发明创造名称：位点特异性核酸酶活性的DNA检测方法
外观设计名称：
决定号：187851
决定日：2019-08-21
委内编号：1F242339
优先权日：2012-12-13
申请（专利）号：201380072819.2
申请日：2013-12-13
复审请求人：美国陶氏益农公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：张颖
合议组组长：陈莹
参审员：王瑶
国际分类号：C40B40/08，C12N5/00，C12N5/02
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在发明请求保护的技术方案与最接近的现有技术存在区别技术特征的情况下，如果现有技术整体上没有给出将区别技术特征应用于该最接近的现有技术以解决发明实际解决的技术问题的启示，也没有证据显示该区别技术特征属于公知常识时，不宜直接认定该发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380072819.2，名称为“位点特异性核酸酶活性的DNA检测方法”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为美国陶氏益农公司。本申请的申请日为2013年12月13日，优先权日为2012年12月13日，公开日为2015年11月18日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年09月19日以权利要求1-45不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：2015年08月12日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书第1-65页（第1-284段）、说明书附图第1-13页、说明书摘要；2017年06月27日提交的权利要求第1-45项。驳回决定所针对的独立权利要求如下：
“1. 一种用于在通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定所产生的植物事件中鉴定插入在被靶定的基因组座位内的外源供体DNA多核苷酸之存在的方法，包括：
a.在第一扩增反应中使用第一群寡核苷酸来扩增包含被靶定的植物基因组座位的基因组DNA样品，该群寡核苷酸在杂交条件下结合于该被靶定的基因组座位的近邻，藉此产生包含该被靶定的基因组座位的第一扩增子；
b.检测所述第一扩增子的存在或不存在，其中不存在该第一扩增子表明在该被靶定的基因组座位内存在所述供体DNA多核苷酸；
c.在第二扩增反应中使用第二群寡核苷酸来扩增所述基因组DNA样品，该群寡核苷酸在杂交条件下结合于所述被靶定的基因组座位的近邻和所述供体DNA多核苷酸的内部，藉此产生包含所述被靶定的基因组座位的至少一部分及所述供体DNA多核苷酸的至少一部分的第二扩增子；和
d.检测所述第二扩增子的存在或不存在，其中存在该第二扩增子表明在所述被靶定的基因组座位内存在所述供体DNA多核苷酸。
21. 一种用于鉴定通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定导致的植物基因组座位的破坏的方法，包括：
a.在第一扩增反应中使用多个寡核苷酸来扩增包含该被破坏的基因组座位的基因组DNA样品，所述多个寡核苷酸在杂交条件下结合于所述被破坏的基因组座位的近邻，藉此产生包含该被破坏的基因组座位的第一扩增子；和
b.检测该第一扩增子的存在或不存在，其中不存在该扩增子指示基因组 座位的破坏。
30. 一种用于从多个植物细胞中鉴定通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定导致的基因组座位的破坏的方法，包括：
a.在第一扩增反应中使用多个寡核苷酸来扩增包含该被破坏的基因组座位的基因组DNA样品，所述多个寡核苷酸在杂交条件下结合于被破坏的基因组座位的近邻，藉此产生包含该被破坏的基因组座位的第一扩增子；
b.对所述第一扩增反应的结果定量；
c.在第二扩增反应中使用多个寡核苷酸来扩增包含该被破坏的基因组座位的基因组DNA样品，所述多个寡核苷酸在杂交条件下结合于该被破坏的基因组座位的近邻，藉此产生包含该被破坏的基因组座位的第二扩增子；
d.对所述第二扩增反应的结果定量；和
e.比较所述第一和第二扩增反应的量，其中该第一扩增反应的量与该第二扩增反应相比含有较低量的扩增产物，从而表明该第一扩增子样品中的基因组座位的破坏。 ”
驳回决定指出：①对比文件1（CN102816783A，公开时间2012年12月12日；参见说明书第1页第10段、第2页第15段、第9页第67－69段、第10页第72段、第17页第104段-第18页第111段以及附图1-2）公开了一种刺糖多孢菌基因组中的中性位点的鉴定和验证方法，权利要求1与对比文件1的区别在于：1）其中不存在该第一扩增子表明在该被靶定的基因组座位内存在所述供体DNA多核苷酸以及存在该第二扩增子表明在该被靶定的基因组座位内存在所述供体DNA多核苷酸；2）通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定所产生的植物事件中鉴定插入在被靶定的基因组座位内的外源供体DNA多核苷酸之存在。基于上述区别技术特征可以确定，本申请所要解决的实际技术问题是提供一种用于在通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定所产生的植物事件中鉴定插入在被靶定的基因组座位内的外源供体DNA多核苷酸之存在的方法。然而区别1）是本领域技术人员根据所述鉴定多核苷酸的方法很容易确定的，属于本领域公知常识，没有产生预料不到的技术效果。针对区别2），在从细胞中提取的DNA水平上进行检测，实质上各种对象（来源）已经不构成技术障碍，至少这样的对象区别没有构成突出的实质性特点，无法带来显著的进步。因此，权利要求1不具备创造性。②基于与权利要求1不具备创造性类似的理由，权利要求21、30也不具备创造性。③权利要求2的附加技术特征已被对比文件1所公开，权利要求3-20、22-29、31-45所作限定均为本领域常规选择或者常规技术手段，均没有产生预料不到的技术效果。因此，权利要求2-20、22-29、31-45也不具备创造性。
申请人美国陶氏益农公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年01月04日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。复审请求人在意见陈述中认为：①修改后的权利要求1、27构成了从未告知过请求人的驳回理由的新事实，没有给予请求人第二次陈述意见和/或修改的机会，对公知常识等没有举证和说理，违背了听证原则。②驳回没有援引任何“不能产生扩增子的PCR反应指示植物基因组中的位点特异性整合”的实例。对比文件1教导了进行PCR扩增反应，产生扩增子以推断基因整合的存在，对比文件1中PCR扩增子总是会产生的。与之相反，本申请教导了进行不产生扩增子的PCR扩增反应以推断基因整合的存在。请求人认为，本申请技术方案中扩增子可能产生，也可能不产生，这与对比文件1中通过产生扩增子来判断DNA片段中是否存在多态性是不一样的。围绕着检测植物基因组内位点特异性整合有许多相对较新的技术问题，因为位点特异性核酸酶技术仅在最近(过去约10年内)才被有限数量的研究人员用于植物，不属于“公知常识”。因此本申请具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年01月22日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：①针对权利要求1的主题名称，在从细胞中提取的DNA水平上进行检测，实质上各种对象（来源）已经不构成技术障碍，至少这样的对象区别没有构成突出的实质性特点，无法带来显著的进步。所述修改对权利要求1所保护的方法没有实质性限定。②根据对比文件1的启示，本领域技术人员很容易根据检测所述第一扩增子的存在或不存在来判定插入序列的存在与否，另外，其中不存在该第一扩增子表明在该被靶定的基因组座位内存在所述供体DNA多核苷酸以及存在该第二扩增子表明在该被靶定的基因组座位内存在所述供体DNA多核苷酸也是本领域技术人员常规使用的判断方法，没有产生预料不到的技术效果，不需要付出创造性劳动。因而坚持原驳回决定。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在提出复审请求时未对申请文件进行修改，本复审请求审查决定与驳回决定针对的审查文本相同，即：2015年08月12日本申请进入国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书第1-65页（第1-284段）、说明书附图第1-13页、说明书摘要；2017年06月27日提交的权利要求第1-45项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，在发明请求保护的技术方案与最接近的现有技术存在区别技术特征的情况下，如果现有技术整体上没有给出将区别技术特征应用于该最接近的现有技术以解决发明实际解决的技术问题的启示，也没有证据显示该区别技术特征属于公知常识时，不宜直接认定该发明不具备创造性。
具体到本案，权利要求1请求保护：一种用于在通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定所产生的植物事件中鉴定插入在被靶定的基因组座位内的外源供体DNA多核苷酸之存在的方法，包括： a.在第一扩增反应中使用第一群寡核苷酸来扩增包含被靶定的植物基因组座位的基因组DNA样品，该群寡核苷酸在杂交条件下结合于该被靶定的基因组座位的近邻，藉此产生包含该被靶定的基因组座位的第一扩增子； b.检测所述第一扩增子的存在或不存在，其中不存在该第一扩增子表明在该被靶定的基因组座位内存在所述供体DNA多核苷酸； c.在第二扩增反应中使用第二群寡核苷酸来扩增所述基因组DNA样品，该群寡核苷酸在杂交条件下结合于所述被靶定的基因组座位的近邻和所述供体DNA多核苷酸的内部，藉此产生包含所述被靶定的基因组座位的至少一部分及所述供体DNA多核苷酸的至少一部分的第二扩增子；和 d.检测所述第二扩增子的存在或不存在，其中存在该第二扩增子表明在所述被靶定的基因组座位内存在所述供体DNA多核苷酸。
对比文件1（参见摘要，说明书第0101-0115段实施例）公开了：获得粘粒克隆1E3，其在DNA插入物的中部含有obsA的5′端；为了破坏刺糖多孢菌基因组遮蔽蛋白基因簇中的obsA，将阿泊拉霉素抗性破坏表达盒(FRT-aac3(IV)-oriT-FRT)整合到粘粒克隆1E3中，获得重组粘粒；经由使用一对分别退火至obsA的起始密码子上游的95bp DNA区和obsA起始密码子下游的334bp DNA区的引物扩增来对重组克隆确认，重组粘粒产生了对应于预期大小1,538bp的单一片段（该片段是由于在obsA的5′端 插入了1,322bp的破坏表达盒，同时从obsA基因缺失了213bp），没有产生见于对照粘粒克隆1E3的429bp片段，表明重组粘粒克隆都在obsA的5′端含有破坏表达盒(FRT-aac3(IV)-oriT-FRT)；将携带obsA破坏表达盒(FRT-aac3(IV)-oriT-FRT)的重组粘粒引入刺糖多孢菌菌株，产生转化接合子（即重组菌）；转化接合子PCR扩增，证实存在785bp大小的aac3(IV)片段，不含破坏表达盒(FRT-aac3(IV)-oriT-FRT)的阴性对照不产生 PCR扩增子，且抗生素抗性实验表明，转化接合子均携带经由同源重组整合入遮蔽蛋白聚酮合成酶基因簇的阿泊拉霉素抗性基因aac3(IV)。
由此可见，对比文件1公开了一种鉴定重组菌中基因重组是否发生的方法，该重组菌的内源基因obsA的特定位置和片段（相当于基因组座位）被外源基因破坏表达盒(FRT-aac3(IV)-oriT-FRT)（相当于供体DNA）替换，在鉴定基因重组是否成功时，使用了引物（相当于群寡核苷酸）对转化接合子扩增（相当于使用群寡核苷酸来扩增基因组DNA样品），该引物扩增的区域为外源基因的特定片段aac3(IV)片段（相当于群寡核苷酸杂交于供体DNA的内部，产生供体DNA多核苷酸的至少一部分的扩增子），成功转入外源基因的重组菌存在扩增产物，而阴性对照不产生（相当于检测扩增子的存在或不存在，存在扩增子表明在靶定的基因组座位内存在供体DNA多核苷酸），基于上述事实和分析，本领域技术人员可以判断出，对比文件1公开了鉴定插入在被靶定的基因组座位内的外源供体DNA多核苷酸之存在的方法，且对比文件1公开的上述内容相当于本申请权利要求1的第二扩增反应步骤。
因此，权利要求1与对比文件1上述公开内容的区别在于：权利要求1与对比文件1针对的对象不同，对比文件1为同源重组菌，而权利要求1为通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定所产生的植物事件，并且权利要求1限定了第一扩增反应（即权利要求1的步骤a和b），且权利要求1的第二扩增反应与对比文件1的方法在扩增子设计上存在差别，权利要求1为群寡核苷酸在杂交条件下结合于所述被靶定的基因组座位的近邻和所述供体DNA多核苷酸的内部，藉此产生包含所述被靶定的基因组座位的至少一部分及所述供体DNA多核苷酸的至少一部分的第二扩增子（即扩增子含内源和供体基因），而对比文件1扩增子仅含供体基因。基于上述区别，权利要求1实际解决的技术问题是提供一种针对特异性核酸酶介导的转基因植物事件的鉴定外源供体DNA多核苷酸之存在的方法。
对此，驳回决定和前置审查意见认为：对比文件1公开了本申请限定的第一和第二步扩增，且针对不同对象，在从细胞中提取的DNA水平上进行检测，实质上各种对象（来源）已经不构成技术障碍，至少这样的对象区别没有构成突出的实质性特点，无法带来显著的进步。权利要求1限定的第一扩增反应基于无扩增子判断是本领域技术人员根据所述鉴定多核苷酸的方法很容易确定的，属于本领域公知常识，没有产生预料不到的技术效果。
对此，合议组认为：第一，通过整体阅读对比文件1可知，驳回决定引证的对比文件1说明书内容（说明书第0072、0067、0069和0070段）仅是对可采用的PCR及其检测技术的描述，与对比文件1实施例不属于一个技术方案，无法认可对比文件1公开了一个含有两次扩增的方法，对比文件1说明书公开的上述内容也不涉及类似本申请第一次扩增以鉴定DNA破坏的相关内容。第二，本申请与对比文件1所针对对象的不同并不仅仅体现在从细胞中提取DNA进行检测方面，更在于需要针对不同的对象选择不同的基因靶定重组技术，因为本领域技术人员知晓刺糖多孢菌是一种菌，系原核生物，其基因组大小和复杂程度与真核生物的植物相去甚远，并且植物基因组DNA的修饰、突变/重组和修复机制更为复杂，因而，对比文件1公开的用于菌基因重组的接合技术并不适用于植物的基因重组，本领域技术人员需要从已有的基因重组技术中选择适合于植物的技术，且基于对真核细胞适用的位点特异性核酸酶介导的基因打靶技术的普遍认知，由于该技术依赖于对特定DNA位点的切割或破坏，因而存在靶定植物内的基因组座位效率相对较低的问题，由此可知当基因重组的对象替换成植物时，本领域技术人员需要面临如何从大量的非靶向事件的背景中高效地鉴定出成功靶向的事件这一问题，但在对比文件1（参见实施例）的刺糖多孢菌基因重组实验中，几乎所有重组接合子均显示了期望的阿泊拉霉素抗性，PCR扩增也显示了存在整合入该菌基因中的预期的外源基因，由此可见，对比文件1公开的刺糖多孢菌的基因重组效率是非常高的，因而，对比文件1并不存在上述从大量非靶向事件中高效、准确地检测靶向事件这一技术问题，而这正是本申请所要解决的技术问题。并且，结合上文所述，在对比文件1仅通过一次PCR扩增就能解决鉴定外源供体DNA多核苷酸存在与否的基础上，本领域技术人员没有动机再额外增加一次扩增（即第一次扩增反应），更何况是如权利要求1限定的根据不存在包含被靶定的基因组座位的扩增子来确定在该被靶定的基因组座位内存在所述供体DNA多核苷酸的扩增。并且，基于目前的证据，也无法认为通过第一扩增反应以及无扩增子来判断被靶定的基因组座位内存在所述供体DNA多核苷酸的手段属于公知常识。另外，本申请实施例1-5也证实了采用第一次和第二次扩增反应能有效鉴定出经特定核酸酶介导的转基因植物以及植物基因组破坏情况。因此，基于目前的证据，驳回决定和前置审查意见中关于权利要求1不具备创造性的理由不成立。
权利要求21请求保护：一种用于鉴定通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定导致的植物基因组座位的破坏的方法，包括： a.在第一扩增反应中使用多个寡核苷酸来扩增包含该被破坏的基因组座位的基因组DNA样品，所述多个寡核苷酸在杂交条件下结合于所述被破坏的基因组座位的近邻，藉此产生包含该被破坏的基因组座位的第一扩增子；和 b.检测该第一扩增子的存在或不存在，其中不存在该扩增子指示基因组座位的破坏。
权利要求30请求保护：一种用于从多个植物细胞中鉴定通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定导致的基因组座位的破坏的方法，包括：a.在第一扩增反应中使用多个寡核苷酸来扩增包含该被破坏的基因组座位的基因组DNA样品，所述多个寡核苷酸在杂交条件下结合于被破坏的基因组座位的近邻，藉此产生包含该被破坏的基因组座位的第一扩增子；b.对所述第一扩增反应的结果定量；c.在第二扩增反应中使用多个寡核苷酸来扩增包含该被破坏的基因组座位的基因组DNA样品，所述多个寡核苷酸在杂交条件下结合于该被破坏的基因组座位的近邻，藉此产生包含该被破坏的基因组座位的第二扩增子；d.对所述第二扩增反应的结果定量；和 e.比较所述第一和第二扩增反应的量，其中该第一扩增反应的量与该第二扩增反应相比含有较低量的扩增产物，从而表明该第一扩增子样品中的基因组座位的破坏。
对比文件1（参见摘要，说明书第0101-0115段实施例）公开的内容，参见上文对权利要求1的评述。
权利要求21与对比文件1上述公开内容的区别在于：权利要求21涉及用于鉴定通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定导致的植物基因组座位的破坏的方法，且如步骤a和b所示，基于不存在该扩增子指示基因组座位的破坏，而对比文件1针对的是菌，且不涉及对基因组破坏的鉴定以及类似的基于不存在扩增子鉴定的方法。基于上述区别，权利要求21实际解决的技术问题是提供用于鉴定通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定导致的植物基因组座位的破坏的方法。
权利要求30与对比文件1上述公开内容的区别在于：权利要求30涉及用于从多个植物细胞中鉴定通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定导致的基因组座位的破坏的方法，且如步骤a至e所示，基于两步扩增反应、定量、比较以指示基因组座位的破坏，而对比文件1针对的是菌，且不涉及对基因组破坏的鉴定以及类似的基于两步扩增来鉴定的方法。基于上述区别，权利要求30实际解决的技术问题是提供从多个植物细胞中鉴定通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定导致的基因组座位的破坏的方法。
对此，驳回决定和前置审查意见认为：对比文件1公开了与本申请类似的鉴定基因组破坏的扩增方法，且针对不同对象，在从细胞中提取的DNA水平上进行检测，实质上各种对象（来源）已经不构成技术障碍，至少这样的对象区别没有构成突出的实质性特点，无法带来显著的进步。权利要求21、30限定的不存在该第一扩增子表明在该被靶定的基因组座位内存在所述供体DNA多核苷酸、利用两次扩增量的比较表明该第一扩增子样品中的基因组座位的破坏是本领域技术人员根据所述鉴定多核苷酸的方法很容易确定的，属于本领域公知常识，没有产生预料不到的技术效果。
基于上述事实，合议组认为，第一，通过整体阅读对比文件1可知，驳回决定引证的对比文件1说明书内容（说明书第0072、0067、0069和0070段）仅是对可采用的PCR及其检测技术的描述，与对比文件1实施例不属于一个技术方案，无法认可对比文件1公开了涉及类似本申请的鉴定DNA破坏相关的内容。第二，本申请与对比文件1所针对对象的不同并不仅仅体现在从细胞中提取DNA进行检测方面，更在于需要针对不同的对象选择不同的基因靶定重组技术，因为本领域技术人员知晓刺糖多孢菌是一种菌，系原核生物，其基因组大小和复杂程度与真核生物的植物相去甚远，并且植物基因组DNA的修饰、突变/重组和修复机制更为复杂，因而，对比文件1公开的用于菌基因重组的接合技术并不适用于植物的基因重组，本领域技术人员需要从已有的基因重组技术中选择适合于植物的技术，且基于对真核细胞适用的位点特异性核酸酶介导的基因打靶技术的普遍认知，由于该技术依赖于对特定DNA位点的切割或破坏，因而存在靶定植物内的基因组座位效率相对较低的问题，由此可知当基因重组的对象替换成植物时，本领域技术人员需要面临鉴定通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定导致的植物基因组座位的破坏效率这一问题，但在对比文件1（参见实施例）的刺糖多孢菌基因重组实验中，几乎所有重组接合子均显示了期望的阿泊拉霉素抗性，PCR扩增也显示了存在整合入该菌基因中的预期的外源基因，由此可见，对比文件1基于刺糖多孢菌的基因重组效率以及相应的菌基因组的破坏程度是非常高的，因而，对比文件1并不存在上述从大量非靶向事件中高效、准确地检测靶向事件以及鉴定通过位点特异性核酸酶介导的基因靶定导致的植物基因组座位的破坏效率的技术问题，而这正是本申请所要解决的技术问题。因此，结合上文所述，在对比文件1仅通过一次PCR扩增就能解决鉴定外源供体DNA多核苷酸存在与否的基础上，并且鉴于对比文件1采用的菌重组技术与本申请的位点特异性核酸酶打靶技术存在实质性的区别时，本领域技术人员无法从对比文件1获得单独研究DNA断裂或破坏、以及如本申请权利要求21或30一样依据不存在的扩增子判断结果或基于两次扩增以及定量来判断结果的启示和动机。并且，基于目前的证据，也无法认为本申请权利要求21或30属于公知常识。另外，本申请实施例1-5也证实了采用第一次和第二次扩增反应能有效鉴定出经特定核酸酶介导的转基因植物以及植物基因组破坏情况。因此，基于目前的证据，驳回决定和前置审查意见中指出的关于权利要求21和30不具备创造性的理由不成立。
基于同样的理由，驳回决定和前置审查意见中指出的关于权利要求2-20、22-29、31-45不具备创造性的理由不成立。
根据以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2017年09月19日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审决定的基础上对本申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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