发明创造名称：基于芽变的苹果选种的方法
外观设计名称：
决定号：188072
决定日：2019-08-13
委内编号：1F239741
优先权日：
申请（专利）号：201510133070.9
申请日：2015-03-26
复审请求人：山东省果树研究所
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：王莉
合议组组长：安玉苹
参审员：张丽颖
国际分类号：C12Q1/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：评价一项发明是否具备创造性，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别技术特征和发明实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中存在这种启示，并且发明所获得的技术效果是可以预料的，则认为该发明不具备创造性
全文：
本复审请求涉及申请号为201510133070.9，名称为“基于芽变的苹果选种的方法”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请人为山东省果树研究所。申请日为2015年03月26日，公开日为2015年06月17日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年09月05日以权利要求1不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：申请日2015年03月26日提交的说明书第1-15页（第1-46段）、说明书附图第1-2页、说明书摘要、摘要附图，以及2017年03月08日提交的权利要求第1项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种基于芽变的苹果选种的方法；其特征是：其步骤是：通过SSAP分子鉴定方法对发现的疑似芽变样本确定是芽变样本、还是饰变样本，对芽变样本进行芽变资源扩繁得到品种体系，对得到的品种体系进行果实质量和经济性状评价，确定芽变样本是否为新品种，
其步骤是：
初选
发掘变异：苹果园中发掘疑似芽变样本并且选好对照样本，对疑似芽变样本和对照样本进行登记编号并且作出明显区别的标记；
分析变异：通过SSAP分子鉴定方法对疑似芽变样本和对照样本进行分析，确定变异样本是芽变样本或饰变样本；
b、复选
芽变资源扩繁：把芽变样本和对照样本分别嫁接到矮化苹果砧上，再定植到选种圃中进行培育；
品系评价：对选种圃中的嫁接在矮化苹果砧上的芽变样本和对照样本的每一株进行建立档案并且分别观察，连续进行至少三年的观察记录，当嫁接在矮化苹果砧上的芽变样本和对照样本盛产果实后，至少连续三年，对果实和其它重要经济性状进行全面分析鉴定，确定芽变样本是否为最优良的品系并且定为入选品系样本，把入选品系样本在不同生态环境条件地区进行多点试验栽植，再对果实和其它重要经济性状进行全面分析鉴定，
决选
根据入选品系样本的选种历史、分析鉴定结果和发展前景；即：入选品系样本在选种圃内连续三年以上果树学与农业生物学的完整鉴定数据、在不同生态条件下的试验结果和有关鉴定意见、及结对照的新鲜果实和经审查鉴定后确定该品系在生产上有发展前途，把入选品系样本进行命名，
SSAP分子鉴定方法：
对疑似芽变样本和亲本对照样本采集嫩叶，提取基因组DNA，将基因组DNA进行酶切，然后加上酶切接头，再经过预扩增和选择性扩增，PCR 终产物由6％聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，银染显色，根据条带有无差异，确定是否为芽变,
所述的基因组DNA提取方法如下：
一、DNA试样的制取
a、将0.1 g的疑似芽变样本和亲本对照样本采集嫩叶分别在液氮中研碎后移入1.5 mL离心管Ⅰ中；
b、在离心管Ⅰ中加入600 μL温度为65℃的CTAB后提取缓冲液； CTAB是指2% CTAB；100 mM Tris-HCl，pH 8.0；20 mM EDTA，pH 8.0；1.4 M NaCl；使用前加入0.4% β-巯基乙醇；
c、将缓冲液放到离心管Ⅱ中，把离心管Ⅱ在65℃保温箱中保温30 min，期间颠倒至少十次，再加入600 μL的v/v=24/1的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒，5 min， 在转速为10000 r/min的离心机中进行离心运动10 min；
d、把离心管Ⅱ的500 μL的上清液移入到离心管Ⅲ，在离心管Ⅲ中加入加入600 μL的v/v=24/1的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒至少十次，在转速为10000 r/min的离心机中进行离心运动10 min；
e、把离心管Ⅲ的300 μL的上清液移入到离心管Ⅳ，在离心管Ⅳ中加入二倍体积预冷的的无水乙醇，颠倒混匀；
f、把离心管Ⅳ中的沉淀物，放到含350 μL TE缓冲液的1.5 mL离心管Ⅴ中，当沉淀溶解后，在转速为10000 r/min的离心机中进行离心运动10 min；
g、把离心管Ⅴ的300 μL的上清液移入到离心管Ⅵ，在离心管Ⅵ中加入1 μL 的10 μg/μL 的RNase，轻轻混匀后在37℃水浴1 h，冷却至室温，再加入1/10体积的pH 5.2的3 M NaAc，混匀后再加入二倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀，在温度为–20℃的保温箱中静置30 min，在转速为10000 r/min的离心机中进行离心运动10 min；
h、对离心管Ⅵ中的沉淀物，进行至少两次的使用70%乙醇洗涤并且使用离心运动进行沉淀； 在超净工作台上对沉淀物进行风干，加入100 μL TE溶解沉淀物得到DNA试样，
二、DNA试样的酶切
采用EcoRI和MseI两种限制性内切酶对DNA试样进行酶切，反应体系如下：
混匀后低速离心至少十秒，进行37℃水浴4 h，
所述的连接反应，用T4 DNA ligase 即NEB进行连接反应，反应体系如下：
充分混匀，低速离心至少十秒，16℃连接反应过夜，得到DNA酶切产物，
所述的SSAP引物包括：
三、DNA酶切的产物进行PCR扩增反应
预扩增
利用不含有选择性碱基的EcoR I和Mse I引物进行预扩增反应，PCR反应体系如下：
PCR反应条件如下：
94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，24个循环；72℃ 10 min延伸；
选择性扩增
根据CTcrm1和 CTcrm2反转录转座子基因的LTR序列设计用于S-SAP分子标记的LTR Primer，与EcoR I和Mse I的选择性引物结合进行选择性扩增；
PCR反应体系如下：
PCR反应条件如下：
94℃ 5 min；94℃ 30 s，65-56℃/cycle - 0.7℃ 30 s，72℃ 1 min，12个循环；94℃ 30 s， 56℃ 30 s，72℃ 1 min，24个循环；72℃ 10 min延伸；
四、PCR产物电泳检测
a、用清洗液将制胶的两块玻璃板彻底洗净，蒸馏水冲洗，滤纸擦干，乙醇擦洗后晾干；同时将边条和梳子洗净、凉干；
b、将剥离硅烷溶液即3 mL无水乙醇 300 μL Repel均匀地涂在短板上，亲和硅烷溶液即3 mL无水乙醇 10 μL冰醋酸 10 μL Binding均匀地涂在长板上，室温放置至少20 min晾干玻璃板；将长板和短板装配好，水平仪调至水平后，预插入梳子检查梳子是否合适及插入的最佳位置； 取50 mL 6%的PA胶加入250 μL 10%过硫酸氨即APS、50 μL TEMED轻轻混匀灌入玻璃板中，灌完后，将梳子插入适当位置，将板调至水平，室温放置至少2 h，待胶凝固后用于电流；
PCR 产物变性处理：加入一半体积的上样缓冲液，95℃ 5 min后迅速放置于冰上，离心后用于测序胶电泳分析；将梳子小心拔出，清洗干净；板装到电流槽中，加入合适的电泳缓冲液，用移液器将梳子处的气泡赶出，60 W恒定功率预电泳30 min；
将梳子插入，其深度为刚进入胶面，上样电泳，直至二甲苯菁到胶的3/4处；
c、固定：电泳结束后，将玻璃板从电泳槽取下，拔出梳子，并取下长板，放入10%乙醇溶液中，轻摇7 min；
染色：在1 L蒸馏水中加入1.5 g硝酸银，1.5 mL甲醛，轻摇7 min；
显影：染色后在蒸馏水中迅速漂洗3~4 s，转入1.5%的氢氧化钠溶液中（先加入一定浓度的甲醛），显影至条带清晰；
终止：当条带清晰时，将玻璃板放入固定液中，终止2 min；
漂洗：蒸馏水漂洗10 min；在灯箱上进行观察拍照，得到电泳图,
苹果芽变新品种即泰山嘎拉选育过程。”
驳回决定指出：权利要求1与对比文件1（何平等，“S-SAP分子标记开发及其在苹果芽变鉴别上的应用”，《植物遗传资源学报》2013，14(2):298-302，公开日期2013年02月19日）的区别在于：①对比文件1仅仅是开发了一系列的SSAP分子标记，发现其能够用于有效区分苹果芽变品种，并未实际应用于芽变苹果选种。而权利要求1要求保护芽变的苹果选种方法，根据SSAP分子鉴定方法对疑似芽变样本进行分析，以确定是否为芽变样本，对芽变样本进一步分析评价以确定是否为新品种。②限定了具体的初选、复选、决选步骤，以及各步骤中的具体操作。③限定SSAP分子鉴定步骤，包括具体的DNA提取、DNA试样酶切、DNA酶切产物进行PCR扩增反应、PCR产物电泳检测的步骤，与对比文件1公开的流程相同但具体操作有所差异，例如CTAB溶液、反应体系和时间参数、如何制备电泳凝胶等。④限定苹果芽变新品种即泰山嘎拉选育过程。对于区别①，根据SSAP分子标记进行芽变的苹果选种对本领域技术人员来说是显而易见的，而具体步骤是常规技术手段。对于区别②，根据对比文件2（“果树芽变选种原理及方法”，高登涛等，《果农之友》，第10期，第28-30页，公开日期 2013年12月31日）教导的苹果芽变选种的一般程序，本领域技术人员容易提出在初选步骤中通过SSAP分子标记分析的方法鉴定芽变样本、排除饰变的苹果芽变选种方法。而权利要求1限定的初选、复选和决选步骤均是苹果的芽变选种中的常规技术手段和注意事项，不需要付出所属领域技术人员的创造性劳动。对于区别③，具体操作参数和步骤中的差异均是本领域技术人员可根据常规技术手段作出的简单调整和细化。对于区别④，在对比文件1公开内容的基础上是显而易见的。因此权利要求1不具备创造性。
申请人山东省果树研究所（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年12月07日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了修改的权利要求书全文替换页（共6页4项），其中所作的修改为：将驳回针对的权利要求1拆分为4项权利要求。
复审请求人认为：（1）本申请实际解决的技术问题至少包括：设计一种SSAP分子鉴定方法，通过对苹果的疑似芽变样本进行SSAP分子鉴定并分析直接确定是否为芽变样本，从而缩短苹果选种的选育周期，提高选种准确性。对于区别技术特征①，对比文件1仅公开了一系列SSAP分子标记，没有任何数据支撑，没有进一步实践探讨。并且筛选的具体过程、需要控制的条件、试验过程中的阻挠都无法预期，且生物试验对准确度要求高、对技术人员的专业度及技术水平要求高，所述实践过程庞大，需要付出创造性劳动及在不断探索中摸索出最佳数据及控制条件，并非常规技术手段。对于区别特征②，对比文件1并未公开筛选过程，而本申请的初选、复选和决选过程极其必要，对比文件2虽然公开了苹果芽变选种程序，但并未利用SSAP分子标记的方法进行，与本申请的原理完全不同。本申请结果为数据及凝胶图更直观。（2）权利要求限定的反应体系与对比文件1不同，其中引物浓度条件为最佳，对比文件1的引物浓度更高影响扩增效果。本申请并未从对比文件1中得出任何技术启示。综上，本申请具有现有技术未提示也未建议的要素，并且，考虑到即使微小的进步也可要求专利权，应准予授权。
提出复审请求时新修改的权利要求书如下：
“1. 一种基于芽变的苹果选种的方法；其特征是：其步骤是：通过SSAP分子鉴定方法对发现的疑似芽变样本确定是芽变样本、还是饰变样本，对芽变样本进行芽变资源扩繁得到品种体系，对得到的品种体系进行果实质量和经济性状评价，确定芽变样本是否为新品种，具体步骤包括：
初选
发掘变异：苹果园中发掘疑似芽变样本并且选好对照样本，对疑似芽变样本和对照样本进行登记编号并且作出明显区别的标记；
分析变异：通过SSAP分子鉴定方法对疑似芽变样本和对照样本进行分析，确定变异样本是芽变样本或饰变样本；
b、复选
芽变资源扩繁：把芽变样本和对照样本分别嫁接到矮化苹果砧上，再定植到选种圃中进行培育；
品系评价：对选种圃中的嫁接在矮化苹果砧上的芽变样本和对照样本的每一株进行建立档案并且分别观察，连续进行至少三年的观察记录，当嫁接在矮化苹果砧上的芽变样本和对照样本盛产果实后，至少连续三年，对果实和其它重要经济性状进行全面分析鉴定，确定芽变样本是否为最优良的品系并且定为入选品系样本，把入选品系样本在不同生态环境条件地区进行多点试验栽植，再对果实和其它重要经济性状进行全面分析鉴定；
决选
根据入选品系样本的选种历史、分析鉴定结果和发展前景；即：入选品系样本在选种圃内连续三年以上果树学与农业生物学的完整鉴定数据、在不同生态条件下的试验结果和有关鉴定意见、及结对照的新鲜果实和经审查鉴定后确定该品系在生产上有发展前途，把入选品系样本进行命名。
2. 根据权利要求1所述的基于芽变的苹果选种的方法；其特征是：苹果芽变新品种即泰山嘎拉选育过程。
3. 根据权利要求1所述的基于芽变的苹果选种的方法；其特征是：SSAP分子鉴定方法：
对疑似芽变样本和亲本对照样本采集嫩叶，提取基因组DNA，将基因组DNA进行酶切，然后加上酶切接头，再经过预扩增和选择性扩增，PCR终产物由6％聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，银染显色，根据条带有无差异，确定是否为芽变。
4. 根据权利要求2所述的基于芽变的苹果选种的方法；其特征是：所述的基因组DNA提取方法如下：
一、DNA试样的制取
a、将0.1g的疑似芽变样本和亲本对照样本采集嫩叶分别在液氮中研碎后移入1.5mL离心管I中；
b、在离心管I中加入600μL温度为65℃的CTAB后提取缓冲液；CTAB是指2％CTAB；100mM Tris-HCl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0；1.4M NaCl；使用前加入0.4％β-巯基乙醇；
c、将缓冲液放到离心管II中，把离心管II在65℃保温箱中保温30min，期间颠倒至少十次，再加入600μL的v/v＝24/1的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒，5min，在转速为10000r/min的离心机中进行离心运动10min；
d、把离心管II的500μL的上清液移入到离心管III，在离心管III中加入加入600μL的v/v＝24/1的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒至少十次，在转速为10000r/min的离心机中进行离心运动10min；
e、把离心管III的300μL的上清液移入到离心管IV，在离心管IV中加入二倍体积预冷的的无水乙醇，颠倒混匀；
f、把离心管IV中的沉淀物，放到含350μL TE缓冲液的1.5mL离心管V中，当沉淀溶解后，在转速为10000r/min的离心机中进行离心运动10min；
g、把离心管V的300μL的上清液移入到离心管VI，在离心管VI中加入1μL的10μg/μL的RNase，轻轻混匀后在37℃水浴1h，冷却至室温，再加入1/10体积的pH5.2的3M NaAc，混匀后再加入二倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀，在温度为-20℃的保温箱中静置30min，在转速为10000r/min的离心机中进行离心运动10min；
h、对离心管VI中的沉淀物，进行至少两次的使用70％乙醇洗涤 并且使用离心运动进行沉淀；在超净工作台上对沉淀物进行风干，加入100μLTE溶解沉淀物得到DNA试样；
二、DNA试样的酶切
采用EcoRI和MseI两种限制性内切酶对DNA试样进行酶切，反应体系如下：
DNA
500ng
10×Buffer
2μL
10×BSA
0.2μL
MseI
0.5μL
EcoRI
0.5μL
ddH2O
XμL
总体积
20μL
混匀后低速离心至少十秒，进行37℃水浴4h；
所述的连接反应，用T 4 DNA ligase即NEB进行连接反应，反应体系如下：
DNA酶切产物
8μL
Mse I-adaptor
10μL
EcoR I-adaptor
2μL
T4-DNA连接酶
1U
10×Ligation Buffer
2.5μL
ddH2O
XμL
总体积
25μL
充分混匀，低速离心至少十秒，16℃连接反应过夜，得到DNA酶切产物；
所述的SSAP引物包括
三、DNA酶切的产物进行PCR扩增反应
预扩增利用不含有选择性碱基的EcoR I和Mse I引物进行预扩增反应，PCR反应体系如下：
PCR反应条件如下：
94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，24个循环；72℃10min延伸；
选择性扩增
根据CTcrm1和CTcrm2反转录转座子基因的LTR序列设计用于S-SAP分子标记的LTR Primer，与EcoR I和Mse I的选择性引物结合进行选择性扩增；
PCR反应体系如下：
DNA
5μL
10×Taq Buffer
5μL
Taq
1U
dNTP Mix
200μM
选择性Primer EcoRI
1μL
LTR Primer
1μL
ddH2O
XμL
总体积
50μL
PCR反应条件如下：
94℃5min；94℃30s，65-56℃/cycle-0.7℃30s，72℃1min，12个循环；94℃30s，56℃30s，72℃1min，24个循环；72℃10min延伸；
四、PCR产物电泳检测
a、用清洗液将制胶的两块玻璃板彻底洗净，蒸馏水冲洗，滤纸擦干，乙醇擦洗后晾干；同时将边条和梳子洗净、凉干；
b、将剥离硅烷溶液即3mL无水乙醇 300μL Repel均匀地涂在短板上，亲和硅烷溶液即3mL无水乙醇 10μL冰醋酸 10μL Binding均匀地涂在长板上，室温放置至少20min晾干玻璃板；将长板和短板装配好，水平仪调至水平后，预插入梳子检查梳子是否合适及插入的最佳位置；取50mL6％的PA胶加入250μL10％过硫酸氨即APS、50μL TEMED轻轻混匀灌入玻璃板中，灌完后，将梳子插入适当位置，将板调至水平，室温放置至少2h，待胶凝固后用于电流；
PCR产物变性处理：加入一半体积的上样缓冲液，95℃5min后迅速放置于冰上，离心后用于测序胶电泳分析；将梳子小心拔出，清洗干净；板装到电流槽中，加入合适的电泳缓冲液，用移液器将梳子处的气泡赶出，60W恒定功率预电泳30min；
将梳子插入，其深度为刚进入胶面，上样电泳，直至二甲苯菁到胶的3/4处；
c、固定：电泳结束后，将玻璃板从电泳槽取下，拔出梳子，并取下长板，放入10％乙醇溶液中，轻摇7min；
染色：在1L蒸馏水中加入1.5g硝酸银，1.5mL甲醛，轻摇7min；
显影：染色后在蒸馏水中迅速漂洗3～4s，转入1.5％的氢氧化钠溶液中(先加入一定浓度的甲醛)，显影至条带清晰；
终止：当条带清晰时，将玻璃板放入固定液中，终止2min；
漂洗：蒸馏水漂洗10min；在灯箱上进行观察拍照，得到电泳图。”。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年01月17日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年06月04日向复审请求人发出复审通知书，指出：修改后的权利要求1-4均相应于驳回决定针对的权利要求扩大了保护范围，不符合专利法实施细则第61条第1款的规定。此次修改的权利要求书合议组不予接受。合议组基于驳回决定所针对的文本，指出权利要求1与对比文件1公开的内容相比，区别特征在于：①权利要求1要求保护通过SSAP分子鉴定方法对疑似芽变样本进行初选，并对芽变样本进行芽变资源扩繁得到品种体系，对得到的品种体系进行果实质量和经济性状评价，确定是否为新品种的苹果选种方法，而对比文件1公开的是通过SSAP分子标记鉴定苹果芽变品种的方法。②权利要求1具体限定了初选、复选、决选步骤，以及各步骤中的操作；对此，对比文件1没有公开。③两者在SSAP分子鉴定方法的流程上相同但具体操作细节的描述上略有差异，如权利要求1具体描述了基因组DNA提取的液氮研碎样品，CTAB溶液配制和使用、反应体系、反应条件、电泳凝胶的制备等。④权利要求1具体限定苹果芽变新品种即泰山嘎拉选育过程，而对比文件1公开SSAP能够有效鉴别泰山嘎拉品系。对于区别特征①，如前所述，对比文件1公开了基于SSAP分子标记技术鉴定苹果芽变品种的方法，且对比文件2公开了果树芽变选种的程序，本领域技术人员容易想到将对比文件1的SSAP分子标记用于苹果芽变选种的方法中，并在初选后进一步对芽变样本进行果实质量和经济性状评价，确定芽变样本是否为新品种。对于区别特征②，对比文件2教导了苹果芽变选种的一般程序为。虽然权利要求1限定的初选、复选和决选步骤与对比文件2教导的选种程序不完全相同，然而所述特征均是苹果的芽变选种中的常规技术手段和注意事项，不需要付出所属领域技术人员的创造性劳动。对于区别特征③，权利要求1所述的SSAP流程的具体操作参数和步骤是本领域技术人员根据常规技术手段结合有限的试验即可获得的，并且其效果也是可预期的。对于区别特征④，对比文件1已公开了所述37份供试材料中包含泰山嘎拉品系，图4的聚类分析图表明对比文件1所开发的SSAP引物能够有效鉴别泰山嘎拉品系。因此将所述引物用于苹果芽变品种泰山嘎拉的选育是显而易见的。权利要求1不具备创造性。
复审请求人于2019年06月27日提交了意见陈述书，但未修改申请文件。复审请求人认为：本申请实际解决的技术问题至少包括：设计一种SSAP分子鉴定方法，通过对苹果的疑似芽变样本进行SSAP分子鉴定并分析直接确定是否为芽变样本，从而缩短苹果选种的选育周期，提高选种准确性。对于区别①，对比文件1仅公开了一系列SSAP分子标记，没有任何数据支撑，没有进一步实践探讨。并且筛选的具体过程、需要控制的条件、试验过程中的阻挠都无法预期，且生物试验对准确度要求高、对技术人员的专业度及技术水平要求高，所述实践过程庞大，需要付出创造性劳动及在不断探索中摸索出最佳数据及控制条件，并非常规技术手段。对于区别②，对比文件1并未公开筛选过程，而本申请的初选、复选和决选过程极其必要，对比文件2虽然公开了苹果芽变选种程序，但并未利用SSAP分子标记的方法进行，与本申请的原理完全不同。本申请结果为数据及凝胶图更直观。对于区别③，本申请中引物浓度条件为最佳，对比文件1的引物浓度更高影响扩增效果。本申请并未从对比文件1中得出任何技术启示。综上，本申请具有现有技术未提示也未建议的要素，并且，考虑到即使微小的进步也可要求专利权，应准予授权。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人在2017年12月07日提出复审请求时修改了权利要求书全文替换页（共6页4项），经审查，所述文本不符合专利法实施细则第61条第1款的规定，因而，合议组不予接受。本复审决定针对的审查文本与驳回决定针对的文本相同，即：申请日2015年03月26日提交的说明书第1-15页（第1-46段）、说明书附图第1-2页、说明书摘要、摘要附图，以及2017年03月08日提交的权利要求第1项。
2、专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，评价一项发明是否具备创造性，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别技术特征和发明实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中存在这种启示，并且发明所获得的技术效果是可以预料的，则认为该发明不具备创造性。
本案中，权利要求1请求保护一种基于芽变的苹果选种的方法；其特征是：其步骤是：通过SSAP分子鉴定方法对发现的疑似芽变样本确定是芽变样本、还是饰变样本，对芽变样本进行芽变资源扩繁得到品种体系，对得到的品种体系进行果实质量和经济性状评价，确定芽变样本是否为新品种，并具体限定了芽变选种的步骤以及SSAP分子鉴定方法和基因组DNA提取方法。
对比文件1公开了一种SSAP分子标记开发的方法，包括以下步骤：1.1植物材料 选择包含泰山嘎拉在内的37份苹果芽变系品种（表1）作为供试材料；1.2基因组DNA提取 采用改进CTAB法提取叶片总DNA，参考He等（即对比文件1的引证文献8：“FaRE1: A transcriptionally active Ty1-copia retrotransposon in strawberry”，He et al.，Journal of Plant Research，第123卷第5期，第707-714页, 公开日期 2009年12月18日）的方法；1.3 SSAP分析，反转录转座元件引物来自G. L Zhao 等分离的CTcrm1、CTcrm2，引物序列见表2（经比对，与本申请的SSAP引物序列完全相同）；SSAP流程中的基因组双酶切反应、连接反应、预扩增反应和选择性扩增反应的流程，具体参考P. He等（参见对比文件1的引证文献10：“Development of Ty1-copia retrotransposon-based S-SAP markers in strawberry (Fragaria × ananassa Duch.)”，Ping He et al.，Scientia Horticulturae，第137卷，第43–48页，公开日期 2012年04月01日）方法；PCR 终产物由6%聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，银染显色；1.4数据统计及分析，电泳条带案1/0形式进行数据转换（隐含公开了“根据条带有无差异，确定是否为芽变”），对分析结果进行聚类分析，发现所述SSAP引物可以有效地将苹果芽变品种区分，并指出所述分子标记为苹果遗传多样性与系统进化、品种鉴定提供新方法（参见对比文件1第299页1.1-第301右栏第2段）；
对于基因组DNA提取：对比文件1的引证文献8中指出，根据改良的CTAB方法从新鲜叶中提取基因组DNA（参考文献 “Isolation and characterization of genomic retrotransposo sequences from octoploid strawberry (Fragaria 9 ananassa Duch.)”, Ma et al.，Plant Cell Rep，第27卷，第499-507页，公开日期 2007年11月17日），该参考文献指出植物材料和核酸的分离：室温储存的CTAB溶液预热至65℃；使用体积比为24:1的氯仿－异戊醇代替氯仿－辛醇；在转速为10000 r/min的离心机中离心10min；在DNA沉淀前加入1μL 的10 mg/mL RNase A、37℃下处理1小时（参见参考文献第500页右栏第16-28行）；
对于SSAP分析：包括双酶切反应、连接反应、预扩增反应和选择性扩增反应的流程，具体参考P. He等（参见对比文件1的引证文献10）方法。对比文件1的引证文献 10公开了双酶切反应如下：采用EcoRI和MseI对300-500ng 基因组DNA在37℃进行双酶切反应；随后进行连接反应，体系中含有：T4 ligation buffer, 酶切DNA，EcoRI和MseI adapters, T4 DNA连接酶。所述SSAP引物及接头序列参见对比文件1的表2，与本申请权利要求1所述引物序列完全相同。预扩增反应如下：利用不含有选择性碱基的EcoR I和Mse I引物进行预扩增反应，体系如下：总体积25μl, 含有引物各10pM, 200μM dNTPs, 1U Taq DNA聚合酶，5μl DNA；反应条件如下：95℃ 1min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 2min，25个循环；72℃ 7min延伸；选择性扩增反应如下：使用2-3条EcoR I和Mse I的选择性引物和一条基于反转录转座子设计物引物进行选择性扩增，体系如下：20μl PCR体系，含有1% 预扩增DNA，引物各10pM, 200μM dNTPs, 0.5U Taq DNA聚合酶；反应条件如下：94℃ 30s，70℃ 1min-0.7℃/cycle, 72℃ 1min，13 times；94℃ 30s， 56℃ 1min，72℃ 1min，25个循环。PCR产物电泳检测方法如下：对PCR产物采用6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离，银染显色（具体参见对比文件1的引证文献10第44页2.2节）。
权利要求1与对比文件1公开的内容相比，区别特征在于：①权利要求1要求保护通过SSAP分子鉴定方法对疑似芽变样本进行初选，并对芽变样本进行芽变资源扩繁得到品种体系，对得到的品种体系进行果实质量和经济性状评价，确定是否为新品种的苹果选种方法，而对比文件1公开的是通过SSAP分子标记鉴定苹果芽变品种的方法。②权利要求1具体限定了初选、复选、决选步骤，以及各步骤中的操作；对此，对比文件1没有公开。③两者在SSAP分子鉴定方法的流程上相同但具体操作细节的描述上略有差异，如权利要求1具体描述了基因组DNA提取的液氮研碎样品，CTAB溶液配制和使用、反应体系、反应条件、电泳凝胶的制备等。④权利要求1具体限定苹果芽变新品种即泰山嘎拉选育过程，而对比文件1公开SSAP能够有效鉴别泰山嘎拉品系。基于上述区别技术特征可知，本申请实际解决的技术问题是，提供一种具体的基于SSAP鉴定芽变苹果选种的方法。
对于区别技术特征①，如前所述，对比文件1公开了基于SSAP分子标记技术鉴定苹果芽变品种的方法，且对比文件2公开了果树芽变选种的程序（参见对比文件2第29页右栏第3段－第30页左栏第3段）需要经过初选、复选、决选；其中（1）、初选种指出，发掘优良变异，对变异进行分析，剔除饰变，可通过检查染色体数目、结构、DNA遗传物质变化等进行直接鉴定（参见对比文件2第29页右栏4.1节），因而根据对比文件2的教导，本领域技术人员容易想到将对比文件1的SSAP分子标记用于苹果芽变选种的方法中，并在初选后进一步对芽变样本进行果实质量和经济性状评价，确定芽变样本是否为新品种。
对于区别技术特征②，对比文件2公开了果树芽变选种的程序（参见对比文件2第29页右栏第3段－第30页左栏第3段）：（1）、初选 对变异进行分析，剔除饰变 可通过检查染色体数目、结构、DNA遗传物质变化等进行直接鉴定，也可将变异类型与对照通过无性繁殖到相同的环境下进行比较鉴定。（2）、复选 选种圃 一些虽已肯定是优良芽变，但还有某些性状未充分了解者，均进复选圃作全面鉴定。复选圃除进行芽变系与原品种间的比较鉴定外，同时也进行芽变系种间的比较鉴定，为繁殖推广提供可靠依据。复选圃地的土壤地势地力要求一致；每系不少于10株，在圃内采用单行小区，每行5株，重复2次；异花授粉的种类，授粉品种可作为保护行配置；砧木宜用当地惯用类型，并注意砧木的一致性（隐含公开将待选样本嫁接到砧木上，再定植选种圃中进行培育和观察）。（3）、决选 选种单位对复选合格品系提出复选报告后，由主管部门组织有关人员进行决选评审。经过评审，确认在生产上有前途的品系，可由选种单位予以命名，由组织决选的主管部门作为新品种予以公布。决选时，选种单位应提供完整的资料，包括不少于3年的连续观察数据（隐含公开了复选阶段应进行至少连续3年的观察数据），不同区域的生产试验结果，选种历史、实物等。由此可见，对比文件2教导了苹果芽变选种的一般程序为：初选、复选、决选，其中初选步骤中可发掘优良变异、并通过DNA遗传物质变化的方法进行鉴定从而分析是否为芽变，排除饰变；复选步骤中将样本嫁接至砧木上并定植选种圃中，进行至少连续3年的观察记录，以充分了解芽变样本的性状；决选步骤中对芽变样本进行评审，确认在生产上有前途的品系并命名。虽然权利要求1限定的初选、复选和决选步骤与对比文件2教导的选种程序不完全相同，例如权利要求1限定了选种时对样本进行登记编号并作出明显区别的标记，复选中分别嫁接到矮化苹果砧上，还限定了对品系评价的具体时间和观察记录的内容，然而所述特征均是苹果的芽变选种中的常规技术手段和注意事项，不需要付出所属领域技术人员的创造性劳动。
对于区别技术特征③，权利要求1所述的SSAP流程与对比文件1公开的流程相同，均是CTAB法提取叶片DNA，双酶切、连接、预扩增、选择性扩增反应，PCR终产物电泳检测。其具体操作参数和步骤是本领域技术人员根据常规技术手段结合有限的试验即可获得的，并且其效果也是可预期的，因而这些细节上的差异并没给本申请带来创造性。
对于区别技术特征④，对比文件1已公开了所述37份供试材料中包含泰山嘎拉品系，图4的聚类分析图表明对比文件1所开发的SSAP引物能够有效鉴别泰山嘎拉品系。因此将所述引物用于苹果芽变品种泰山嘎拉的选育是显而易见的。
综上，在对比文件1的基础上结合对比文件2的教导和本领域的常规技术手段，获得权利要求1的技术方案是显而易见的。权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、关于复审请求人的陈述意见
针对复审请求人的意见陈述，合议组认为：如前所述，对比文件1已经公开了SSAP分子标记有效鉴定苹果芽变品种泰山嘎拉的方法，在此基础上，将其应用于泰山嘎拉新品种的选育是根据科学研究规律所能合理预期的。且对比文件2公开的是苹果芽变选种的一般程序，包括初选、复选和决选过程，并给出了果树芽变选种的初选，对变异进行分析，剔除饰变中，可通过检查DNA遗传物质变化等进行直接鉴定的启示（参见对比文件2第29页右栏4.1节），因而本领域技术人员容易想到和做到将对比文件1的SSAP分子标记用于苹果芽变选种的方法中。同时，SSAP分子标记技术、苹果芽变的初选、复选、决选程序均属于本领域技术人员所熟知的步骤，本领域技术人员通过有限的试验即可获得其控制条件等，不需要付出创造性的劳动，获得缩短苹果选种的选育周期，提高选种准确性的效果也是本领域技术人员根据分子标记的特点即可预期的。调整引物浓度以避免二聚体形成是本领域的惯用手段，其效果也是本领域技术人员可预期的。从本申请说明书可知，本申请的主要技术构思在于在苹果选种中通过SSAP分子鉴定方法对发现的疑似芽变样本确定是芽变样本和还是饰变样本（参见本申请第4-5段，图1），然而，对比文件1已经公开了本申请相同引物的SSAP分子鉴定方法可以鉴定苹果芽变品种，本领域技术人员在对比文件2的启示下有动机将其应用于苹果选种的方法中，即在对比文件1的基础上结合对比文件2的教导和本领域的常规技术手段，获得权利要求1的技术方案是显而易见的，且效果也是可预期的，因而本申请不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。综上，复审请求人的意见陈述不具备说服力。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下复审决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年09月05日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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