗糖作为碳源而用蔗糖通透酶等转化亲本菌株，但同时也保留了利用葡萄糖的能力（参见对比文件1第24段以及图1），本申请未进行上述转化，因而仍利用葡萄糖作为碳源是显而易见的。此外，碳酸钙对培养液的pH有一定的调节作用，培养基中加入适量碳酸钙是本领域技术人员的常规选择。
因此，在对比文件1的基础上，结合对比文件2和本领域常规技术手段，本领域技术人员得到权利要求1的技术方案是显而易见的，并且这种结合的效果也没有超出本领域技术人员的合理预期。因此，权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2为权利要求1的从属权利要求，其对接种量，培养条件步骤做了进一步限定，然而，对比文件1公开了将大肠埃希氏菌BA501“按1% (v/v）接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，有氧培养菌体至OD600=3时，按接种量10%转接至含有厌氧阶段发酵培养基的血清瓶中，充CO2两分钟，并在37℃，200r/min厌氧发酵48小时”（参见对比文件1说明书第21段），对比文件1的大肠埃希氏菌BA501与本申请的大肠埃希氏菌BA601都是以大肠杆菌AFP111为出发菌株获得的工程菌株，因而本领域技术人员有动机将所述培养条件应用到本申请BA601菌株的发酵培养方法中，因此，当其引用的权利要求1不具备创造性时，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求3为权利要求1的从属权利要求，其对接种量，发酵条件步骤做了进一步限定，然而对比文件1公开了将大肠埃希氏菌BA501“按10%的接种量将种子液接入装有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，37℃有氧培养至菌体生长达到稳定期，37℃、200r/min以0.5L/min的速率持续通入CO2，进行厌氧发酵”（参见对比文件1说明书第22段），结合权利要求2的评价可知，本领域技术人员有动机将所述发酵条件步骤应用到本申请BA601菌株的发酵培养方法中，因此，当其引用的权利要求1不具备创造性时，权利要求3也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、对复审请求人相关意见的评述
合议组认为，首先，基因自身的启动子更有利于基因的表达属于本领域公知常识，因此，在对比文件2公开了酸能够诱导gadA、gadB、gadC基因的高表达从而提高细菌的抗酸能力的基础上，本领域技术人员容易想到为了增强其耐酸能力而在大肠杆菌中过表达gadA和/或gadB，同时过表达gadC，并且为了利于基因表达而常规使用gadBC操纵子自身启动子。其次，对于出发菌株AF111，本申请说明书第[0004]段记载，“E. coli NZN111由于同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶，NADH不能及时再生为NAD ，引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡（NADH/NAD 比例超过2），最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖。其自发突变株E. coli AFP111由于突变了葡萄糖专性转运系统中的ptsG基因，降低了在EMP途径中NADH的产生速率，恢复了NAD(H)平衡，使得菌株在厌氧条件下能够利用葡萄糖，且产物主要为丁二酸，在有氧厌氧两阶段发酵培养AFP111过程中，丁二酸质量收率达到96%，生产强度为1.21 g L-1?h-1”。可见AFP111也是遗传背景明确的大肠杆菌，在对比文件2的启示下本领域技术人员有动机将gadA和/或gadB，以及gadC基因转化该菌株，可以使用常规的大肠杆菌载体并根据需要的特性进行定向选择，并且对其转化成功有一定的合理预期。再有，与随机诱变和随机筛选不同，菌种驯化一般是指通过人工措施使微生物逐步适应某一条件，而定向选育微生物的方法，其驯化结果有一定的方向性和趋势。对比文件2也公开了，在EG培养基pH5.5培养时，gadA、gadB和 gadC的表达量明显比在pH7.0培养时的量要多，而且经pH5.5培养的细菌在经历pH2的低酸耐受后存活率也明显比经pH7.0培养的细菌的存活率要高，可见，对比文件2公开了酸能够诱导这几个基因的表达，同时其高表达能够很好地提高细菌的抗酸能力。因此，结合菌种驯化的常识以及对比文件2的启示，本领域技术人员可以合理预期本申请经过转化和驯化的菌株能够在酸性条件下生产丁二酸，并能够从中选择出丁二酸产量和转化率相对较高的菌株。综上所述，复审请求人的意见陈述不具有说服力。
基于上述事实和理由，合议组作出如下复审决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年09月14日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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