发明创造名称：位于大豆第3号染色体上的耐盐性调控基因qNaCl3及其使用方法
外观设计名称：
决定号：187952
决定日：2019-08-20
委内编号：1F243011
优先权日：2014-02-17
申请（专利）号：201580009062.1
申请日：2015-02-16
复审请求人：国立研究开发法人国际农林水产业研究中心
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：罗霄
合议组组长：田园
参审员：徐益君
国际分类号：C12N15/09，A01H5/00
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：判断一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中存在这种启示，并且所获得的发明的技术效果是可以预料的，则该发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201580009062.1，名称为“位于大豆第3号染色体上的耐盐性调控基因qNaCl3及其使用方法”的发明专利申请。申请人为国立研究开发法人国际农林水产业研究中心。本申请的申请日为2015年02月16日，优先权日为2014年02月17日，公开日为2016年10月12日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年11月03日发出驳回决定，以权利要求1-6不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为：2016年08月17日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文文本的说明书第1-18页（即第1-133段）、说明书附图第1-17页（即图1-图12）、说明书摘要和说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-32页；以及2017年05月24日提交的权利要求第1-6项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 通过将选自下述(1)和(2)基因的基因导入不具有耐盐胁迫的植物而使该植物的耐盐胁迫提高的方法：
(1) 基因，该基因由下述(a)～(f)中的任一种DNA组成：
(a) 由SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列组成的DNA；
(b) 在严格条件下和由与由SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列组成的DNA互补的核苷酸序列组成的DNA杂交、并且编码具有Na /H 反向转运蛋白活性的蛋白的DNA；
(c) 由与SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列具有90%以上的序列同源性的核苷酸序列组成、并且编码具有Na /H 反向转运蛋白活性的蛋白的DNA；
(d) 由SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的缩聚异构体组成的DNA；
(e) 编码由SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列组成的蛋白的DNA；以及
(f) 作为由对SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列有1个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加了的氨基酸序列组成的蛋白、并且编码具有Na /H 反向转运蛋白活性的蛋白的DNA，
(2) (1)的基因，该基因是调控植物的耐盐胁迫、且编码具有Na /H 反向转运蛋白活性的蛋白的qNaCl3基因。
2. 权利要求1所述的使植物的耐盐胁迫提高的方法，其中，植物为双子叶植物。
3. 权利要求1所述的使植物的耐盐胁迫提高的方法，其中，植物为大豆。
4. 培育具有耐盐性的大豆的方法，该方法包括：以作为位于具有SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的qNaCl3基因内或其附近的DNA标志物、且成为qNaCl3基因的存在标记的DNA标志物的存在为指标，筛选具有耐盐性的大豆。
5. 权利要求4所述的方法，其中，使用由SEQ ID NO: 5的核苷酸序列组成的引物和由SEQ ID NO: 6的核苷酸序列组成的引物的引物对来检测位于qNaCl3基因的上游5.2kb处的SSR标志物即SSR25.8，而且，使用由SEQ ID NO: 7的核苷酸序列组成的引物和由SEQ ID NO: 8的核苷酸序列组成的引物的引物对来检测位于qNaCl3基因的下游13kb处的SSR标志物即SSR55.5。
6. 培育具有耐盐性的大豆的方法，其中，筛选不具有约3.8kb的插入片段的大豆作为具有耐盐性的大豆进行培育，所述插入片段由qNaCl3基因的外显子3下游的SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列组成。”
驳回决定中指出：（1）权利要求1与对比文件1（利用豆科模式转化系统分析大豆耐盐基因的功能，王敏娟，中国优秀硕士学位论文全文数据库（农业科技辑），2011年第09期，公开日期：2011年09月15日）的区别特征在于：导入的基因不同，对比文件1是GmNHX1，本申请是qNaCl3，然而两者均是大豆Na /H 反向转运蛋白。即，权利要求1实际解决的技术问题是：如何选择其他的大豆Na /H 反向转运蛋白基因来代替对比文件1中的GmNHX1以丰富现有技术。对比文件2（NCBI Reference Sequence:XP_003520629.1，公开日期：2011年11月08日）公开了一种来源于大豆（Glycine max）3号染色体上的预测为阳离子/H( )反向转运蛋白的氨基酸序列，与本申请SEQ ID NO:2所示的qNaCl3同源性高达99%，仅有2位氨基酸有所不同。虽然对比文件2的功能是预测的，但基于预测功能加以实验验证是常规技术手段。基于对比文件2公开的序列设计引物在大豆中扩增获得SEQ ID NO:1或3所示核苷酸序列及其编码的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列等也是常规技术手段。因此，出于拓展应用的目的，本领域技术人员容易想到将对比文件2公开的阳离子/H( )反向转运蛋白相关的蛋白代替对比文件1中的GmNHX1。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2和常规技术手段获得权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备创造性。（2）权利要求2、3进一步限定所述植物为双子叶植物、大豆，所述内容已被对比文件1公开，因此，在所引用的权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2-3也不具备创造性。（3）权利要求4与对比文件2的区别特征在于，权利要求4请求保护培育具有耐盐性的大豆的方法，包括以SEQ ID NO: 1或3所示的qNaCl3基因内或其附近的DNA标志物，来筛选耐盐性的大豆。基于预测功能加以实验验证、设计引物并扩增获得SEQ ID NO:1或3所示核苷酸序列及其编码的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列等都属于常规技术手段。对比文件1公开了耐盐基因中Na /H 反向转运蛋白是由盐胁迫诱导的，敏盐材料中没有Na /H 反向转运蛋白活力，Na /H 反向转运蛋白的活力在不同的基因型中表现不同（参见对比文件1第4-5页）。本领域技术人员也容易想到验证对比文件2的阳离子/H( )反向转运基因或其附近的片段在不同品种大豆中的表达量如何，是否与不同品种大豆的耐盐、敏盐性相关，将该基因或其片段作为筛选耐盐性大豆的标志物进一步用于筛选耐盐性大豆，这是通过常规、有限的试验就能够实现的。因此，在对比文件2的基础上结合对比文件1和常规技术手段获得权利要求4请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求4不具有创造性。（4）权利要求5进一步限定了SSR标记物和其PCR引物，但筛选具体的SSR标记物和检测SSR标记物的引物可以通过常规方法获得。因此权利要求5也不具备创造性。（5）基于与权利要求4相同或相似的理由，权利要求6也不具备创造性。
申请人国立研究开发法人国际农林水产业研究中心（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年01月23日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书的全文替换页(共1页6项）。删除了权利要求1中(b)-(d)和(f)。复审请求人提交了附件1-4:
附件1:Guang-Zuo Luo等人，A putative plasma membrane cation/proton antiporter from soybean confers salt tolerance in Arabidopsis，Plant Mol Biol.，第59卷，第5期，第809-820页，公开日期：2005年11月30日，英文复印件共12页。
附件2：Ashwani K. Rai等人，Abiotic Stress Tolerance in Plants: Toward the Improvement of Global Environment and Food，“11. Na /H antiporters in plants and cyanobacteria”，第168-175页，公开日期：2006年12月31日，英文复印件共19页。
附件3：Salil Chanroj等人，Conserved and diversified gene families of monovalent cation/H antiporters from algae to flowering plants，Front Plant Sci.，第3卷，文章编号：25，第1-18页，公开日期：2012年02月14日，英文复印件共18页。
附件4：Pascal Maser等人，Phylogenetic relationships within cation transporter families of Arabidopsis，Plant Physiol.，第126卷，第4期，第1646-1667页，公开日期：2001年08月31日，英文复印件共22页。
复审请求人认为：（1）对比文件1与本申请公开的导入基因不同，且仅公开了通过将GmNHX1基因导入具有中度的耐盐胁迫的大豆根系可以在某种程度上提高大豆根系的耐盐胁迫，但未明确关于其它生育期间的耐盐性。附件1证明，用大豆的阳离子/质子反向转运蛋白同系物基因GmCAX1转化拟南芥（Arabidopsis），转化体虽然在发芽期对野生型显示出高耐盐性，但在幼苗期未显示出高耐盐性。另外，即使在土壤生长环境下也未显示出高耐盐性。对比文件1中包含GmNHX1基因的毛状根中的耐盐性不能遗传给下一代，无法实际验证耐盐性大豆品种的开发的实用性。相对于此，本发明的qNaCl3基因调控植物的耐盐胁迫(耐盐性)，并可通过DNA标志物的筛选育种，培育耐盐胁迫提高的大豆。本发明所要解决的技术问题是：通过向不具有耐盐胁迫的大豆品种中导入qNaCl3基因，可获得耐盐胁迫有所提高的大豆品种。（2）对比文件1的GmNHX1基因与本发明的qNaCl3基因分别位于大豆不同的染色体上，而且二者的cDNA核苷酸序列以及作用原理均不同。qNaCl3虽然与阳离子/H＋反向转运类蛋白显示高同源性，但与局限于细胞质膜的SOS1和液泡膜的NHX1所属的植物反向转运的“CPA1型”不同，基本上属于功能未明的“CPA2型”，通常“CPA2型”反向转运中暗示具有与耐盐性不同的功能（pH 恒定性、叶绿体的形成、气孔的开闭、花粉管的形成等），具体可参见附件2和3。因此根据对比文件1的GmNHX1基因的功能，难以预测本发明的qNaCl3基因的功能。（3）附件4说明，多数植物具有膜输送蛋白，拟南芥（Arabidopsis）的情形，存在880成员、46家族。根据最新的大豆基因组信息，（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html），大豆的基因组中至少存在40个以上的阳离子/H＋反向转运基因的同系物。对比文件2仅公开预测为阳离子/H 反向转运蛋白的氨基酸序列，未公开蛋白的功能，虽然与qNaCl3同样位于3号染色体，但与对比文件1的GmNHX1基因位于不同的染色体上，本领域技术人员难以想到选择对比文件2的阳离子/H＋反向转运蛋白来替代对比文件1的Na＋/H＋反向转运蛋白编码基因GmNHX1、并验证其效果。因此，仅凭qNaCl3的氨基酸序列无法明确qNaCl3具有使耐盐性提高的功能。根据对比文件1和对比文件2的记载无法想到：通过将qNaCl3基因导入到不具有耐盐胁迫的植物而使该不具有耐盐胁迫的植物的耐盐胁迫提高的方法，本发明具有无法预测的显著的效果。复审请求时新修改的权利要求书如下：
“1. 通过将选自下述(1)和(2)基因的基因导入不具有耐盐胁迫的植物而使该植物的耐盐胁迫提高的方法：
(1) 基因，该基因由下述(a)、(e)中的任一种DNA组成：
(a) 由SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列组成的DNA；以及
(e) 编码由SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列组成的蛋白的DNA，
(2) (1)的基因，该基因是调控植物的耐盐胁迫、且编码具有Na /H 反向转运蛋白活性的蛋白的qNaCl3基因。
2. 权利要求1所述的使植物的耐盐胁迫提高的方法，其中，植物为双子叶植物。
3. 权利要求1所述的使植物的耐盐胁迫提高的方法，其中，植物为大豆。
4. 培育具有耐盐性的大豆的方法，该方法包括：以作为位于具有SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的qNaCl3基因内或其附近的DNA标志物、且成为qNaCl3基因的存在标记的DNA标志物的存在为指标，筛选具有耐盐性的大豆。
5. 权利要求4所述的方法，其中，使用由SEQ ID NO: 5的核苷酸序列组成的引物和由SEQ ID NO: 6的核苷酸序列组成的引物的引物对来检测位于qNaCl3基因的上游5.2kb处的SSR标志物即SSR25.8，而且，使用由SEQ ID NO: 7的核苷酸序列组成的引物和由SEQ ID NO: 8的核苷酸序列组成的引物的引物对来检测位于qNaCl3基因的下游13kb处的SSR标志物即SSR55.5。
6. 培育具有耐盐性的大豆的方法，其中，筛选不具有约3.8kb的插入片段的大豆作为具有耐盐性的大豆进行培育，所述插入片段由qNaCl3基因的外显子3下游的SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列组成。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年02月01日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，(1)本申请qNaCL3与对比文件2的序列同源性高达99%，且对比文件2公开了其序列的预测功能，对该预测功能验证是容易的。因此，本领域技术人员能够基于对比文件2的序列设计引物从现有大豆样本中PCR获得本申请qNaCL3的序列，并且根据Na /H 反向转运蛋白这一类的功能结合对比文件1的具体示例对序列功能进行验证也是容易的。(2)就效果而言，没有证据证明本申请的qNaCL3相对于对比文件1和2的教导具有预料不到的技术效果。因此，本申请仍然不具备创造性，因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019 年01 月24 日向复审请求人发出复审通知书，指出：（1）权利要求1与对比文件1的区别特征在于：导入的基因不同，对比文件1是GmNHX1，权利要求1是qNaCl3，并进一步限定了其序列。权利要求1实际解决的技术问题是：选择另一种蛋白来代替对比文件1中的GmNHX1，使被转化的大豆的耐盐胁迫提高。针对区别特征，对比文件2公开了一种来源于大豆（Glycine max）3号染色体上的预测为阳离子/H 反向转运蛋白的氨基酸序列，与本申请SEQ ID NO:2所示的qNaCl3同源性为99%，仅有2位氨基酸不同。虽然对比文件2的功能是预测的，但基于预测功能加以实验验证是本领域的常规技术手段。并且基于对比文件2公开的序列设计引物在大豆中扩增获得SEQ ID NO:1或3所示核苷酸序列及其编码的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列也属于本领域的常规技术手段。对比文件2预测的该蛋白属于阳离子/H 反向转运蛋白，对比文件1已经详细描述了Na /H 反向转运蛋白能够使植物增强耐盐胁迫能力的原理及应用。因此本领域技术人员有动机用阳离子/H 反向转运蛋白qNaCl3替换对比文件1的Na /H 反向转运蛋白GmNHX1，以获得耐盐胁迫能力增强的大豆植株。本领域的技术人员会在对比文件1的基础上，进一步结合对比文件2以及本领域公知常识得到权利要求1的全部技术方案，这对本领域技术人员来说是显而易见的，其效果也是能够预料到的。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（2）从属权利要求2和3进一步限定植物的种类，而对比文件1已经公开了所述植物是大豆，因此权利要求2和3也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（3）权利要求4与对比文件1的区别特征在于：对比文件1中的大豆Na /H 反向转运蛋白是GmNHX1，未采用其DNA标志物筛选耐盐性大豆；权利要求4的大豆Na /H 反向转运蛋白是qNaCl3，并进一步限定了其序列，且以其编码基因内或其附近的DNA标志物，来筛选耐盐性的大豆。权利要求4实际解决的技术问题是：选择另一种蛋白基因来代替对比文件1中的GmNHX1，并以其DNA标志物，来筛选耐盐性的大豆。针对上述区别特征，对比文件2公开了一种来源于大豆（Glycine max）3号染色体上的预测为阳离子/H 反向转运蛋白的氨基酸序列，与本申请SEQ ID NO:2所示的qNaCl3同源性为99%，仅有2位氨基酸不同。基于预测功能加以实验验证、设计引物并扩增获得SEQ ID NO:1或3所示核苷酸序列及其编码的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列属于本领域的常规技术手段。由于对比文件2预测的该蛋白属于阳离子/H 反向转运蛋白，对比文件1已经详细描述了Na /H 反向转运蛋白能够使植物增强耐盐胁迫能力的原理及应用。因此本领域技术人员有动机用阳离子/H 反向转运蛋白qNaCl3替换对比文件1的Na /H 反向转运蛋白GmNHX1，以获得耐盐胁迫能力增强的大豆植株。本领域技术人员容易想到验证对比文件2的阳离子/H 反向转运基因或其附近的片段在不同品种大豆中的表达量如何，是否与不同品种大豆的耐盐性相关，将该基因或其片段作为筛选耐盐性大豆的标志物进一步用于筛选耐盐性大豆，这是通过常规、合理限度的试验就能够实现的。在对比文件1的基础上结合对比文件2和常规技术手段获得权利要求4请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求4不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（4）权利要求5进一步限定了SSR标记物和其PCR引物，在已知Na /H 反向转运蛋白与大豆耐盐性相关的基础上，筛选具体的SSR标记物、检测SSR标记物的引物可以通过常规方法就能够获得。因此权利要求5也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（5）基于与权利要求4相似的理由，权利要求6也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
针对复审请求人在提出复审请求时的意见，合议组认为：（1）对比文件1未公开转基因大豆其它生育期间的耐盐性不代表其在其它生育时期不具备耐盐性，通过将GmNHX1基因导入具有中度的耐盐胁迫的大豆根系提高大豆根系的耐盐胁迫只是一种验证蛋白功能的实验方式，属于本领域常规的选择，并不意味所述蛋白仅能通过这一种方式，且仅限于提高具有中度耐盐胁迫大豆的耐盐性。对比文件1已经公开了Na /H 反向转运蛋白可调控细胞质pH值、钠离子浓度和细胞体积，从而减轻盐胁迫对植物的伤害。并采用向大豆根系导入由CaMV35启动子调控的大豆Na /H 反向转运蛋白编码基因GmNHX1的cDNA序列，通过该基因的过量表达，提高大豆的耐盐性的方式验证了Na /H 反向转运蛋白编码基因GmNHX1的功能。本领域技术人员在此公开的基础上有动机尝试使用其它的大豆Na /H 反向转运蛋白甚至阳离子/H 反向转运蛋白增加转基因植株的耐盐性。而通过DNA标志物的筛选育种培育耐盐性提高的大豆属于本领域的常规技术，本领域技术人员通过合理限度的试验即可实现。（2）本领域技术人员知晓Na /H 反向转运蛋白是最常见的阳离子/H 反向转运蛋白，该家族的研究在现有技术中较为充分。出于对功能进行研究的目的，本领域技术人员也容易想到验证对比文件2的阳离子/H 反向转运基因或其附近的片段在不同品种大豆中的表达量如何，是否与不同品种大豆的耐盐性相关，将该基因或其片段作为筛选耐盐性大豆的标志物进一步用于筛选耐盐性大豆，这是通过本领域常规技术手段和合理限度的试验就能够实现的。没有证据表明qNaCl3基因与GmNHX1基因在大豆中的细胞定位和作用原理显著不同，鉴于qNaCl3基因在数据库中所预测的功能与GmNHX1基因是相同或相似的，两种基因在提高大豆的耐盐性的功能方面进行替代的启示是较为明显的，效果也是能够预期或通过有限试验验证的。因此，对比文件1的提高大豆耐盐胁迫的方法和对比文件2的阳离子/H 反向转运蛋白或其同源蛋白的结合存在技术启示，且没有证据显示本申请的Na /H 反向转运蛋白或阳离子/H 反向转运蛋白qNaCl3蛋白及其技术方案取得了预料不到的技术效果。（3）qNaCl3和对比文件2公开的阳离子/H 反向转运蛋白的确都属于CPA2家族，但CPA2家族的成员具有耐盐性已被现有技术公开，例如，Waser M等人（Cloning and disruption of a putative NaH-antiporter gene of Enterococcus hirae，J Biol Chem.，第267卷，第8期，第5396-5400页，公开日期：1992年03月31日）公开了一种属于CPA2家族的反向转运蛋白NapA，该蛋白的缺失会导致海氏肠杆菌（Enterococcus hirae）丧失Na /H 反向转运活性，无法在高盐环境下生长。（4）Na /H 反向转运蛋白家族的研究是现有技术中较为充分的，例如对比文件1中记载转Na /H 反向转运蛋白能显著提高植物耐盐性，主要原因可能是由于该基因导入植物细胞，激活了耐盐相关基因的活性，从而明显提高植物的耐盐性（参见对比文件1的第1.3.2节）。就效果而言，也没有证据证明本申请qNaCL3与对比文件1的GmNHX1和/或对比文件2预测功能的序列相比具有预料不到的技术效果。
复审请求人于2019年03月08日针对复审通知书提交了意见陈述书，未修改申请文件，提交了附件5。
附件5：Do, T. D.等人，Ncl Synchronously Regulates Na , K , and Cl– in Soybean and Greatly Increases the Grain Yield in Saline Field Conditions，Sci. Rep. 6, 文章编号：19147，公开日期：2016年01月08日，英文复印件共10页。
复审请求人认为：（1）对比文件1中仅有“通过将GmNHX1基因导入具有中度的耐盐胁迫的大豆根系可以在某种程度上提高大豆根系的耐盐胁迫”的记载，而对比文件2也没有具体记载预测为阳离子/H＋反向转运蛋白的氨基酸序列的蛋白的功能，使本领域技术人员只能认为通过将其它的大豆Na /H 反向转运蛋白甚至阳离子/H＋反向转运蛋白导入具有耐盐胁迫的大豆根系可以在某种程度上提高大豆根系的耐盐胁迫。而本发明是“通过将qNaCl3基因导入不具有耐盐胁迫的植物，而使不具有耐盐胁迫的该植物的耐盐胁迫提高的方法”，与对比文件1、2或公知常识不同。（2）与qNaCl3基因显示出高同源性的阳离子/H 反向转运类蛋白，具有输送Na 或K 等的正离子的功能。但根据附件5公开的内容，本发明的qNaCl3基因强烈表达，则与预想相反不仅大豆植物内的Na 、K ，就连Cl-的蓄积量也降低。因此，qNaCl3基因在大豆的植物内可同时调节Na 、K ，的正离子和Cl-的负离子的输送和蓄积是被首次明确的，此种功能是根据阳离子/H 反向转运类蛋白的功能利用现有的知识而无法预测的。（3）以作为位于具有SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的qNaCl3基因内或其附近的DNA标志物、且成为qNaCl3基因的存在标记的DNA标志物的存在为指标，筛选具有耐盐性的大豆的技术方案并非本领域的公知常识。而筛选不具有约3.8kb的插入片段的大豆作为具有耐盐性的大豆进行培育，所述插入片段由qNaCl3基因的外显子3下游的SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列组成也是本领域技术人员无法想象的，更无法预期上述技术方案的效果。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出复审请求审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在提出复审请求时提交了权利要求书全文替换页（共1页6项），所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审决定所针对的审查文本为：2016年08月17日进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书第1-133段（即第1-18页）、说明书附图图1-图12（即第1-17页）、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-32页；以及2018年01月23日提交的权利要求第1-6项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
判断一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中存在这种启示，并且所获得的发明的技术效果是可以预料的，则该发明不具备创造性。
具体到本案，权利要求1要求保护一种通过将选自下述(1)和(2)基因的基因导入不具有耐盐胁迫的植物而使该植物的耐盐胁迫提高的方法：
(1) 基因，该基因由下述(a)、(e)中的任一种DNA组成：
(a) 由SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列组成的DNA；以及
(e) 编码由SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列组成的蛋白的DNA，
(2) (1)的基因，该基因是调控植物的耐盐胁迫、且编码具有Na /H 反向转运蛋白活性的蛋白的qNaCl3基因。
对比文件1公开了：盐对于植物的毒害作用主要是由于水分亏缺导致的渗透胁迫以及过量Na 对重要生化过程的毒害。Na /H 反向转运蛋白可调控细胞内pH值、细胞质钠离子浓度和细胞体积，以减少盐胁迫对植物的伤害。细胞内过多的Na 从质膜向细胞外排放和Na 在液泡中的区域化分别是由位于质膜和液泡膜上Na /H 反向转运蛋白完成的。Na /H 反向转运的蛋白基因是目前研究最为系统的植物耐盐性基因之一，在过量表达Na /H 反向转运蛋白的多种作物的耐盐性都已经得到了有效的提高。大豆的液泡膜上发现的离子转运蛋白GmNHX1和GmNHX2可被NaCl、KCl等和干旱诱导，在大豆根与叶中表达，而其过表达可明显增加转基因烟草在盐压力下，线粒体完整性以及细胞的生长发育能力。向大豆根系导入由CaMV35启动子调控的大豆Na /H 反向转运蛋白编码基因GmNHX1的cDNA序列，通过该基因的过量表达，提高大豆的耐盐性，带有转基因发状根的子叶及复合体植株在盐胁迫条件下也具有较强的生存能力（参见对比文件1的摘要、第1.1节、第1.2.2节、第1.3节、第3.4.1节和第4.1.2节）。
权利要求1与对比文件1的区别特征在于：导入的基因不同，对比文件1是GmNHX1，权利要求1是qNaCl3，并进一步限定了其序列。因此，权利要求1实际解决的技术问题是：选择另一种蛋白来代替对比文件1中的GmNHX1，使被转化的大豆的耐盐胁迫提高。
针对上述区别特征，对比文件2公开了一种来源于大豆（Glycine max）3号染色体上的预测为阳离子/H 反向转运蛋白的氨基酸序列，与本申请SEQ ID NO:2所示的qNaCl3同源性为99%，仅有2位氨基酸不同（参见对比文件2的序列表及其相关信息）。虽然对比文件2的功能是预测的，但基于预测功能加以实验验证是本领域的常规技术手段。并且基于对比文件2公开的序列设计引物在大豆中扩增获得SEQ ID NO:1或3所示核苷酸序列及其编码的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列也属于本领域的常规技术手段。由于对比文件2预测的该蛋白属于阳离子/H 反向转运蛋白，对比文件1已经详细描述了Na /H 反向转运蛋白能够使植物增强耐盐胁迫能力的原理及应用。因此本领域技术人员有动机用阳离子/H 反向转运蛋白qNaCl3替换对比文件1的Na /H 反向转运蛋白GmNHX1，以获得耐盐胁迫能力增强的大豆植株。
由此可知，本领域的技术人员会在对比文件1的基础上，进一步结合对比文件2以及本领域公知常识得到权利要求1的技术方案，这对本领域技术人员来说是显而易见的，其技术效果也是能够合理预料到的。因此，权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求2和3进一步限定植物的种类，而对比文件1已经公开了所述植物是大豆，因此在其引用的权利要求不具有创造性的前提下，权利要求2和3也不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求4请求保护培育具有耐盐性的大豆的方法，该方法包括：以作为位于具有SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的qNaCl3基因内或其附近的DNA标志物、且成为qNaCl3基因的存在标记的DNA标志物的存在为指标，筛选具有耐盐性的大豆。
如评述权利要求1的意见所述，对比文件1已经公开了Na /H 反向转运蛋白可调控细胞内pH值、细胞质钠离子浓度和细胞体积，以减少盐胁迫对植物的伤害。并通过大豆Na /H 反向转运蛋白编码基因GmNHX1的过量表达，提高大豆的耐盐胁迫（参见对比文件1的第1.3节和第3.4.1节）。权利要求4与对比文件1的区别特征在于：对比文件1中的大豆Na /H 反向转运蛋白是GmNHX1，未采用该基因内或其附近的DNA来筛选耐盐性大豆；权利要求4的大豆Na /H 反向转运蛋白是qNaCl3，并进一步限定了其序列，且以其编码基因内或其附近的DNA片段来筛选耐盐性的大豆。因此，权利要求4实际解决的技术问题是：选择另一种基因来代替对比文件1中的GmNHX1，并以其基因内或附近的DNA来筛选耐盐性的大豆。
针对上述区别特征，对比文件2公开了一种来源于大豆（Glycine max）3号染色体上的预测为阳离子/H 反向转运蛋白的氨基酸序列，与本申请SEQ ID NO:2所示的qNaCl3同源性为99%，仅有2位氨基酸不同（参见对比文件2的序列表及其相关信息）。虽然对比文件2的功能是预测的，但基于预测功能加以实验验证是本领域的常规技术手段。基于对比文件2公开的序列设计引物在大豆中扩增获得SEQ ID NO:1或3所示核苷酸序列及其编码的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列也属于本领域的常规技术手段。由于对比文件2预测的该蛋白属于阳离子/H 反向转运蛋白，对比文件1已经详细描述了Na /H 反向转运蛋白能够使植物增强耐盐胁迫能力的原理及应用。因此本领域技术人员有动机用阳离子/H 反向转运蛋白qNaCl3替换对比文件1的Na /H 反向转运蛋白GmNHX1，以获得耐盐胁迫能力增强的大豆植株。而且由于Na /H 反向转运蛋白的功能和机理是现有技术中研究较多的。出于对功能进行研究的目的，本领域技术人员也容易想到验证对比文件2的阳离子/H 反向转运基因或其附近的片段在不同品种大豆中的表达量如何，是否与不同品种大豆的耐盐性相关；进而将该基因或其片段作为筛选耐盐性大豆的标志物，例如检测该特定基因的表达水平，并用于筛选耐盐性大豆。综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件2和常规技术手段获得权利要求4请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求4不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对于复审请求人在答复复审通知书中的意见陈述，合议组认为：（1）对比文件1未公开将Na /H 反向转运蛋白导入不具有耐盐胁迫的大豆根系不代表其不能被导入盐敏感型大豆，就如合议组在复审意见通知书中所述，通过将GmNHX1基因导入具有中度的耐盐胁迫的大豆根系提高大豆根系的耐盐胁迫只是一种验证蛋白功能的实验方式，属于本领域常规的选择，并不意味所述蛋白仅能通过这一种方式，且仅限于提高具有中度耐盐胁迫大豆的耐盐性。对比文件1已经公开了Na /H 反向转运蛋白可调控细胞质pH值、钠离子浓度和细胞体积，从而减轻盐胁迫对植物的伤害。并采用向大豆根系导入由CaMV35启动子调控的大豆Na /H 反向转运蛋白编码基因GmNHX1的cDNA序列，通过该基因的过量表达，提高大豆的耐盐性的方式验证了Na /H 反向转运蛋白编码基因GmNHX1的功能。本领域技术人员在此公开的基础上有动机尝试使用其它的大豆Na /H 反向转运蛋白甚至阳离子/H 反向转运蛋白增加转基因植株的耐盐性。（2）如上所述，本领域技术人员在对比文件1公开的基础上有动机尝试使用其它的大豆Na /H 反向转运蛋白甚至阳离子/H 反向转运蛋白增加转基因植株的耐盐性。复审请求人提供的附件5的公开日期晚于本申请的优先权日和申请日，是不能作为现有技术的，更不能证明现有技术有相反教导。在本领域技术人员知晓Na /H 反向转运蛋白可以调控细胞质pH值、钠离子浓度和细胞体积，从而减轻盐胁迫对植物的伤害的情况下，很容易想到将编码这类Na /H 反向转运蛋白，例如对比文件2公开的反转运蛋白的基因导入有待提高耐盐性的植物，以提高所述植物的耐盐性，并对其提升的效果进行检测。鉴于qNaCl3基因编码的蛋白与对比文件2公开的反向转运蛋白同源性超过99%，显然二者的功能也高度相似，效果也是能够预期或通过有限试验验证的。（3）权利要求4中并未限定具体的鉴定具有耐盐性大豆的生物标志物。结合对比文件1和2，本领域技术人员容易想到qNaCl3基因与大豆的耐盐性密切相关，也容易想到对该基因的检测，例如表达水平的高低，可以在一定程度上指示大豆耐盐性的程度。从而，权利要求4的技术方案对本领域技术人员来说也是显而易见的。
在上述工作基础上，本案合议组作出如下复审请求审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年11月03日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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