发明创造名称：一种基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒及其制备方法和应用
外观设计名称：
决定号：187360
决定日：2019-08-20
委内编号：1F265341
优先权日：
申请（专利）号：201610210052.0
申请日：2016-04-06
复审请求人：上海奥普生物医药有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：汤晨光
合议组组长：孙世新
参审员：李佳
国际分类号：G01N33/68;G01N33/577;G01N33/533;G01N33/543;G01N21/64
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征，但这些区别技术特征可以由本领域技术人员基于其他对比文件公开的内容并结合公知常识而得到，并且该权利要求的技术方案并没有由于这些区别技术特征而具有预料不到的技术效果，则该权利要求请求保护的技术方案对本领域技术人员而言是显而易见的，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610210052.0，名称为“一种基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒及其制备方法和应用”的发明专利申请（下称本申请），本申请的申请日为2016年04月06日，公开日为2016年08月31日，申请人为上海奥普生物医药有限公司。
经实质审查，国家知识产权局专利实质审查部门于2018年07月27日针对本申请作出驳回决定，驳回决定认为：权利要求1-5不具备专利法第22条第3款规定的创造性。同时，在其他说明部分指出：权利要求6-8不具备专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定所针对的审查文本是：申请日2016年04月06日提交的说明书第1-10页、说明书附图第1-2页、说明书摘要、摘要附图，以及2018年05月15日提交的权利要求第1-8项。
驳回决定引用的对比文件如下：
对比文件1：“超敏C-反应蛋白时间分辨荧光免疫分析的建立”，杭建峰 等，第四军医大学学报，第28卷第3期，第279-282页，公开日为2007年12月31日；
对比文件2：“Supersensitive Time-resolved Immunofluorometric Assay of Free Prostate-specific Antigen with Nanoparticle Label Technology”，Tero Soukka等，Clinical Chemistry，第47卷第7期，第1269-1278页，公开日为2001年12月31日；
对比文件3：“Utilization of Kinetically Enhanced Monovalent Binding Affinity by Immunoassays Based on Multivalent Nanoparticle-Antibody Bioconjugates”，Tero Soukka等，Analytical Chemistry，第73卷第10期，第2254-2260页，公开日为2001年05月15日；
对比文件4：CN101625366A，公开日为2010年01月13日。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒，其特征在于：该试剂盒由检测反应杯、荧光标记抗体及清洗液组成；
所述检测反应杯的固相表面包被有超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体；所述荧光标记抗体为时间分辨荧光微球与超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体通过共价键交联；
该免疫分析试剂盒的制备方法，其步骤包括，
(1)、检测反应杯的制备：将超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体稀释后37℃包被，并用封闭缓冲液封闭、拍干；置于37℃的干燥箱中烘干、密封保存；
(2)、荧光标记抗体的制备：取1mg羧基时间分辨荧光微球，加60μL 500mmol/L的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液，pH6.0，加0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加纯化水至终体积400μL，室温混匀15min；加100μL 50mmol/L氨基己酸，室温混匀30min；加1mL 100mmol/L MES pH6.0，离心清洗15000rpm 20min，弃去上清；加400μL 100mmol/L MES pH6.0，超声分离，加0.2mg N-羟基琥珀酰亚胺，加0.1mgEDC，室温混匀15min；加1mL 100mmol/L MES pH6.0缓冲液，离心清洗15000rpm 20min，弃去上清；100mmol/L MES pH6.0缓冲液恢复到1ml；
然后加入超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体混匀、封闭、清洗，并用反应缓冲液稀释，获得终浓度到20μg/ml的荧光标记抗体；
(3)清洗液的制备：该清洗液中含有PB，NaCl，Tween 20，该清洗液的pH值为7-9。
2. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒，其特征在于：所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物，其粒径为100-1000nm。
3. 根据权利要求2所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒，其特征在于：所述镧系元素螯合物为铕螯合物。
4. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免 疫分析试剂盒，其特征在于所述步骤(2)中，活化的步骤为，在羧基时间分辨荧光微球中加入MES和EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室温混匀15-60min，加入MES、NHS和EDC进行再次活化处理；每1mg羧基时间分辨荧光微球对应10-100μL 50mmol/L氨基己酸。
5. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒，其特征在于：所述步骤(3)中的清洗液中含有5mmol/L的PB，0.9％NaCl，0.05％Tween 20，该清洗液的pH值为7.8。
6. 权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白的非疾病诊断检测方法，其步骤包括，
(A)、标准曲线的绘制：采用基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒测定不同浓度的校准品，并根据荧光读数仪上的荧光信号值，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号值为纵坐标，绘制成标准曲线；
(B)、将待测样品加入检测反应杯内，再加入荧光标记抗体，30℃-40℃温育，用清洗液清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体；
(C)在340-380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号,检测波长为600-630nm；
(D)将所述荧光信号与步骤(A)中的标准曲线比对，获得所述待测样品的超敏C反应蛋白浓度。
7. 权利要求6所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白的非疾病诊断检测方法，其特征在于：所述步骤(A)中，浓度为0、0.05、0.5、2、5、10、25、50μg/mL的校准品中加入荧光标记抗体，37℃温育5-25min，然后用清洗液清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，所述校准品与荧光标记抗体的体积比为2-4:100。
8. 权利要求7所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白的非疾病诊断检测方法，其特征在于：所述步骤(B)中，待测样品与荧光标记抗的体积比为2-4:100，温育温度为37℃。”
驳回决定具体指出：（1）权利要求1与对比文件l的区别技术特征在于：权利要求1请求保护一种试剂盒，相应的由检测反应杯、荧光标记抗体及清洗液组成，检测反应杯的固相表面包被有超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体，荧光标记抗体为时间分辨荧光微球与超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体通过共价键交联；同时，权利要求1中涉及试剂盒的具体制备方法。对于上述区别技术特征，对比文件2教导了采用时间分辨荧光微球与抗体结合作为标记物能够提高免疫方法的检测限；对比文件4公开了在微粒活化过程中添加正氨基己酸作为手臂，减少空间结合位阻，提高检测的灵敏度，对比文件4中上述微球的制备过程包括对微球进行初次活化处理，之后连接手臂，将连接手臂的微球用于标记抗体前还需要再次活化处理的过程；上述区别技术特征中的其余特征为本领域的公知常识。因此，权利要求1相对于对比文件1、对比文件2、对比文件4和公知常识的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（2）从属权利要求2的附加技术特征被对比文件2及对比文件3（对比文件2的参考文献17）公开；从属权利要求3-5的附加技术特征或者被对比文件2-4公开、或者为本领域公知常识，因此，权利要求2-5不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（3）在其他说明部分指出：①权利要求6请求保护权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白的非疾病诊断检测方法，权利要求1并不具备创造性，权利要求6与对比文件1进一步的区别“以校准品浓度为横坐标以荧光信号值为纵坐标绘制成标准曲线、在340-380nm激发光激发下测试检测反应杯中荧光信号，检测波长为600-630nm，将荧光信号与标准曲线比对，获得待测样品的超敏C反应蛋白浓度”为本领域公知常识，因此，权利要求6相对于对比文件1、对比文件2、对比文件4和公知常识的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。②从属权利要求7、8的附加技术特征或者被对比文件1公开、或者为本领域公知常识，因此，权利要求7、8不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人上海奥普生物医药有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年11月07日向国家知识产权局提出了复审请求，提交了权利要求书的全文修改替换页，修改涉及：删除从属权利要求4，适应性地修改后续权利要求的编号和引用关系。复审请求人陈述了权利要求1-7具备创造性的理由：（1）关于荧光标记物，对比文件2进一步公开了微量滴定孔的处理、测试缓冲试剂的选择以及纳米颗粒-抗体生物结合物活性结合点的数目对减少非特异性结合、改善检测限都有重要影响，基于对比文件2的整体教导，本领域技人员对对比文件1的改进，不仅仅在于只替换标记物，更可能的是会结合其公开的两步基于纳米颗粒的免疫检测方法来进行改进，包括对检测反应杯的处理、选择特定的测试缓冲试剂等。并且，对比文件2和对比文件1检测的样品不同，结构差异很大，本领域技术人员很难预期在对比文件1的基础上改用对比文件2的两步免疫检测方法就可以缩短超敏C反应蛋白的检测时间、提高检测灵敏度。（2）关于羧基时间分辨荧光微球的前处理。首先，本申请实际解决的技术问题是如何提高超敏C反应蛋白的检测灵敏度并缩短检测时间，考虑到多因素对检测限的影响，本领域技术人员无法预期对哪种或哪些因素进行何种修改，能够提高检测限，即缺乏具体调整的方向以及调整成功的预期，本领域技术人员没用动机基于对比文件4，进而改变对比文件2的纳米颗粒的前处理步骤。而本申请实施例1和实施例3对比可知，如果仅采用EDC和NHS对羧基时间分辨荧光微球进行处理，相比本申请权利要求1限定的方式，灵敏度会有所降低。其次，对比文件4采用空白微球，微球使用环境是均相环境，可以使得采用免疫胶乳比浊法的反应灵敏度提高一个数量级。免疫胶乳比浊法和时间分辨荧光免疫方法属于两种不同的检测方法，涉及的是不同种类和作用的微球，对微球表面的修饰对于两种方法的反应灵敏度的影响是不一样的，本领域技术人员无法预期在荧光纳米微球表面采用对比文件4的方法添加氨基己酸手臂，能够有效降低非均相条件下的空间位阻，也无法预期是否能够提高时间分辨荧光免疫方法的反应灵敏度。再次，对比文件4先将微颗粒部分羧基用EDC进行活化，对剩下的羧基加入正氨基己酸进行反应，之后再加入少量EDC再次进行活化，并且对pH值有特定的要求，本领域技术人员基于此没有动机去改变对比文件4所限定的羧基活化后关键pH值、改变EDC和氨基己酸的相对用量和再次活化时候的试剂。本申请采用特定的前处理步骤可以实现循环增加手臂，由提交的附件1-4本申请所采用微球和其他类似微球的说明书可知，本申请第一次活化加入的EDC和氨基己酸的用量远远超过了荧光微球有效羧基量，在不清洗EDC的情况下，必然会存在羧基表面手臂循环加长的过程，相对长的手臂更利于降低非均相条件下的空间位阻，而对比文件4中仅添加一层手臂，能够降低的空间位阻也有限，不足以解决在固相载体上微球与反应杯之间的空间位阻。复审请求时新修改的权利要求书如下：
“1. 一种基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒，其特征在于：该试剂盒由检测反应杯、荧光标记抗体及清洗液组成；
所述检测反应杯的固相表面包被有超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体；所述荧光标记抗体为时间分辨荧光微球与超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体通过共价键交联；
该免疫分析试剂盒的制备方法，其步骤包括，
(1)、检测反应杯的制备：将超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体稀释后37℃包被，并用封闭缓冲液封闭、拍干；置于37℃的干燥箱中烘干、密封保存；
(2)、荧光标记抗体的制备：取1mg羧基时间分辨荧光微球，加60μL 500mmol/L的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液，pH6.0，加0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加纯化水至终体积400μL，室温混匀15min；加100μL 50mmol/L氨基己酸，室温混匀30min；加1mL 100mmol/L MES pH6.0，离心清洗15000rpm 20min，弃去上清；加400μL 100mmol/L MES pH6.0，超声分离，加0.2mg N-羟基琥珀酰亚胺，加0.1mgEDC，室温混匀15min；加1mL 100mmol/L MES pH6.0缓冲液，离心清洗15000rpm 20min，弃去上清；100mmol/L MES pH6.0缓冲液恢复到1ml；
然后加入超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体混匀、封闭、清洗，并用反应缓冲液稀释，获得终浓度到20μg/ml的荧光标记抗体；
(3)清洗液的制备：该清洗液中含有PB，NaCl，Tween 20，该清洗液的pH值为7-9。
2. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒，其特征在于：所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物，其粒径为100-1000nm。
3. 根据权利要求2所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒，其特征在于：所述镧系元素螯合物为铕螯合物。
4. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免 疫分析试剂盒，其特征在于：所述步骤(3)中的清洗液中含有5mmol/L的PB，0.9％NaCl，0.05％Tween 20，该清洗液的pH值为7.8。
5. 权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白的非疾病诊断检测方法，其步骤包括，
(A)、标准曲线的绘制：采用基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒测定不同浓度的校准品，并根据荧光读数仪上的荧光信号值，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号值为纵坐标，绘制成标准曲线；
(B)、将待测样品加入检测反应杯内，再加入荧光标记抗体，30℃-40℃温育，用清洗液清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体；
(C)在340-380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号,检测波长为600-630nm；
(D)将所述荧光信号与步骤(A)中的标准曲线比对，获得所述待测样品的超敏C反应蛋白浓度。
6. 权利要求5所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白的非疾病诊断检测方法，其特征在于：所述步骤(A)中，浓度为0、0.05、0.5、2、5、10、25、50μg/mL的校准品中加入荧光标记抗体，37℃温育5-25min，然后用清洗液清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，所述校准品与荧光标记抗体的体积比为2-4:100。
7. 权利要求6所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白的非疾病诊断检测方法，其特征在于：所述步骤(B)中，待测样品与荧光标记抗的体积比为2-4:100，温育温度为37℃。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年11月15日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年05月06日向复审请求人发出复审通知书，指出：1. 权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）荧光标记抗体为时间分辨荧光微球与超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体通过共价键交联，制备方法为：取1mg羧基时间分辨荧光微球，加60μL 500mmol/L的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液，pH6.0，加0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加纯化水至终体积400μL，室温混匀15min；加100μL 50mmol/L氨基己酸，室温混匀30min；加1mL 100mmol/L MES pH6.0，离心清洗15000rpm 20min，弃去上清；加400μL 100mmol/L MES pH6.0，超声分离，加0.2mg N-羟基琥珀酰亚胺，加0.1mg EDC，室温混匀15min；加1mL 100mmol/L MES pH6.0缓冲液，离心清洗15000rpm 20min，弃去上清；100mmol/L MES pH6.0缓冲液恢复到1ml；然后加入超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体混匀、封闭、清洗，并用反应缓冲液稀释，获得终浓度到20μg/ml的荧光标记抗体；包被抗体还可以采用多克隆抗体；（2）权利要求1请求保护的是由检测反应杯、荧光标记抗体及清洗液组成的试剂盒；检测反应杯制备时抗体包被温度为37℃，拍干，置于37℃的干燥箱中烘干、密封保存；清洗液中含有PB，NaCl，Tween 20，清洗液的pH值为7-9。对于区别技术特征（1），对比文件2给出了采用时间分辨荧光微球与抗体结合作为标记物能够提高时间分辨荧光免疫方法的检测限，同时避免了解离-增强步骤的技术启示；对比文件4给出了在微球与抗体结合时添加氨基己酸作为手臂以减少位阻、提高检测灵敏度的技术启示，同时对比文件4中上述微球的制备过程包括先采用EDC对微球活化处理，之后连接手臂，将已伸手臂的微球连接抗体前再次用EDC进行活化处理的步骤；其余特征为本领域公知常识；区别技术特征（2）中部分特征被对比文件2公开，其余特征为本领域公知常识。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2、对比文件4以及本领域公知常识得到权利要求1请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2. 权利要求5请求保护权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白的非疾病诊断检测方法，权利要求1不具备创造性，权利要求5和对比文件1进一步的区别在于：激发波长为340-380nm，检测波长为600-630nm，该方法为非疾病诊断方法。其中，激发波长和检测波长被对比文件2及对比文件3（对比文件2的参考文献17）公开，其余特征为本领域公知常识。因此，权利要求5不具备专利法第22条第3款规定的创造性。3. 从属权利要求2的附加技术特征被对比文件2及对比文件3（对比文件2的参考文献17）公开，从属权利要求3、4、6、7的附加技术特征或者被对比文件1公开、或者被对比文件2公开、或者为本领域公知常识，因此，权利要求2-4、6、7不具备专利法第22条第3款规定的创造性。4. 对复审请求人的意见陈述进行了针对性回应。
复审请求人于2019年06月12日提交了意见陈述书和权利要求书的全文修改替换页，修改涉及：在权利要求1中加入特征“使用该免疫分析试剂盒可在5-20分钟的检测时间内完成检测”。复审请求人认为本申请具备创造性的理由为：（1）本领域技术人员没有动机将对比文件2与对比文件1结合。首先，没有证据表明使用荧光纳米颗粒作为标记物具有一定的普适性，对比文件2及其引用的文献均未提及可使用荧光纳米颗粒对超敏C-反应蛋白进行检测，对比文件2中关于荧光纳米颗粒的优点的记载本身是基于特定的技术环境，并不是个普适的结论，并非所有的荧光纳米颗粒均具有上述优点。由于对比文件2和对比文件1检测目标的结构差异很大，本领域技术人员很难预期使用荧光纳米颗粒对超敏C-反应蛋白检测能够获得很好的检测效果。其次，对比文件2仅提及采用两步基于纳米颗粒的免疫检的方法可提高检测限，而并非仅仅采用荧光纳米颗粒这一技术手段，也没有证据证明采用荧光纳米颗粒这个手段与其他手段之间并没有必然的联系，如果改变微量滴定孔的处理方式、选择不同的测试缓冲试剂或者改变纳米颗粒-抗体生物结合物的活性结合位点的数据，即便采用荧光纳米颗粒也无法保证能过获得良好的检测效果，因此，本领域技术人员在引入对比文件2的单一技术手段即荧光纳米颗粒到对比文件1中去检测超敏C-反应蛋白时，对于检测效果是没有合理的成功预期，对比文件2并未给出采用时间分辨荧光微球与抗体结合作为标记物能够提高检测限，同时避免解离-增强步骤的技术启示。（2）对于进一步与对比文件4的结合。首先，检测反应体系中引入体积相对较大的微球，从而面临空间结合位阻导致检测灵敏度降低的问题，这与对比文件2给出了采用时间分辨荧光微球与抗体结合作为标记物以提高检测灵敏度的技术启示相互矛盾，进一步验证了引入对比文件2的单一技术手段即荧光纳米颗粒到对比文件1中去检测超敏C-反应蛋白时，对于检测效果没有合理的成功预期。其次，对比文件4和对比文件1、2分别属于两种不同的检测方法，在对比文件4中可提高灵敏度的方法并不意味着转用到对比文件1、2中也必然能够提高灵敏度，本领域技术人员无法预期增加氨基己酸手臂对均相条件下纳米颗粒-抗体生物结合物的活性结合位点的数目、非特异性结合情况以及荧光测定强度等产生何种影响，是否能够提高灵敏度，也就是说，在引入对比文件4的增加氨基己酸手臂的技术手段到对比文件1中去检测超敏C-反应蛋白时，对于检测效果同样是没有合理的成功预期。再次，对比文件4没有公开权利要求1所限定的对羧基时间分辨荧光微球进行前处理的步骤，本领域技术人员基于对比文件4的明确教导没有动机去改变对比文件4所限定的羧基活化后关键pH值、改变EDC和氨基己酸的相对用量和再次活化时候的试剂以获得权利要求1所限定的前处理步骤。本申请采用特定的前处理步骤可以实现循环增加手臂，EDC和氨基己酸的用量远远超过了羧基荧光微球有效羧基量，相对长的手臂更利于降低非均相条件下的空间位阻。对比文件4中仅添加一层氨基己酸手臂，能够降低的空间位阻有限，改变本申请实施例的荧光微粒活化步骤，采用对比文件4的活化方法，补充试验结果表明，采用对比文件4的方式来添加手臂，在基于微球的杯式时间分辨荧光检测中，无法提升检测灵敏度。
此次修改提交的权利要求书如下：
“1. 一种基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒，其特征在于：该试剂盒由检测反应杯、荧光标记抗体及清洗液组成；
所述检测反应杯的固相表面包被有超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体；所述荧光标记抗体为时间分辨荧光微球与超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体通过共价键交联；
该免疫分析试剂盒的制备方法，其步骤包括，
(1)、检测反应杯的制备：将超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体稀释后37℃包被，并用封闭缓冲液封闭、拍干；置于37℃的干燥箱中烘干、密封保存；
(2)、荧光标记抗体的制备：取1mg羧基时间分辨荧光微球，加60μL 500mmol/L的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液，pH6.0，加0.2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加纯化水至终体积400μL，室温混匀15min；加100μL 50mmol/L氨基己酸，室温混匀30min；加1mL 100mmol/L MES pH6.0，离心清洗15000rpm 20min，弃去上清；加400μL 100mmol/L MES pH6.0，超声分离，加0.2mg N-羟基琥珀酰亚胺，加0.1mgEDC，室温混匀15min；加1mL 100mmol/L MES pH6.0缓冲液，离心清洗15000rpm20min，弃去上清；100mmol/L MES pH6.0缓冲液恢复到1ml；
然后加入超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体混匀、封闭、清洗，并用反应缓冲液稀释，获得终浓度到20μg/ml的荧光标记抗体；
(3)清洗液的制备：该清洗液中含有PB，NaCl，Tween 20，该清洗液的pH值为7-9；
使用该免疫分析试剂盒可在5-20分钟的检测时间内完成检测。
2. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒，其特征在于：所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物，其粒径为100-1000nm。
3. 根据权利要求2所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒，其特征在于：所述镧系元素螯合物为铕螯合物。
4. 根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒，其特征在于：所述步骤(3)中的清洗液中含有5mmol/L的PB，0.9％NaCl，0.05％Tween20，该清洗液的pH值为7.8。
5. 权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白的非疾病诊断检测方法，其步骤包括，
(A)、标准曲线的绘制：采用基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒测定不同浓度的校准品，并根据荧光读数仪上的荧光信号值，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号值为纵坐标，绘制成标准曲线；
(B)、将待测样品加入检测反应杯内，再加入荧光标记抗体，30℃-40℃温育，用清洗液清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体；
(C)在340-380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号,检测波长为600-630nm；
(D)将所述荧光信号与步骤(A)中的标准曲线比对，获得所述待测样品的超敏C反应蛋白浓度。
6. 权利要求5所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白的非疾病诊断检测方法，其特征在于：所述步骤(A)中，浓度为0、0.05、0.5、2、5、10、25、50μg/mL的校准品中加入荧光标记抗体，37℃温育5-25min，然后用清洗液清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，所述校准品与荧光标记抗体的体积比为2-4:100。
7. 权利要求6所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白的非疾病诊断检测方法，其特征在于：所述步骤(B)中，待测样品与荧光标记抗的体积比为2-4:100，温育温度为37℃。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
复审请求人于2019年06月12日答复复审通知书时提交了权利要求书的全文修改替换页，经审查，该修改符合专利法第33条的规定。本复审请求审查决定所针对的审查文本为：申请日2016年04月06日提交的说明书第1-10页、说明书附图第1-2页、说明书摘要、摘要附图，以及2019年06月12日提交的权利要求第1-7项。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果权利要求请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征，但这些区别技术特征可以由本领域技术人员基于其他对比文件公开的内容并结合公知常识而得到，并且该权利要求的技术方案并没有由于这些区别技术特征而具有预料不到的技术效果，则该权利要求请求保护的技术方案对本领域技术人员而言是显而易见的，不具备创造性。
1、权利要求1请求保护一种基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白免疫分析试剂盒。对比文件1公开了一种超敏C-反应蛋白（CRP）时间分辨荧光免疫分析法，并具体披露了（参见“摘要”、“1 材料和方法”）：采用双抗体夹心法检测血清CRP水平（1株抗CRP的单抗用于包被微孔板，另1株抗CRP的单抗用于Eu3 标记），可替代国外产品试剂盒，用于临床血清CRP的测定；材料包括：用于包被和Eu3 标记的配对CRP单克隆抗体、96孔板、Eu3 标记试剂；方法包括：固相包被抗体的制备，用50mmol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗体稀释至7mg/L，每孔200μL加入到96孔微孔板中，于4℃过夜，弃掉包被液后每孔加入封闭液（去金属离子20g/L BSA）250μL，37℃ 2h，弃掉封闭液，洗涤后真空抽干，-20℃保存；Eu3 标记物的制备，将0.5mg待标记抗体加入带有滤膜的离心管中，以8000r/min离心4min，使用标记缓冲液（50mmol/L，Na2CO3，pH9.5）重复洗涤6次，将200μL标记后的抗体和0.5mg铕标记试剂混匀后于4℃过夜；操作程序中分别洗板3次和6次（隐含公开了清洗液）。
权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）荧光标记抗体为时间分辨荧光微球与超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体通过共价键交联，制备方法为：取1mg羧基时间分辨荧光微球，加60μL 500mmol/L的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液，pH6.0，加0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加纯化水至终体积400μL，室温混匀15min；加100μL 50mmol/L氨基己酸，室温混匀30min；加1mL 100mmol/L MES pH6.0，离心清洗15000rpm 20min，弃去上清；加400μL 100mmol/L MES pH6.0，超声分离，加0.2mg N-羟基琥珀酰亚胺，加0.1mg EDC，室温混匀15min；加1mL 100mmol/L MES pH6.0缓冲液，离心清洗15000rpm 20min，弃去上清；100mmol/L MES pH6.0缓冲液恢复到1ml；然后加入超敏C反应蛋白单克隆抗体或多克隆抗体混匀、封闭、清洗，并用反应缓冲液稀释，获得终浓度到20μg/ml的荧光标记抗体；包被抗体还可以采用多克隆抗体；（2）权利要求1请求保护的是由检测反应杯、荧光标记抗体及清洗液组成的试剂盒；检测反应杯制备时抗体包被温度为37℃，拍干，置于37℃的干燥箱中烘干、密封保存；清洗液中含有PB，NaCl，Tween 20，清洗液的pH值为7-9；（3）使用该免疫分析试剂盒可在5-20分钟的检测时间内完成检测。基于上述区别技术特征，本申请实际解决的技术问题是：如何简化时间分辨荧光检测步骤、提高检测灵敏度。
对于上述区别技术特征（1），首先，对比文件2公开了一种采用纳米颗粒标记技术的超敏感时间分辨荧光免疫法检测游离前列腺特异性抗原的方法，并具体披露了（参见第1269页左栏、第1270-1271、1273-1274页）：采用非竞争性、两步免疫测定，铕（III）螯合物纳米颗粒包被抗PSA单克隆抗体，该方法在低荧光微量滴定孔中进行，该微量滴定孔中包被另一抗PSA单克隆抗体，采用标准的时间分辨微量滴定板荧光计在孔底部直接读取铕（III）的荧光；在DELFIA技术中采用的高荧光螯合物也能够用于荧光镧系（III）螯合物纳米颗粒，因为胶乳内部是疏水环境，由此保护荧光螯合物免受环境影响，如溶剂淬灭，并稳定动力学较弱的复合物；具体采用高荧光铕（III）螯合染色、单分散、羧酸盐修饰的Fluoro-MaxTM聚苯乙烯纳米颗粒（粒径为107nm，1.8羧酸/nm2），单克隆抗体5A10与活化纳米颗粒共价偶联；基于纳米颗粒的两步免疫分析法的检测限较相应的DELFIA方法有显著提高；与解离-增强或基于酶的方法相比，来自孔底部荧光的表面读数检测增加了免疫测定的变化。由此可见，对比文件2给出了采用时间分辨荧光微球与抗体结合作为标记物能够提高时间分辨荧光免疫方法的检测限，同时避免了解离-增强步骤的技术启示，当本领域技术人员面对如何简便、高灵敏度的对超敏C反应蛋白进行检测时，有动机遵循对比文件2的教导，采用羧基修饰的时间分辨荧光微球与超敏C反应蛋白单克隆抗体共价交联作为荧光标记抗体。其次，对于荧光标记抗体的具体制备，对比文件4公开了一种高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法，并具体披露了（参见说明书第2-4页）：使微球表面全羧化，常温下在表面羧基化的微球液中按1%浓度含有效羧基量为0.005mM计加入EDC（0.005*192*40%）mg量，在pH<6.5条件下活化20分钟，将ph上调至7.0-7.2，加入正氨基己酸（0.005*132*60%）mg量，在室温下作用2小时将ph上调至7.5，在4℃过夜，次日对0.025m，ph7.0的nacl溶液透析两次；将上述已伸手臂的微球液按15%>
对于区别技术特征（2），首先，对比文件2还公开了：清洗液为5mmol/L Tris-HCl（pH7.8），9g/L NaCl，0.05g/L Tween 20（参见第1270页右栏第3段）；微量滴定板包被抗体后，吸干，在层流罩中干燥，储存在具有干燥剂的密封包装中（参见第1271页右栏第3段）。在此基础上，PB、Tris-HCl均是清洗液中常用的缓冲液，清洗液采用PB、NaCl、Tween 20也是常规选择，本领域技术人员可以根据具体的实验对象进行选取。包被的固相载体采用反应杯，包被温度、拍干、烘干等具体操作均为本领域的常规选择。将检测中所涉及的反应杯、荧光标记抗体、清洗液组装形成试剂盒以方便销售和使用，为本领域的惯用技术手段。
对于区别技术特征（3），对于本领域技术人员来说，使用试剂盒完成检测的时间取决于试剂盒的组成、操作方法步骤等因素，结合对区别技术特征（1）和（2）的评述可知，该试剂盒的组成对于本领域技术人员来说是显而易见的，那么使用该试剂盒进行检测分析时所用的时间也是可以合理预期和选取的，不需要付出创造性劳动。
由此可见，在对比文件1的基础上结合对比文件2、对比文件4和本领域公知常识得到权利要求1请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具有突出的实质性特点，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2、权利要求2对权利要求1作了进一步限定，对比文件2公开了：高荧光铕（III）螯合染色、单分散、羧酸盐修饰的Fluoro-MaxTM聚苯乙烯纳米颗粒（粒径为107nm）购自于Seradyn公司，该纳米颗粒的荧光特性以及标准在之前的出版物（10，17）中已被充分描述（参见第1270页右栏第3段）。而对比文件3（对比文件2中提到的参考文献17）公开了：内部染色、单分散、羧基修饰的Fluoro-Max聚苯乙烯纳米颗粒购自于Seradyn，该纳米颗粒含有铕（III）螯合物（参见第2255页右栏第3段）。由此可知对比文件2中采用的纳米颗粒内部填充了铕（III）螯合物。因此，在权利要求1不具备创造性的基础上，从属权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、权利要求3对权利要求2作了进一步限定，其附加技术特征已被对比文件2所公开：铕（III）螯合物聚苯乙烯纳米颗粒（参见第1270页右栏第3段）。因此，在权利要求2不具备创造性的基础上，从属权利要求3也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
4、权利要求4对权利要求1作了进一步限定，对比文件2公开了：清洗液为5mmol/L Tris-HCl（pH7.8），9g/L NaCl，0.05g/L Tween 20（参见第1270页右栏第3段）。在此基础上，PB、Tris-HCl均是清洗液中常用的缓冲液，清洗液采用一定浓度和pH值的PB、NaCl、Tween 20也是常规选择，本领域技术人员可以根据具体的实验对象进行选取，无需创造性劳动。因此，在权利要求1不具备创造性的基础上，从属权利要求4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
5、权利要求5请求保护权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光超敏C反应蛋白的非疾病诊断检测方法。参见权利要求1的评述，权利要求1不具备创造性。同时，对比文件1公开了一种超敏C-反应蛋白（CRP）时间分辨荧光免疫分析法，并具体披露了（参见“摘要”、“1 材料和方法”、“2 结果”）：参考标准品的制备，用含50mmol/L的pH7.4 Tris-HCl缓冲液，将CRP抗原配制成0，1，10，100，500，1000mg/L系列浓度的标准溶液，每瓶1mL分装冻干后-20℃保存；操作程序，向包被板中加入25μL参考标准品或血清样品，同时加入200μL反应缓冲液，室温孵育1h，洗板3次，再加入1：50稀释的Eu3 标记物200μL，37℃孵育30min，洗板6次，最后加入200μL增强液振摇5min后由Auto-Delfia 1235系统检测荧光值；标准曲线由Auto Delfia1235系统自带的双对数函数处理，由图1可知，标准曲线以标准品浓度为横坐标、荧光信号值为纵坐标；灵敏度：以零参考标准品测定值的均值加2倍的标准差所得的荧光值，代入标准曲线方程求得，本领域技术人员可以直接地、毫无意义地确定将待测样品的荧光信号与标准曲线比对，获得待测样品的超敏C反应蛋白浓度。权利要求5和对比文件1进一步的区别在于：激发波长为340-380nm，检测波长为600-630nm，该方法为非疾病诊断方法。然而，对比文件2公开了纳米颗粒的铕（III）时间分辨荧光检测波长为615nm（参见第1271页右栏第1段），对比文件3（对比文件2中提到的参考文献17）公开了：内部染色、单分散、羧基修饰的Fluoro-Max聚苯乙烯纳米颗粒含有铕（III）螯合物，荧光激发波长为340nm，发射波长为613nm（参见第2255页右栏第3段）。此外，将该检测方法用于非疾病诊断是本领域的惯用技术手段。因此，权利要求5请求保护的技术方案不具有突出的实质性特点，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
6、权利要求6对权利要求5作了进一步限定，对比文件1公开了：将CRP抗原配制成0，1，10，100，500，1000mg/L系列浓度的标准溶液，向包被板中加入25μL参考标准品，同时加入200μL反应缓冲液，再加入1：50稀释的Eu3 标记物200μL，37℃孵育30min，洗板6次，即加入标准品之后加入荧光标记抗体，37℃温育，然后清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗（隐含公开了清洗液）（参见“1.2 方法”），至于参考标准品的浓度范围、温育5-25min，本领域技术人员可以根据具体的实验对象进行选取，校准品与荧光标记抗体的体积比例可以根据各试剂浓度、稀释倍数结合实验具体需要进行选取，无需创造性劳动。因此，在权利要求5不具备创造性的基础上，从属权利要求6也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
7、权利要求7对权利要求6作了进一步的限定，对比文件1公开了：向包被板中加入25μL血清样品，同时加入200μL反应缓冲液，再加入1：50稀释的Eu3 标记物200μL，37℃孵育（参见“1.2 方法”），至于待测样品与荧光标记抗体的体积比例，本领域技术人员可以根据各试剂浓度、稀释倍数结合实验具体需要进行选取，无需创造性劳动。因此，在权利要求6不具备创造性的基础上，从属权利要求7也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）对复审请求人相关意见的评述
对于复审请求人在答复复审通知书时的意见陈述，合议组认为：
（1）对于对比文件1与对比文件2的结合。首先，对比文件2明确公开了使用荧光纳米颗粒作为标记物相比于传统荧光标记具有优点的机理：因为胶乳内部是疏水环境，由此保护荧光螯合物免受环境影响，如溶剂淬灭，并稳定动力学较弱的复合物。相比于传统荧光标记，荧光纳米颗粒作为标记物带来的优点是荧光纳米颗粒自身的特性所导致的，与将其应用于何种检测体系没有直接的、必然的联系，并且，对比文件2引用的多篇文献已经报道了使用荧光纳米颗粒作为标记物已经应用于对多种目标物质进行检测，进一步证明了采用荧光纳米颗粒作为免疫荧光分析中的标记物具有一定的普适性，此外，没有任何理由和证据表明荧光纳米颗粒作为标记物应用于免疫荧光分析时会受到具体被检测目标物质的限制，也没有任何理由和证据表明其无法应用于超敏C反应蛋白荧光免疫分析。其次，尽管对比文件2中还提及了其他手段对改善检测限的影响，然而，结合上述分析，本领域技术人员可知，采用荧光纳米颗粒作为标记物的优点是由荧光纳米颗粒自身的特性所导致的，与其他手段之间并没有必然的联系，因此，对比文件2给出了采用时间分辨荧光微球与抗体结合作为标记物能够提高时间分辨荧光免疫方法的检测限，同时避免了解离-增强步骤的技术启示，基于对比文件2的教导，本领域技术人员有动机采用羧基修饰的时间分辨荧光微球与超敏C反应蛋白单克隆抗体共价交联作为荧光标记抗体。
（2）对于对比文件1、2进一步与对比文件4的结合。首先，如上述第（1）点，本领域技术人员基于对比文件2给出的技术启示，有动机采用荧光纳米颗粒代替对比文件1中的传统荧光标记Eu3 标记物，即采用羧基修饰的时间分辨荧光微球与超敏C反应蛋白单克隆抗体共价交联作为荧光标记抗体，此时，由于检测反应体系中引入了体积相对较大的微球，从而面临着空间结合位阻导致检测灵敏度降低的问题，因此，本领域技术人员有动机寻找提高抗体自由度、减少空间结合位阻的技术手段，而对比文件4则给出了在微球表面增加氨基己酸手臂，提高连接于手臂一端的另一抗体的空间自由度，减少免疫结合时的空间位阻，提高检测灵敏度的技术启示，即对比文件2和对比文件4对于检测效果均给出了合理的成功预期，技术启示并不存在矛盾。其次，当在对比文件1中引入羧基修饰的时间分辨荧光微球与超敏C反应蛋白单克隆抗体共价交联作为荧光标记抗体时，与对比文件4一样，同属于基于微球的免疫检测方式，在免疫反应时均使用微球与抗体连接，均面临空间结合位阻导致检测灵敏度降低的问题，而对比文件4则给出了添加氨基己酸作为连接微球和抗体的手臂的技术启示，本领域技术人员有动机在在时间分辨荧光微球和超敏C反应蛋白抗体之间添加氨基己酸手臂，由于对比文件4中添加手臂后也涉及到抗体-抗原免疫之间的结合，本领域技术人员可以预期手臂的添加通常不会对抗体-抗原之间的特异性结合带来明显的影响，检测体系中所添加的氨基己酸手臂也不会对荧光测定带来明显的干扰，其效果是合理可以预期的。再次，对于采用特定的前处理步骤实现手臂循环增加，本申请说明书中并没有提供实验数据证明EDC和氨基己酸用量的不同及反应环境控制的不同会对手臂长度造成影响，更没有实验数据证明对检测灵敏度造成的影响，即，本申请所采用的特定EDC和氨基己酸的用量具有更好的降低空间位阻进而提高检测灵敏度的技术效果并未记载于专利申请文件中，也无法从原始申请文件记载的内容直接地、毫无意义地确定，因此，复审请求人引入上述主张来支持本申请的技术方案具备创造性，不能被接受。而由对权利要求1的评述可知，对比文件4中添加手臂时先采用EDC对表面羧基化的微球活化处理，之后连接氨基己酸手臂，再次用EDC活化处理，然后将抗体连接到手臂，即已经公开了本申请中对羧基微球进行活化、连接手臂、再次活化、连接抗体的基本步骤，且两者均采用氨基己酸作为手臂，尽管本申请在试剂和步骤细节上有所不同，然而，本领域技术人员具有针对不同的实验对象和实验环境来选取合适的试剂和操作步骤的能力，这属于本领域技术人员的普通实验技能，也就是说，基于对比文件4的教导，本领域技术人员在时间分辨荧光微球和超敏C反应蛋白抗体之间添加氨基己酸手臂时，并不会完全照搬对比文件4前处理步骤中的操作方式，而是可以结合公知常识进行一些调整。EDC是氨基和羧基形成酰胺键的缩合反应中常用的交联试剂，EDC常和NHS联用以提高偶联效率，pH6.0的MES缓冲液为该偶联反应体系中的常用缓冲液，本领域技术人员可以根据具体需要采用EDC、NHS活化处理并相应的选择和调整试剂用量和条件参数以便于微球-手臂-抗体之间的偶联，其效果也是可以预期的，不需要付出创造性劳动。
综上，对于复审请求人的意见陈述，合议组不予支持。
基于以上事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年07月27日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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