发明创造名称：多物种成分实时荧光PCR联合检测方法
外观设计名称：
决定号：187069
决定日：2019-08-19
委内编号：1F237077
优先权日：
申请（专利）号：201510300666.3
申请日：2015-06-04
复审请求人：陕西瑞奇生物科技有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：王慧
合议组组长：彭郁葱
参审员：李娟娟
国际分类号：C12Q1/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在判断创造性时，首先要将权利要求所要求保护的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别技术特征，确定所述技术方案实际要解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别技术特征引入到最接近的现有技术中以解决上述技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510300666.3，名称为“多物种成分实时荧光PCR联合检测方法”的发明专利申请。申请人为陕西瑞奇生物科技有限公司。本申请的申请日为2015年06月04日，公开日为2015年09月09日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年10月10日以权利要求1-4不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为：申请日2015年06月04日提交的说明书摘要，2015年07月14日提交的说明书第1-11页、以及2017年07月24日提交的权利要求第1-4项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种同时测定产品中多物种成分的实时荧光PCR联合检测方法，其特征在于：根据线粒体DNA上物种间基因多态性的差异设计各物种特异性的引物，并将反应条件优化到同一体系，在同一个PCR反应体系内同时对多个物种的特异性片段进行扩增，然后对扩增后的多种物种成分进行鉴定，通过加入荧光染料来检测荧光信号，最后用扩增的CT值与内参的对照来确定阴阳性；该方法同时对肉及肉制品中10种以上动物源性成分进行检测；
所述实时荧光PCR法包含的10个以上物种的特异性引物和1个内参引物的序列；
所述实时荧光PCR检测方法对多种动物源成分的检测是在一个PCR反应体系中、同一个反应条件下一次完成的；
所述实时荧光PCR法的所用荧光染料SYBR Green，但不限于SYBR Green，也可以是Eva Green、LC Green等荧光染料，并通过对溶解曲线的判读分析扩增的特异性。
2. 根据权利要求1所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法的结果的判读方法：用扩增的CT值与内参的对照来确定阴阳性；无CT值的直接判读为阴性；有扩增CT值的与内参引物扩增CT值进行比较，大于等于7的判读为阴性，小于7的判读为阳性。
3. 根据权利要求2所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法应用于10个以上物种中的任一物种检测。
4. 根据权利要求3所述的一种同时测定肉制品中多种动物源成分的实时荧光PCR联合检测方法，其特征在于：所述实时荧光PCR法应用于10个以上物种中的任意混合物种的检测。”
驳回决定认为：对比文件1（赵冉 等，“动物产品及饲料中牛源和羊源性成分三重荧光PCR检测方法的建立”，畜牧与兽医，第44卷，第7期，第18-22页，公开日期：2012年12月31日）公开了一种在同一个荧光PCR反应中完成3种动物源性成分检测的方法。权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1同时对肉及肉制品中10种以上动物源性成分，因此包含了10个以上物种的特异性引物和1个内参引物的序列，且通过加入具体种类的荧光染料来检测荧光信号，结果判定时通过对溶解曲线法的判读分析扩增的特异性，用扩增的Ct值与内参的对照来确定阴阳性。针对该区别，对比文件2（Md. Eaqub Ali等，“multiplex PCR in species authentication: probability and prospects-a review”，Food Anal. Methods，第7卷，第1933-1949页，公开日期：2014年04月04日）给出了使用荧光染料进行物种鉴定的技术启示。在此基础上本领域技术人员可以想到通过加入荧光染料来检测荧光信号。在实验中加入内参对照引物，并通过检测组的Ct值与内参的对照来确定阴阳性，通过溶解曲线判读分析扩增特异性也是本领域的常规技术手段，对比文件2还公开了以SYBR Green染料进行多重实时PCR，具体的荧光染料的种类属于本领域的常规选择。对于所检测的物种的数量，本领域技术人员可以根据实验需要确定需要同时检测的动物源性成分的物种数量。在多重定量PCR已经是本领域常规技术手段的情况下，根据目标物种线粒体DNA序列设计物种特异性引物也是本领域的常规技术手段，本领域技术人员可以想到实时荧光PCR体系中包含10个以上的特异性引物和1个内参引物。因此，权利要求1不具备创造性。从属权利要求2-4的附加技术特征或被对比文件1公开、或是本领域的常规实验手段，因而，权利要求2-4也不具备创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年11月09日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。复审请求人认为：对比文件1的多对引物导致扩增效率低，扩增效率不一致；受到通道限制，每增加一个检测物种增加一个检测通道，成本高；探针法对操作要求高，易假阳性。而本申请采用SYBR Green染料法，共用一个检测通道，每个反应是不同反应管进行，避免引物之间互相干扰，通过扩增的CT值与对照来确定阴阳性，且相差7以上判定的标准可以排除假阳性结果。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年01月24日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年04月28日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1限定了同时对肉及肉制品中10种以上动物源性成分进行检测，因此包含了10个以上物种的特异性引物和1个内参引物的序列，且通过加入具体种类的荧光染料来检测荧光信号，结果判定时通过对溶解曲线法的判读分析扩增的特异性，用扩增的Ct值与内参的对照来确定阴阳性。针对该区别，对比文件1已经公开了mtDNA具有种间特异性，并基于牛、山羊和绵羊mtDNA种间保守片段，设计合成引物和探针，采用多重PCR检测上述3种动物源性成分（参见对比文件1摘要），在此基础上，本领域技术人员可根据实际需要确定需要同时检测的动物源性成分的物种数量，并进行相关引物和探针的设计。而且对比文件2给出了使用荧光染料进行物种鉴定的技术启示。在此基础上，本领域技术人员容易想到通过加入荧光染料来检测荧光信号，而且在实验中加入内参对照引物，并通过检测组的Ct值与内参的对照来确定阴阳性，通过溶解曲线判读分析扩增特异性也是本领域的常规技术手段，至于具体的荧光染料，在对比文件2已经公开了以SYBR Green染料进行多重实时PCR的基础上，本领域技术人员可根据需要选择其它合适的荧光染料。因此，权利要求1不具备创造性。从属权利要求2-4的附加技术特征或被对比文件1公开、或是本领域的常规实验手段，因而，权利要求2-4也不具备创造性。在答复复审请求人的意见陈述中引用了公知常识证据1（黄辰 臧伟进主编，《医学实验研究概论》，西安交通大学出版社，第212-216页，公开日期2014年07月） 。
复审请求人于2019年05月31日提交了意见陈述书和权利要求书全文替换页（共3页4项）。相对于复审通知书针对的文本，所作修改在于：将说明书第28-30段的具体引物限定入权利要求1中。复审请求人认为：本申请使用了特异性的引物，并采用了SYBR Green染料法，共用一个检测通道；且每个反应是在不同的反应管中进行，避免了引物之间的相互干扰；本申请提出一种新的判别方法，通过扩增的Ct值与内参的对照来确定阴阳性，Ct值相差7以上表示模板DNA含量相差百倍以上，以此判断标准可以排除因沾染造成的假阳性结果。因而本申请具备创造性。
新提交的权利要求1如下：
“1. 一种同时测定产品中多物种成分的实时荧光PCR联合检测方法，其特征在于：根据线粒体DNA上物种间基因多态性的差异设计各物种特异性的引物，并将反应条件优化到同一体系，在同一个PCR反应体系内同时对多个物种的特异性片段进行扩增，然后对扩增后的多种物种成分进行鉴定，通过加入荧光染料来检测荧光信号，最后用扩增的CT值与内参的对照来确定阴阳性；该方法同时对肉及肉制品中10种以上动物源性成分进行检测；
所述实时荧光PCR法包含的10个以上物种的特异性引物和1个内参引物的序列；
所述实时荧光PCR检测方法对多种动物源成分的检测是在一个PCR反应体系中、同一个反应条件下一次完成的；
所述实时荧光PCR法的所用荧光染料SYBR Green，但不限于SYBR Green，也可以是Eva Green、LC Green等荧光染料，并通过对溶解曲线的判读分析扩增的特异性；
所述的特异性的引物、内参的核苷酸序列分别为：
”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人于2019年05月31日提交了权利要求书全文替换页（共3页4项），经审查，其中所作修改符合专利法第33条和实施细则第61条第1款的规定。本复审请求审查决定所依据的审查文本是：申请日2015年06月04日提交的说明书摘要，2015年07月14日提交的说明书第1-11页、以及2019年05月31日提交的权利要求第1-4项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，在判断创造性时，首先要将权利要求所要求保护的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别技术特征，确定所述技术方案实际要解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别技术特征引入到最接近的现有技术中以解决上述技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
权利要求1请求保护一种同时测定产品中多物种成分的实时荧光PCR联合检测方法。对比文件1公开了一种在同一个荧光PCR反应中完成3种动物源性成分检测的方法，该方法选取线粒体DNA（mtDNA）作为检测的靶基因，因为mtDNA具有种间特异性，可区分不同动物物种，选取牛、山羊和绵羊mtDNA种间保守片段，设计合成了3对特异性引物和TaqMan探针，在同一体系中同时加入牛、山羊和绵羊的引物和探针，在单重荧光PCR最优体系和确保试验特异性及稳定性的基础上，根据Ct值和荧光增量，对各引物、探针浓度及循环参数进行优化，并检测三重荧光PCR的特异性、灵敏度和干扰性。三重荧光PCR的反应体系为20μL，其中Premix Ex、Taq（2X）10μL，牛、山羊和绵羊的上下游引物（10μmol/L）各0.2μL、探针（10μmol/L）各0.4μL、DNA模板4μL、ddH2O 3.6μL，Ct值小于30，判为阳性，Ct值大于35判为阴性，介于两者之间判为可疑，重复试验结果一致且曲线有明显的对数增长，判为阳性（参见对比文件1摘要、第18页右栏第1段、第19页左栏1.4.1、第19页右栏1.4.6-第20页1.4.9、第20页右栏2.4-第21页右栏2.7、第22页左栏第2段）。可见，权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1限定了同时对肉及肉制品中10种以上动物源性成分进行检测，因此包含了10个以上物种的特异性引物和1个内参引物，并限定了具体的引物序列，且通过加入具体种类的荧光染料来检测荧光信号，结果判定时通过对溶解曲线法的判读分析扩增的特异性，用扩增的Ct值与内参的对照来确定阴阳性。基于上述区别技术特征，本申请实际解决的技术问题是提供一种基于荧光染料的多重荧光PCR检测动物源性成分的方法。
针对该区别，对比文件1已经公开了mtDNA具有种间特异性，并基于牛、山羊和绵羊mtDNA种间保守片段，设计合成引物和探针，采用多重PCR检测上述3种动物源性成分（参见对比文件1摘要），在此基础上，本领域技术人员可根据实际需要确定需要同时检测的动物源性成分的物种数量，并基于现有技术中已知的动物的mtDNA序列进行相关引物的设计，获得合适的引物序列。而且对比文件2也公开了采用多重PCR靶向线粒体基因进行物种鉴定的方法，还公开了使用多重实时PCR进行物种鉴定克服了终点PCR的限制，提供了基于荧光强度测量的定量结果，该荧光强度可以是由非特异性荧光染料，比如SYBR Green，所产生，在实时定量PCR中，最常使用的检测剂包括了SYBR Green染料和TaqMan探针（参见对比文件2摘要、第1937页左栏第2段-右栏最后一段、第1939页图1、第1943-1944页表4）。采用荧光染料或TaqMan探针的方法实现多重荧光PCR均是本领域的常规选择，对比文件2也给出了使用荧光染料进行物种鉴定的技术启示。在此基础上，本领域技术人员容易想到通过加入荧光染料来检测荧光信号，而且在实验中加入内参对照引物，并通过检测组的CT值与内参的对照来确定阴阳性，通过溶解曲线判读分析扩增特异性也是本领域的常规技术手段，至于具体的荧光染料，在对比文件2已经公开了以SYBR Green染料进行多重实时PCR的基础上，本领域技术人员可根据需要选择其它合适的荧光染料。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2和本领域的常规实验手段以获得权利要求1的技术方案对本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2-4直接或间接引用了权利要求1，分别进一步限定了结果判读方法、用于10个以上物种中的任一物种或任意混合物种的检测。对比文件1已经公开了通过Ct值进行结果判读方法，而且通过检测组的CT值与内参的对照来确定阴阳性也是本领域的常规技术手段。对比文件1公开了三重荧光PCR对于单一模板和混合模板的特异性（参见对比文件1的1.4.7），本领域技术人员容易想到，为了实现对不同物种的检测，所述的实时荧光PCR方法可用于对任一物种或者任意混合物种的检测，并可根据实际需求将该方法应用于10个以上物种中的任一物种或任意混合物种的检测中。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求2-4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性
对复审请求人相关意见的评述
对于复审请求人的陈述意见，合议组认为：1）对比文件1已经公开了mtDNA具有种间特异性，并基于牛、山羊和绵羊mtDNA种间保守片段，设计合成引物和探针，采用多重PCR检测上述3种动物源性成分，在此基础上，本领域技术人员可根据实际需要确定需要同时检测的动物源性成分的物种数量，并基于现有技术中已知的动物的mtDNA序列进行相关引物的设计，获得合适的引物序列。2）对比文件2已经公开了在实时定量PCR中，最常使用的检测剂包括了SYBR Green染料和TaqMan探针（第1937页右栏最后一段），大量公知均可以佐证这点（例如参见公知常识证据1第212-216页），上述公知还公开了用SYBR Green染料法数据分析时以目标基因与内参基因扩增的Ct的差值来进行分析（参见公知1第216页）。因此选择SYBR Green染料法、通过目标基因与内参基因扩增的Ct的差值来确定阴阳性并不会给本申请带来创造性，而差值达到多少可判定为阴性或阳性也是本领域技术人员在常规实验的基础上根据实际检测情况能够进行调整并确定的。3）至于检测通道，对比文件1已经公开了进行单一PCR和多重PCR的效果，也就是说该引物组合不仅可以实现多重，还可以实现单一检测，当进行单一检测或者当分开检测时，本领域技术人员是可以选择采用相同的荧光标记探针或者使用SYBR检测，仅进行单一检测时不使用多个通道是显而易见的。4）从效果来说，本申请也并未证明其获得了何种预料不到的技术效果。因而，复审请求人的意见陈述不具备说服力。
基于上述事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年10月10日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
郑重声明：本文版权归原作者所有，转载文章仅为传播更多信息之目的，如作者信息标记有误，请第一时间联系我们修改或删除，多谢。
