发明创造名称：新型靶向纳米粒子及其制备方法和用途
外观设计名称：
决定号：187227
决定日：2019-08-20
委内编号：1F257185
优先权日：
申请（专利）号：201510528034.2
申请日：2015-08-25
复审请求人：徐州医科大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：何瑜
合议组组长：陈红霞
参审员：白雪
国际分类号：A61K47/34,A61K41/00,A61P35/00
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：如果要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术存在区别技术特征，且现有技术中存在将该区别技术特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，使本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的技术方案，且该方案未产生预料不到的技术效果，则要求保护的技术方案不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510528034.2，名称为“新型靶向纳米粒子及其制备方法和用途”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请人为徐州医科大学（2018年05月28日由徐州医学院变更而来），申请日为2015年08月25日，公开日为2015年11月11日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年06月27日发出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：权利要求1-2不符合专利法第22条第3款创造性的规定。驳回决定所依据的文本为：2015年08月25日即申请日提交的说明书第1-9页，说明书附图第1-7页和说明书摘要，2018年05月22日提交的权利要求第1-2项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种新型靶向纳米粒子，其特征在于：所述纳米粒子由叶酸靶向、生物可降解的正电子聚合物载体 PEI-CyD-FA(H1) 荷载小片段发夹样结构的双链 DNA 分子构成；
所述小片段发夹样结构的双链 DNA 分子 <>
所述小片段发夹样结构的双链 DNA 分子为新型放射增敏剂 Dbait 分子，其大小为 32bp；
所述纳米粒子的粒径为100～200 纳米，Zeta 电位为 10mV～20mV；
所述的新型靶向纳米粒子的制备方法，包括以下步骤 ：
(1) 取正电子聚合物载体 PEI-CyD-FA(H1) 溶于灭菌双蒸水中，得溶液 1，室温、避光静置 5 分钟 ；
(2) 取小片段发夹样结构的双链 DNA 分子 Dbait 溶于灭菌双蒸水中，得溶液 2，室温静置 5 分钟 ；
(3) 避光、漩涡振荡下将溶液 1 滴入溶液 2 中，继续漩涡振荡 15 秒，使溶液 1 与溶液 2充分混匀，避光、室温静置 20 分钟后得到新型靶向纳米粒子 H1/Dbait，即可用于后续相关实验。
2. 一种权利要求 1 所述的新型靶向纳米粒子用于制备前列腺癌或结直肠癌或肝癌或肺癌或黑色素瘤或乳腺癌或卵巢癌或胰腺癌或食管癌或胃癌或子宫癌或喉癌或甲状腺癌放射治疗药品中的用途。”
驳回决定指出：对比文件1（“Comparison of distribution and activity of nanoparticles with short interfering DNA(Dbait) in various living systems”，N Berthault等，《Cancer gene therapy》，第18期，第695-706页，20110729）公开了一种放射增敏剂Dbait分子，其为大小为32bp的双链小干扰DNA分子。为将其转运入肿瘤细胞内，研究人员将两种转运方式进行了比较，其中之一是将Dbait分子以PEI转染细胞，另一为将Dbait分子与胆固醇进行共价偶联进行转运，其中将Dbait分子以PEI转染细胞的方式具有较高的毒性，其粒径为125-140nm。PEI负载Dbait分子的方法为：将基因载体PEI和Dbait分子分别以10%蔗糖或150mM的NaCl溶液进行混合以得到不同的N/P比。具体的例子是：300uL的体系先分别将PEI和Dbait分子稀释成150uL再混合得到。另外，本领域技术人员熟知，Dbait分子是具有发夹样结构的双链DNA分子。因此，权利要求1与对比文件1公开的内容相比，区别特征在于：以基因载体PEI-CyD-FA(H1)替代了基因载体PEI，并限定了纳米粒子的Zeta电位以及纳米粒子的制备方法步骤。由此可确定其实际解决的技术问题是：如何靶向性、高效地将小片断DNA分子转染导入宿主细胞。对于上述区别特征，对比文件2（“偶合靶向配体的β-环糊精—低分子量聚乙烯亚胺作为基因载体系统的研究”，刘君，《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》，第2008年第11期，E079-62，20081115）公开了如下内容：常见的非病毒载体主要包括阳离子脂质体，阳离子多聚物和阳离子多肽等。其中聚乙烯亚胺(PEI)是目前研究颇为成功的聚阳离子非病毒载体材料，其特殊的结构能够很好绑定质粒DNA，保护DNA进入细胞，在很宽的生理pH值范围质子化，释放DNA，取得较高的转基因效率。但聚乙烯亚胺的转染效率和细胞毒性均随分子量的增加而增大，并且直接体内应用会导致红细胞的聚集，与血液中的白蛋白等发生非特异性结合，导致聚合体的形成，一般不单独做为基因药物的载体。所以需要对PEI进行修饰。本研究选用环糊精（CyD）作为骨架，经过表面修饰后将低分子量的PEI600连接起来，制成基因药物载体的母体。结构中的环糊精上羟基可以增强载体和细胞膜的黏附作用，其柔软的结构可以偕同PEI顺利穿透细胞膜屏障。合成的母体材料具有毒性低、安全性高和转染效率好等特点。在此研究基础上，为增加载体的靶向性、提高细胞的转染效率，我们选用不同小分子配体对载体进行修饰，这些配体包括叶酸、寡肽和小分子药物炔诺酮。键合靶向配体后，载体的特点更为明显，可达到毒性低、转染效率高、肿瘤特异性强等特点；转染实验（以pEGFP质粒作为模型）表明，载体经叶酸配体修饰后转染效率得到很大提高，FA-PEI600-CyD聚合物是一种有效的靶向性基因载体；实验结果表明，新合成的FA-PEI600-CyD聚合物毒性较低，转染效率较高，而且叶酸配体的接入能增加载体复合物在肝脏内的富集。本领域技术人员在对比文件2的教导下，有动机以毒性低、转染效率高、肿瘤特异性强的基因载体替代对比文件1的中基因载体PEI。另外，纳米粒子的Zeta电位是本领域技术人员采用本领域常规实验手段可以测定的。而对于纳米粒子的制备方法步骤，如分别将载体PEI-CyD-FA(H1)和Dbait分别溶于灭菌双蒸水中，室温、避光静置5分钟，再漩涡振荡避光混匀、室温静置20分钟得到新型靶向纳米粒子 H1/Dbait等，则是本领域技术人员在对比文件1公开内容的基础上，容易做出的常规适应性调整，其为技术方案带来的技术效果也是可以预料的。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。对比文件1已经公开了Dbait分子具有放射增敏的作用。同时，对比文件3（“新型放射增敏剂Dbait的研究进展”，温林春等，《中华放射肿瘤学杂志》，第19卷第2期，第142-144页，20100331）指出“Dbait分子的放射增敏作用在各种肿瘤中无明显差异，如宫颈癌、头颈癌肿瘤脑胶质母癌、成纤维细胞癌等”。本领域技术人员在其教导下，有动机将权利要求1所述的新型靶向纳米粒子用于制备治疗各种肿瘤的药品。因此，权利要求2不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人徐州医科大学（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2018年07月27日向专利局复审和无效审理部提出了复审请求，但并未修改申请文件。复审请求人认为：1）本申请的创新点是PEI-CyD-FA(H1)荷载的Dbait是带有发夹样结构的小分子双链DNA，通过本申请技术手段最终形成的是具有强肿瘤特异性的纳米粒子形式的辐射增敏剂，且在转染制备过程中仅使用无毒的灭菌双蒸水作为溶剂，PEI-CyD-FA(H1)与Dbait分子通过正负电荷相互吸引作用，自动形成纳米粒子，所形成的H1/Dbait纳米粒子也具有较低的毒性，在说明书的实施例4中已予以验证。因此，对比文件1的技术方案不适用于肿瘤治疗的应用，而本申请在无毒性上达到了对于肿瘤治疗的前提要求。2）由于蔗糖溶液密度大，容易促进DNA的沉淀，并且DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度是不同的，而本申请选用PEI-CyD-FA(H1)与Dbait分别溶于灭菌双蒸水。不同溶剂的选用对溶解性、析出度影响较大，确定浓度的蔗糖或NaCl溶液对于对比文件1的技术方案至关重要，不能随意取代。由于溶剂的离子强度直接影响着聚阳离子载体和DNA的聚集程度，蔗糖和NaCl的离子强度高于双蒸水，因此，双蒸水条件下形成的纳米粒子更具有稳定的粒径大小，具有更强的高通透、高滞留效应。本申请采用的灭菌双蒸水是基于PEI-CyD-FA(H1)与Dbait转染技术的特性，经过了大量探索性试验和创造性劳动进行验证和总结得出的，并非通过本领域常规技术手段进行简单的机械性调整就可以得到。3）虽然对比文件2以FA-PEI600-CyD作为载体，但其转染的是质粒DNA，而本申请转染的是小片段DNA分子Dbait(32bp)，并且本申请技术方案所得为纳米粒子，对比文件2用FA-PEI600-CyD荷载质粒DNA不属于纳米粒子范畴。该纳米粒子在递送Dbait过程中，通过胞吞及涵体逃逸，快速入核，发挥放射增敏作用，而国外研究的质粒，需加喹啉才能逃逸，转染质粒DNA不符合条件。4）本申请的技术方案需要稳定的构建条件，例如合适的N/P比值、合适的溶媒选择等。说明书实施例1提及了一系列N/P比值。聚阳离子载体与DNA在低N/P比值时易聚集成粒径较大的复合物，主要是由于两者之间的范德华力作用；而高N/P比值时，由于聚阳离子载体与DNA表面较高电荷所产生的静电作用，使其聚集程度低，在生理条件下更稳定；但是随着N/P比值的增加，纳米粒子的毒性会相应的增加。因此，若要保证低毒性、高转染效率，只在N/P比值的筛选这一项上，本申请就投入了大量精力用于探索性的试验和创造性劳动进行验证和总结。5）本申请选择辐射较抗拒的肿瘤前列腺癌细胞株PC3进行研究，在体内外实验中，本申请的辐射增敏剂能抑制所有肿瘤细胞放疗后DNA损伤修复的整条通路，特别是在前列腺癌的治疗中取得了较好的治疗效果。因此，本申请具有创造性。
经形式审查合格，专利复审委员会于2018年08月02日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：对比文件1公开了PEI负载Dbiat分子的事实和相应方法，对比文件2公开了改进的基因载体FA-PEI600-CyD，且明确了该复合载体各组成部分所起作用，即PEI负载基因具有毒性较高；应用体内转基因效率低，在特定细胞或组织的靶向性较差的缺点，因此利用CyD来降低其毒性，利用FA来提高其在特定细胞或组织的靶向性。虽然对比文件2负载的是分子量较大的质粒DNA，其研究相对成熟，本申请负载的是大小为32bp发夹样结构的双链DNA分子，但无论是对比文件1-2或是本申请，其负载基因均依据的是PEI的正电荷与核酸的负电荷而形成复合物。因此，对比文件2给出了相应技术启示。而对于申请人关于基因负载时溶剂的区别，双蒸水同蔗糖溶液、NaCl溶液一样可以溶解DNA，本领域技术人员可以经有限对比实验和分析，进行常规选择，且本申请也未证明使用双蒸水所取得的技术效果。因此，本申请不具备创造性，坚持原驳回决定。
随后，专利局复审和无效审理部成立合议组对本案进行审理。合议组于2019 年02月25日向复审请求人发出复审通知书，指出：对比文件1公开了一种小的双链DNA分子即Dbait分子，其可削弱受损伤染色体的修复因而可用于提供一种在具有放疗抗性的肿瘤放射治疗中提高其有效性的新方法，即Dbait已被成功用作肿瘤对放射的增敏剂，其为大小为32bp的双链DNA分子。为将其转运入肿瘤细胞内，研究人员将两种纳米粒子的转运方式进行了比较，其中之一是将Dbait分子以聚阳离子聚合物PEI转染细胞，另一为将Dbait分子与胆固醇进行共价偶联形成coDbait进行转染，尽管最有效的转染方式是以PEI的方式，但Dbait分子以PEI转染细胞的方式具有较高的毒性。Dbait-PEI复合物粒子的粒径为125-140nm。PEI负载Dbait分子的方法为：将基因载体PEI和Dbait分子分别以10%蔗糖或150mM的NaCl溶液进行稀释以得到不同的N/P比。因此，权利要求1与对比文件1相比，区别技术特征在于：1）以基因载体PEI-CyD-FA(H1)替代了单纯的基因载体PEI，并限定了纳米粒子的Zeta电位；2）进一步限定了纳米粒子的制备方法中用灭菌双蒸水而非蔗糖或NaCl溶液分别溶解PEI-CyD-FA(H1)和Dbait及溶解后静置温度和时间，以及二者混合的方式、时间和静置温度及时间。确定权利要求1实际解决的技术问题是：如何降低PEI作为基因载体的毒性同时提高其靶向性和转染效率从而使其能安全、高效地将小片断DNA分子Dbait转染导入宿主细胞。对于区别特征1），对比文件2给出了具有较高转基因效率的PEI因其细胞毒性一般不单独作为基因药物载体，而通过环糊精（CyD）表面修饰PEI合成的母体材料具有毒性低、安全性高和转染效率好等特点，进一步通过选用叶酸等小分子配体对载体进行修饰可增加载体的靶向性、提高细胞的转染效率和低毒性的明确技术启示。本领域技术人员在对比文件2的教导下，在面对如何降低PEI作为基因载体的毒性同时提高其靶向性和转染效率从而使其能安全、高效地将小片断DNA分子Dbait转染导入宿主细胞的技术问题时，容易想到结合对比文件2的启示将毒性低、转染效率高、肿瘤特异性强的基因载体PEI-CyD-FA(H1)替代对比文件1中单纯的有毒性的基因载体PEI。至于纳米粒子的Zeta电位则是本领域技术人员采用本领域常规实验手段可以测定的。对于区别特征2），无论是本申请采用的灭菌双蒸水还是对比文件1中使用的蔗糖或NaCl溶液均为已知的可以溶解DNA的溶剂（参见公知常识性证据1：《生物化学实验指导》，张桦主编，中国农业大学出版社，2014年08月第1版，第181页第2行，第182页步骤（8）等），至于制备过程中涉及的室温、避光静置5分钟，再漩涡振荡避光混匀、室温静置20分钟等则是本领域技术人员在对比文件1公开的制备方法基础上根据具体情况和实际需要容易作出的常规适应性选择和调整。因此，权利要求1相对于对比文件1和2不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。同时，对比文件1已经公开了Dbait分子可以作为肿瘤对放射的增敏剂。而对比文件3给出了Dbait分子对肿瘤放射增敏作用的机制并明确了基于该机制Dbait分子的放射增敏作用在各种肿瘤中无明显差异，本领域技术人员在其教导下，有动机尝试将权利要求1所述的新型靶向纳米粒子用于制备成前列腺癌、结肠癌等各种常见肿瘤类型的放射治疗药品从而得到权利要求2的技术方案。同时，本申请说明书中也仅对前列腺癌细胞株PC3的放射增敏治疗效果作了相应的验证，且并未与其他癌症作出相应的对比，由此无法看出其在治疗前列腺癌方面产生了预料不到的技术效果。因此，当权利要求1的靶向纳米粒子如上评述不具备创造性时，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
针对上述复审通知书，复审请求人于2019年04月02日提交了意见陈述书，但未修改申请文件。此次意见陈述书内容与提交复审请求时意见陈述的内容基本相同，新增意见仅在于复审请求人认为：对比文件2中新合成的成品对具体肿瘤细胞的药用疗效并没有具体的数据研究，其肿瘤特异性的效果不明显。因此，本申请权利要求1-2具有创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在复审阶段未修改申请文件，因此，本复审请求审查决定所针对的审查文本与驳回决定所依据的审查文本相同，即：2015年08月25日即申请日提交的说明书第1-9页，说明书附图第1-7页和说明书摘要，2018年05月22日提交的权利要求第1-2项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款的规定，如果要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术存在区别技术特征，且现有技术中存在将该区别技术特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，使本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的技术方案，且该方案未产生预料不到的技术效果，则要求保护的技术方案不具备创造性。
具体到本申请，权利要求1请求保护一种新型靶向纳米粒子，其特征在于：所述纳米粒子由叶酸靶向、生物可降解的正电子聚合物载体 PEI-CyD-FA(H1) 荷载小片段发夹样结构的双链 DNA 分子构成；所述小片段发夹样结构的双链 DNA 分子 <50bp；所述小片段发夹样结构的双链 dna="" 分子为新型放射增敏剂="" dbait="" 分子，其大小为="" 32bp；所述纳米粒子的粒径为100～200="" 纳米，zeta="" 电位为="" 10mv～20mv；所述的新型靶向纳米粒子的制备方法，包括以下步骤="" ：(1)="" 取正电子聚合物载体="" pei-cyd-fa(h1)="" 溶于灭菌双蒸水中，得溶液="" 1，室温、避光静置="" 5="" 分钟="" ；(2)="" 取小片段发夹样结构的双链="" dna="" 分子="" dbait="" 溶于灭菌双蒸水中，得溶液="" 2，室温静置="" 5="" 分钟="" ；(3)="" 避光、漩涡振荡下将溶液="" 1="" 滴入溶液="" 2="" 中，继续漩涡振荡="" 15="" 秒，使溶液="" 1="" 与溶液="" 2充分混匀，避光、室温静置="" 20="" 分钟后得到新型靶向纳米粒子="">
对比文件1公开了一种小的双链DNA分子即Dbait分子，其可削弱受损伤染色体的修复因而可用于提供一种在具有放疗抗性的肿瘤放射治疗中提高其有效性的新方法，即Dbait已被成功用作肿瘤对放射的增敏剂，其为大小为32bp的双链DNA分子。为将其转运入肿瘤细胞内，研究人员将两种纳米粒子的转运方式进行了比较，其中之一是将Dbait分子以聚阳离子聚合物PEI转染细胞，另一为将Dbait分子与胆固醇进行共价偶联形成coDbait进行转染，尽管最有效的转染方式是以PEI的方式，coDbait的方式为达到相同的抗肿瘤效果不仅需要十倍以上更高的量，且需要用氯喹预处理，但与Dbait/PEI转染方式相比，coDbait转染方式具有低得多的有效剂量/毒性剂量比率，即Dbait分子以PEI转染细胞的方式具有较高的毒性。Dbait-PEI复合物粒子的粒径为125-140nm。PEI负载Dbait分子的方法为：将基因载体PEI和Dbait分子分别以10%蔗糖或150mM的NaCl溶液进行稀释以得到不同的N/P比。具体的例子是：300uL的体系先分别将PEI和Dbait分子稀释成150uL再混合得到（参见对比文件1标题，摘要，第695页左栏第1段，第696页左栏第3段，第697页右栏第3段，第705页左栏第2段）。
因此，权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于：1）权利要求1以基因载体PEI-CyD-FA(H1)替代了单纯的基因载体PEI，并限定了纳米粒子的Zeta电位；2）权利要求1进一步限定了纳米粒子的制备方法中用灭菌双蒸水而非蔗糖或NaCl溶液分别溶解PEI-CyD-FA(H1)和Dbait及溶解后静置温度和时间，以及二者混合的方式、时间和静置温度及时间。基于上述区别技术特征可确定权利要求1的技术方案实际解决的技术问题是：如何降低PEI作为基因载体的毒性同时提高其靶向性和转染效率从而使其能安全、高效地将小片断DNA分子Dbait转染导入宿主细胞。
对于上述区别技术特征1），对比文件2公开了常见的非病毒载体主要包括阳离子脂质体，阳离子多聚物和阳离子多肽等。其中聚乙烯亚胺(PEI，polyethylenimine)是目前研究颇为成功的聚阳离子非病毒载体材料，其特殊的结构能够很好绑定质粒DNA，保护DNA进入细胞，在很宽的生理pH值范围质子化，释放DNA，取得较高的转基因效率。但聚乙烯亚胺的转染效率和细胞毒性均随分子量的增加而增大，并且直接体内应用会导致红细胞的聚集，与血液中的白蛋白等发生非特异性结合，导致聚合体的形成，一般不单独做为基因药物的载体。所以需要对PEI进行修饰。本研究选用β-环糊精（β-CyD）作为骨架，经过表面修饰后将低分子量的PEI连接起来，制成基因药物载体的母体。结构中β-环糊精上的羟基可以增强载体和细胞膜的黏附作用，其柔软的结构可以偕同PEI顺利穿透细胞膜屏障。合成的母体材料具有毒性低、安全性高和转染效率好等特点。在此研究基础上，为增加载体的靶向性、提高细胞的转染效率，我们选用不同小分子配体对载体进行修饰，这些配体包括叶酸、寡肽和小分子药物炔诺酮。键合靶向配体后，载体的特点更为明显，可达到毒性低、转染效率高、肿瘤特异性强等特点；转染实验（以pEGFP质粒作为模型）表明，载体经叶酸配体修饰后转染效率得到很大提高，FA-PEI600-β-CyD聚合物是一种有效的靶向基因载体；实验结果表明，新合成的FA-PEI600-β-CyD聚合物毒性较低，转染效率较高，而且叶酸配体的接入能增加载体复合物在肝脏内的富集。对PEI600-β-CyD的粒径分析可看出，在低N/P比下，复合物的粒径较小分布在100nm左右。随着N/P比的增加，复合物最大粒径出现在N/P=50粒径约为176±11.5nm。在整个试验浓度范围内，复合物的粒径整体分布比较均匀没有出现粒子聚集，说明β-CyD修饰的PEI能增加载体的稳定性，所合成骨架材料PEI600-β-CyD呈良好的线型结构，并具有很强的DNA结合能力（参见对比文件2标题，摘要，第23，35，37页）。由此可见，对比文件2给出了具有较高转基因效率的PEI因其细胞毒性一般不单独作为基因药物载体，而通过环糊精（CyD）表面修饰PEI合成的母体材料具有毒性低、安全性高和转染效率好等特点，进一步通过选用叶酸等小分子配体对载体进行修饰可增加载体的靶向性、提高细胞的转染效率和低毒性的明确技术启示。本领域技术人员在对比文件2的教导下，在面对如何降低PEI作为基因载体的毒性同时提高其靶向性和转染效率从而使其能安全、高效地将小片断DNA分子Dbait转染导入宿主细胞的技术问题时，容易想到结合对比文件2的启示将毒性低、转染效率高、肿瘤特异性强的基因载体PEI-CyD-FA(H1)替代对比文件1中单纯的有毒性的基因载体PEI。至于纳米粒子的Zeta电位则是本领域技术人员采用本领域常规实验手段可以测定的。
对于区别技术特征2），由于对比文件1已公开将基因载体PEI和小分子DNA即Dbait分子分别以10%蔗糖或150mM的NaCl溶液进行稀释后再混合得到的制备方法，至于其中溶剂的差异，无论是本申请采用的灭菌双蒸水还是对比文件1中使用的蔗糖或NaCl溶液均为已知的可以溶解DNA的溶剂（参见公知常识性证据1，第181页第2行，第182页步骤（8）等），尽管复审请求人强调了蔗糖溶液和不同浓度NaCl溶液对DNA溶解性有影响，并强调双蒸水条件下形成的纳米粒子更具有稳定的粒径大小，具有更强的高通透、高滞留效应，是本申请经过大量探索性试验和创造性劳动进行验证和总结得出的，但实质上在本申请说明书中并未提供任何实验证据表明双蒸水条件下形成的纳米粒子相对于其他溶剂更具有稳定的粒径大小，具有更强的高通透、高滞留效应，也未提供任何实验证据表明选用双蒸水作为溶剂是经过大量探索性试验和创造性劳动获得的，正是基于此仅能认为本申请中选择使用双蒸水是本领域技术人员在已知溶剂基础上根据具体情况和实际需要能够做出的一般性选择，至于制备过程中涉及的室温、避光静置5分钟，再漩涡振荡避光混匀、室温静置20分钟等则是本领域技术人员在对比文件1公开的制备方法基础上根据具体情况和实际需要容易作出的常规适应性选择和调整，由本申请说明书中也无法看出对于该制备方法中所涉溶剂、温度、混合方式、静置时间等的限定为该纳米粒子带来了任何预料不到的技术效果。因此，权利要求1的技术方案是本领域技术人员在对比文件1基础上结合对比文件2披露的内容和公知常识能够显而易见地得到的，且并未产生任何预料不到的技术效果，即权利要求1相对于对比文件1和2不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2请求保护一种权利要求1所述的新型靶向纳米粒子用于制备前列腺癌或结直肠癌或肝癌或肺癌或黑色素瘤或乳腺癌或卵巢癌或胰腺癌或食管癌或胃癌或子宫癌或喉癌或甲状腺癌放射治疗药品中的用途。如前所述，权利要求1请求保护的新型靶向纳米粒子不具备创造性。同时，对比文件1已经公开了Dbait分子可以作为肿瘤对放射的增敏剂。而对比文件3也公开指出“Dbait分子的主要作用机理是抑制非同源重组末端连接修复途径中的修复焦点的形成。Dbait分子主要作用于DNA放射后DSB的非同源重组末端连接修复途径，通过提高肿瘤细胞亚致死性损伤来提高肿瘤对放射的敏感性”、“Dbait的单纯应用无抑制肿瘤作用，只有与引起DNA损伤的放射、化学药物等治疗方式联合才能产生增敏作用”、“Dbait分子的放射增敏作用在各种肿瘤中无明显差异，如宫颈癌、头颈部肿瘤脑胶质母瘤、成纤维细胞癌等”（参见对比文件3第143页左栏第3段，右栏第4段）。由此可见，对比文件3给出了Dbait分子对肿瘤放射增敏作用的机制并明确了基于该机制Dbait分子的放射增敏作用在各种肿瘤中无明显差异，本领域技术人员在其教导下，有动机尝试将权利要求1所述的新型靶向纳米粒子用于制备成前列腺癌、结肠癌等各种常见肿瘤类型的放射治疗药品从而得到权利要求2的技术方案。同时，本申请说明书中也仅对前列腺癌细胞株PC3的放射增敏治疗效果作了相应的验证，且并未与其他癌症作出相应的对比，由此无法看出其在治疗前列腺癌方面产生了预料不到的技术效果，并且本申请在仅验证了对前列腺癌细胞的放射增敏作用的情况下请求保护如权利要求2所限定的各种类型的癌症，这也进一步证实了Dbait分子的放射增敏作用在各种肿瘤中无明显差异，是本领域技术人员容易想到的。因此，当权利要求1的靶向纳米粒子如上评述不具备创造性时，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对复审请求人相关意见的评述
对于复审请求人的意见陈述，合议组认为：1）如上对于权利要求的评述，对比文件1已公开了PEI荷载Dbait形成的纳米粒子形式的辐射增敏剂，并指出其具有细胞毒性，而对比文件2给出了PEI的细胞毒性随分子量的增加而增大因而一般不单独作为基因药物载体，需要对PEI进行修饰的技术启示，对比文件2进一步明确指出通过环糊精（CyD）表面修饰PEI合成的母体材料具有毒性低、安全性高和转染效率好等特点，通过键合叶酸等靶向配体可增加载体的靶向性、提高细胞的转染效率、肿瘤特异性强。由此可见，本领域技术人员在面对如何降低PEI荷载Dbait形成的纳米粒子的毒性并进一步提高其靶向性的技术问题时结合对比文件2给出的上述技术启示容易想到对PEI进行环糊精（CyD）表面修饰同时引入叶酸等靶向配体进行键合，这无须花费创造性劳动，最终形成的纳米粒子具有较低的毒性、强肿瘤特异性和辐射增敏剂作用也是本领域技术人员基于对比文件1和2公开的内容可以预期的，并非预料不到的技术效果。至于制备过程中仅使用无毒的灭菌双蒸水作为溶剂属于本领域技术人员在制备基因药物载体复合物时能够作出的一般性选择，而聚阳离子非病毒载体如PEI-CyD-FA(H1)和核酸类基因药物如Dbait能够通过正负电荷相互吸引作用自动形成纳米粒子也是本领域技术人员能够合理预期的。2）无论是本申请采用的灭菌双蒸水还是对比文件1中使用的蔗糖或NaCl溶液均为已知的可以溶解DNA的溶剂（参见公知常识性证据1），尽管复审请求人强调了蔗糖溶液和不同浓度NaCl溶液对DNA溶解性有影响，并强调双蒸水条件下形成的纳米粒子更具有稳定的粒径大小，具有更强的高通透、高滞留效应，是本申请经过大量探索性试验和创造性劳动进行验证和总结得出的，但实质上在本申请说明书中并未提供任何实验证据表明双蒸水条件下形成的纳米粒子相对于其他溶剂更具有稳定的粒径大小，具有更强的高通透、高滞留效应，也未提供任何实验证据表明选用双蒸水作为溶剂是经过大量探索性试验和创造性劳动获得的，正是基于此仅能认为本申请中选择使用双蒸水是本领域技术人员在已知溶剂基础上根据具体情况和实际需要能够做出的一般性选择。3）虽然对比文件2以FA-PEI600-CyD作为载体转染的是质粒DNA，但如上对于权利要求1的评述，对比文件2中明确公开了对PEI600-β-CyD的粒径分析可看出，在低N/P比下，复合物的粒径较小分布在100nm左右。随着N/P比的增加，复合物最大粒径出现在N/P=50粒径约为176±11.5nm。在整个试验浓度范围内，复合物的粒径整体分布比较均匀没有出现粒子聚集，说明β-CyD修饰的PEI能增加载体的稳定性，所合成骨架材料PEI600-β-CyD呈良好的线型结构，并具有很强的DNA结合能力（参见对比文件2第23页），由此可见，对比文件2用FA-PEI600-CyD荷载质粒DNA根据其粒径也属于纳米粒子范畴。同时，对比文件2明确指出β-CyD修饰的PEI能增加载体的稳定性，所合成骨架材料PEI600-β-CyD呈良好的线型结构，并具有很强的DNA结合能力。而无论是质粒DNA还是小片段DNA分子Dbait(32bp)，均为PEI600-β-CyD具有很强结合能力的DNA的范畴，本领域技术人员在对比文件1公开的PEI可转染小片段DNA分子Dbait形成纳米粒子形式的肿瘤放射增敏剂的基础上结合对比文件2公开的通过环糊精表面修饰可降低PEI载体细胞毒性、通过键合叶酸配体可增强PEI靶向性的启示完全有动机将对比文件2中经过修饰和键合已降低毒性、提高靶向性的PEI载体用于转染其具有很强结合能力的DNA分子Dbait从而形成纳米粒子形式的肿瘤放射增敏剂。4）虽然复审请求人强调合适的N/P比值、合适的溶媒选择等的重要性，并指出若要保证低毒性、高转染效率，只在N/P比值的筛选这一项上，本申请就投入了大量精力用于探索性的试验和创造性劳动进行验证和总结，但实质上，由本申请说明书中附图1.2可以看出N/P值为6:1、12:1、18:1、24:1其粒径并没有大的差异，也无法看出对于N/P比值的筛选可产生低毒性、高转染效率的技术效果，更无法由本申请说明书中看出在N/P比值的筛选这一项上本申请就投入了大量精力用于探索性的试验和创造性劳动进行验证。同时，对比文件1第698页左栏第1段也公开了N/P值为6和9的情况，由此可见，N/P值的选择是本领域技术人员根据具体情况和实际需要能够做出的一般性选择和调整。5）如上对于权利要求2的评述，对比文件3已公开了与本申请相同的Dbait分子产生放射增敏作用的主要作用机理，并得出Dbait分子的放射增敏作用在各种肿瘤中无明显差异的结论，亦即，对比文件3给出了基于Dbait分子的放射增敏作用机理而可将其用于各种肿瘤的放射增敏治疗且无明显差异的技术启示，而本申请中仅对前列腺癌细胞株PC3进行研究，且并未将其与其他类型肿瘤的放射增敏作用进行比较，无法得出其在前列腺癌的治疗中取得了相对较好的治疗效果的结论。同时，本申请在仅研究了前列腺癌细胞株PC3的放射增敏作用的情况下却在权利要求2中请求保护其纳米粒子对包括结直肠癌、肝癌、肺癌等各种类型癌症的放射治疗药物，由此可以进一步证实Dbait分子的放射增敏作用在各种肿瘤中无明显差异。6）对比文件2中明确指出“键合靶向配体后，载体的特点更为明显，可达到毒性低、转染效率高、肿瘤特异性强等特点”（参见对比文件2中文摘要第3段），由此可见，复审请求人所称的对比文件2新合成的成品的肿瘤特异性的效果不明显的结论没有依据，也得不到相关证据的证实。综上所述，复审请求人关于本申请具有创造性的意见陈述不具有说服力。
根据以上事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年06 月27 日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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