发明创造名称：一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法
外观设计名称：
决定号：187614
决定日：2019-08-13
委内编号：1F239585
优先权日：
申请（专利）号：201410560780.5
申请日：2014-10-21
复审请求人：吉林师范大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：汪建斌
合议组组长：王迪
参审员：张敏
国际分类号：A01H4/00
外观设计分类号：
法律依据：专利法第33条
决定要点
：如果修改的内容没有记载在原说明书和权利要求书中，也不能由原说明书和权利要求书文字记载的内容以及说明书附图直接地、毫无疑义地确定，则该修改不符合专利法第33条的规定。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410560780.5，名称为“一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法”的发明专利申请。申请人为吉林师范大学。本申请的申请日为2014年10月21日，公开日为2016年05月18日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年09月06日发出驳回决定，以权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为2017年04月19日提交的权利要求第1项，申请日 2014年10月21日提交的说明书第1-4页（即第1-20段），2015年01月16日提交的说明书摘要。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法，其特征在于：包括如下步骤： 1)挑选大小均匀、无明显异色、籽粒饱满的玉米种子备用； 2)取步骤1)挑选的玉米种子用自来水冲洗，冲洗时间为20-30分钟，然后将冲洗后的玉米种子置于超净工作台上用质量分数为75％酒精漂洗，漂洗的时间为0.5-1分钟，漂洗以后接着再用质量分数为2％的次氯酸钠消毒漂洗后的玉米种子，消毒的时间为10分钟，最后用无菌水冲洗3-5遍，即可。”
驳回理由认为：权利要求1要求保护一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法，对比文件1（CN104082132 A，公开日为2014年10月08日）公开了一种甜玉米单倍体化学浸种加倍方法的方法（参见实施例1）。权利要求1与对比文件1相比，其区别技术特征在于：权利要求1限定了将该消毒方法运用于玉米成熟胚组织培养中，还增加了挑选玉米种子的和对种子用自来水冲洗的步骤，且两者在消毒过程中的某些具体做法存在差异。对于该区别技术特征，对比文件2（“玉米成熟胚组织培养的研究进展”，王洪振等，种子，第33卷第8期，第52-54页，公开日为2014年08月31日）指出种子收获干燥后易于大量保存，成熟胚取材方便，不受时间和数量限制，是一种较理想的适用于玉米组织培养的外植体（参见第52页左栏第1段），故所属技术领域的技术人员有动机借鉴对比文件1中的玉米种子消毒方法，将其应用于玉米成熟胚组织培养。且在消毒之前挑选性状良好的种子并选择大小均匀、无明显异色、籽粒饱满这类性状作为挑选指标也是本领域的常规做法。另外，对比文件2还公开了在给玉米成熟胚组织培养一步消毒法的操作过程中取成熟玉米种子在自来水下冲洗干净（参见第52页右栏第1.1节），而冲洗时间及将其置于超净工作台上进行后续操作也是本领域的常规做法。在对比文件1公开用体积分数为75％乙醇消毒的基础上选择质量分数为75% 酒精漂洗消毒也无需付出创造性劳动，漂洗方式和具体消毒时间也是可以根据实际需要通过试验调整得到。另外，所属技术领域的技术人员知晓，对植物外植体进行消毒时常用2%~10%的次氯酸钠溶液（参见《哪里不懂查哪里 高中生物》，尹杰等，湖南师范大学出版社 湖南大学出版社，第309页，2014年07月）。可见，本申请所选用的2%的次氯酸钠浓度无需付出创造性劳动即可以实现。综上，权利要求1不具备创造性。
申请人吉林师范大学（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年12月07日向国家知识产权局提出了复审请求，但未修改申请文件。复审请求人认为：（1）对比文件1目的是保护一种甜玉米单倍体化学浸种加倍方法，对单倍体玉米种子进行消毒处理只是其中一个环节，没有对种子的消毒结果进行实验分析，消毒效果如何无法保证。而本申请涉及生物技术组织培养领域，不仅消毒过程与对比文件1明显不同，而且对玉米种子的消毒结果进行了优化和检测。因此不能依据对比文件1中的玉米种子消毒方法开展有关玉米成熟胚组织培养的实验，二者没有可借鉴性。本发明实际解决的技术问题是：如何对玉米成熟胚组织培养中的种子进行消毒的方法，从而保证消毒后对后续的组培材料的伤害降到最低。（2）本申请使用次氯酸钠而非升汞，在酒精浓度的选择和处理时间上，以及自来水冲洗时间等都是有区别的，本申请提出的玉米成熟胚组织培养中玉米种子消毒方法是一个完整、连续的工艺流程，每一个步骤的处理时间以及溶液的选择对整个消毒效果以及成熟胚的影响都是至关重要的，该方案是经过无数次的辛苦实验得到的实用性强的消毒方法。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年01月12日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，虽然对比文件1中将玉米种子消毒之后经秋水仙素加倍处理然后进行了播种移栽，但是本领域技术人员知晓，将种子消毒之后经秋水仙素加倍再用于植物组织培养过程也是本领域常见做法。而且本申请与对比文件1均涉及对外植体消毒的方法，因此本领域技术人员有动机在面临玉米组织培养相关问题时借鉴对比文件1中的玉米种子消毒方法，将其对玉米种子进行消毒的方法应用于玉米成熟胚组织培养。在对比文件1给出的消毒方法基础上，依据具体消毒的种子类型等实际情况，本领域技术人员有动机采用正交实验调整消毒剂浓度和处理时间，以获得较佳的消毒效果并保证成熟胚良好的生物活性，且酒精和次氯酸钠的使用浓度也落在本领域的常规范围内，因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019 年 01月31 日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1（参见实施例1）相比，区别技术特征在于：（1）限定了种子来源于玉米成熟胚组织培养中，还限定了挑选玉米种子和对种子先用自来水冲洗的步骤；（2）两者使用的次氯酸钠溶液的浓度以及处理时间不同。权利要求1实际解决的技术问题为如何对玉米成熟胚组织培养中的种子进行消毒，从而保证消毒后对后续的组培材料的伤害降到最低。对于区别技术特征（1），对比文件2指出种子收获干燥后易于大量保存，成熟胚取材方便，不受时间和数量限制，是一种较理想的适用于玉米组织培养的外植体（参见第52页左栏第1段），故本领域技术人员有动机将其对玉米种子进行消毒的方法应用于本申请。在消毒之前挑选大小均匀、无明显异色、籽粒饱满等性状良好的种子是本领域的常规做法。另外，对比文件2给出了在对玉米种子进行消毒之前将其先在自来水下冲洗的技术启示，而冲洗的时间和随后将其置于超净工作台上进行后续操作也是本领域的常规做法。对于区别技术特征（2），本申请所选用的2%的次氯酸钠浓度也在对植物外植体进行消毒时常用的次氯酸钠浓度范围内，且处理时间基于玉米种子原料的实际情况可以尝试调整。故权利要求1不具备创造性。对于复审请求理由，合议组认为：（1）虽然本申请与对比文件1解决的技术问题不同，但中间环节均涉及玉米种子的消毒问题，因此本领域技术人员有动机选择对比文件1中的玉米种子消毒方法，将其应用于本申请的玉米成熟胚组织培养。（2）采用本领域常规的优选实验调整为低浓度的次氯酸钠和较短的处理时间，以保证消毒条件的温和以及获得较佳的消毒效果，对于本领域人员来说无需克服技术障碍。且消毒处理后的种子培养之后无污染以及诱导率高的技术效果是能够合理预期的。
复审请求人于2019 年02 月27 日提交了意见陈述书以及修改后的权利要求书全文替换页（共1项2页），修改之处在于：权利要求1的步骤（3）增加了“每瓶10粒种子”，步骤4）中连续观察4天修改为分别于24小时、48小时、72小时和96小时后进行观察，步骤6）愈伤诱导培养基为MS培养基添加：谷氨酸(300mg/L) 酪蛋白水解物(500mg/L) 脯氨酸(700mg/L) KT(0.5mg/L 2,4-D(2mg/L) 3％蔗糖 琼脂(7.5g/L),PH5.8，灭菌分装后备用；其中2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）的浓度与实施例1的不一致。步骤8)平玉2B、神56和郑单985玉米种子经过消毒处理和愈伤组织诱导，成熟胚愈伤组织诱导率分别为44.4％、54.3％和60％，而原始说明书实施例记载的平育2B、神56和郑单958诱导率分别为39.3%、54.3%和44.4%（参见实施例1、3、2）。复审请求人认为：（1）对比文件1处理的种子只能保证具有良好生物活性，不能保证完全无菌，实施例中也没有检测玉米种子消毒的内容。现有技术有关玉米种子的消毒方法没有直接应用于玉米成熟胚组织的培养。本申请有明确的检测玉米种子消毒处理效果的实验。（2）本申请经过无数实验优化的玉米成熟胚组织培养中种子消毒方法能够获得较高的成熟胚愈伤组织诱导率，取得了意想不到的技术效果。
复审请求人此次提交的权利要求书如下：
“1. 一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)挑选大小均匀、无明显异色、籽粒饱满的玉米种子备用；
2)取步骤1)挑选的玉米种子用自来水冲洗，冲洗时间为30分钟，然后将冲洗后的玉米种子置于超净工作台上用质量分数为75％酒精漂洗，漂洗的时间为0.5-1分钟；漂洗以后接着再用质量分数为2％的次氯酸钠消毒漂洗后的玉米种子，消毒的时间为10分钟，最后用无菌水冲洗3-5遍，即可；
3)将消毒后的种子放入无菌50ml三角瓶中，每瓶10粒种子，加入无菌水，以刚能浸没为准；
4)将上述处理的种子放入培养箱中暗培养，温度设为26℃，以种子长菌和无菌水变浑浊为污染标准，分别于24小时、48小时、72小时和96小时后进行观察；观察结果表明，经过上述消毒处理的玉米种子没有长菌，无菌水也没有变浑浊，说明此消毒方法消毒玉米种子取得明显的消毒效果；
5)取平玉2B、神56和郑单985玉米种子，经过上述消毒方法处理，无菌水浸泡72小时后，剥取成熟胚，沿胚轴纵切两半，切口向下接种于MS愈伤诱导培养基上；
6)愈伤诱导培养基为MS培养基添加：谷氨酸(300mg/L) 酪蛋白水解物(500mg/L) 脯氨酸(700mg/L) KT(0.5mg/L 2,4-D(2mg/L) 3％蔗糖 琼脂(7.5g/L),PH5.8，灭菌 分装后备用；
7)在26℃智能光照培养箱中暗培养，三周后统计玉米成熟胚愈伤组织诱导率；
8)平玉2B、神56和郑单985玉米种子经过消毒处理和愈伤组织诱导，成熟胚愈伤组织诱导率分别为44.4％、54.3％和60％。”
合议组于2019年05月30日发出第二次复审通知书，指出：新修改的权利要求1 的步骤3）中“每瓶10粒种子”未记载在原始权利要求书和说明书中。步骤4）中的分别于24小时、48小时、72小时和96小时后进行观察与说明书实施例1记载的连续观察4天的意思也并非完全一致。步骤6）愈伤诱导培养基为MS培养基添加：谷氨酸(300mg/L) 酪蛋白水解物(500mg/L) 脯氨酸(700mg/L) KT(0.5mg/L 2,4-D(2mg/L) 3％蔗糖 琼脂(7.5g/L),PH5.8，灭菌分装后备用；而说明书实施例1针对平育2B种子的愈伤诱导培养基为MS培养基添加: Glu（L-谷氨酸）(300 mg/L) CH（水解酪蛋白）(500 mg/L) Pro（L-脯氨酸）(700 mg/L) KT（激动素）(0.5 mg/L) 3% 蔗糖 琼脂(7.5g/L)，2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）浓度为1mg/L，pH 5.8。两者的2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）浓度不一致。步骤8)平玉2B、神56和郑单985玉米种子经过消毒处理和愈伤组织诱导，成熟胚愈伤组织诱导率分别为44.4％、54.3％和60％，而原始说明书实施例记载的平育2B、神56和郑单958诱导率分别为39.3%、54.3%和44.4%（参见实施例1、3、2）。即上述修改是本领域技术人员不能从原始申请文本中直接地、毫无疑义的确定，因此复审请求人对权利要求1的修改超范围，不符合专利法第33条的规定。即使复审请求人答复第二次复审通知书时将权利要求1改回驳回决定针对的文本，克服了修改超范围的缺陷，但是依然存在创造性缺陷，具体理由见第一次复审通知书。
复审请求人于2019年07月03日提交了意见陈述书以及修改后的权利要求书全文替换页（共2页1项），修改之处在于：新修改的权利要求1的步骤（6）中2,4-D浓度为的1mg/L，而原始说明书记载的2,4-D浓度为2mg/L（参见说明书第17段）。新修改的权利要求1中郑单985种子2,4-D浓度为1mg/L，而原始说明书此处记载的2,4-D浓度为2mg/L（参见说明书第14段）。复审请求人认为：复审请求人对权利要求1进行了认真修改，具体修改内容如下：（1）将步骤（3）中“每瓶10粒种子”删掉；（2）将步骤（4）中“分别于24小时、48小时、72小时和96小时后进行观察”，修改为“连续观察四天”；（3）将步骤（6）中“2,4-D(2 mg/L)”修改为：“2,4-D(1 mg/L)”；（4） 将步骤（8）中“44.4%、54.3%和60%。”修改为：“39.3%、54.3%和44.4%。”上述修改内容在具体实施方式的实施例1至实施例3中均有记载，符合专利法第33条有关规定，已经克服了修改超范围的缺陷。
复审请求人此次提交的权利要求书如下：
1. 一种玉米成熟胚组织培养中的种子消毒方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)挑选大小均匀、无明显异色、籽粒饱满的玉米种子备用；
2)取步骤1)挑选的玉米种子用自来水冲洗，冲洗时间为30分钟，然后将冲洗后的玉米种子置于超净工作台上用质量分数为75％酒精漂洗，漂洗的时间为0.5-1分钟；漂洗以后接着再用质量分数为2％的次氯酸钠消毒漂洗后的玉米种子，消毒的时间为10分钟，最后用无菌水冲洗3-5遍，即可；
3)将消毒后的种子放入无菌50ml三角瓶中，加入无菌水，以刚能浸没为准；
4)将上述处理的种子放入培养箱中暗培养，温度设为26℃，以种子长菌和无菌水变浑浊为污染标准，连续观察四天；观察结果表明，经过上述消毒处理的玉米种子没有长菌，无菌水也没有变浑浊，说明此消毒方法消毒玉米种子取得明显的消毒效果；
5)取平玉2B、神56和郑单985玉米种子，经过上述消毒方法处理，无菌水浸泡72小时后，剥取成熟胚，沿胚轴纵切两半，切口向下接种于MS愈伤诱导培养基上；
6)愈伤诱导培养基为MS培养基添加：谷氨酸(300mg/L) 酪蛋白水解物(500mg/L) 脯氨酸(700mg/L) KT(0.5mg/L 2,4-D(1mg/L) 3％蔗糖 琼脂(7.5g/L),PH5.8，灭菌 分装后备用；
7)在26℃智能光照培养箱中暗培养，三周后统计玉米成熟胚愈伤组织诱导率；
8)平玉2B、神56和郑单985玉米种子经过消毒处理和愈伤组织诱导，成熟胚愈伤组织诱导率分别为39.3％、54.3％和44.4％。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在答复第二次复审通知书时提交了权利要求书全文替换页（共2页1项）。经审查，修改符合专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审请求审查决定针对的文本为：申请日 2014年10月21日提交的说明书第1-4页（即第1-20段），2015年01月16日提交的说明书摘要以及2019年07月03日提交的权利要求第1项。
2、关于专利法第33条
专利法第33条规定，申请人可以对其专利申请文件进行修改，但是，对发明和实用新型专利申请文件的修改不得超出原说明书和权利要求书记载的范围。
根据该款规定，如果修改的内容没有记载在原说明书和权利要求书中，也不能由原说明书和权利要求书文字记载的内容以及说明书附图直接地、毫无疑义地确定，则该修改不符合专利法第33条的规定。
本案中，复审请求人答复二通提交的权利要求1中，步骤5)取平玉2B、神56和郑单985玉米种子，经过上述消毒方法处理，无菌水浸泡72小时后，剥取成熟胚，沿胚轴纵切两半，切口向下接种于MS愈伤诱导培养基上；6)愈伤诱导培养基为MS培养基添加：谷氨酸(300mg/L) 酪蛋白水解物(500mg/L) 脯氨酸(700mg/L) KT(0.5mg/L 2,4-D(1mg/L) 3％蔗糖 琼脂(7.5g/L),PH5.8，灭菌分装后备用。但是，说明书实施例3记载的神56玉米种子接种的愈伤诱导培养基为MS培养基添加: Glu(300 mg/L) CH(500 mg/L) Pro (700 mg/L) KT(0.5 mg/L) 3% 蔗糖 琼脂(7.5g/L)，2,4-D浓度为2mg/L，pH 5.8。即原始说明书记载的2,4-D浓度为2mg/L（参见说明书第17段），非新修改的权利要求1的1mg/L。同理，郑单985种子原始说明书此处记载的2,4-D浓度为2mg/L（参见说明书第14段），非新修改的权利要求1的1mg/L。上述修改是本领域技术人员不能从原始申请文本中直接得、毫无疑义得确定，因此复审请求人对权利要求1的修改再次超范围，不符合专利法第33条的规定。
3、对复审请求人相关意见的评述
针对复审请求人答复第二次复审通知书的意见陈述，合议组认为：权利要求1的种子消毒方法涉及平玉2B、神56和郑单985三种玉米种子，从原始说明书记载来看，除平玉2B玉米种子愈伤诱导培养基中2,4-D浓度为1mg/L外，神56和郑单985两种玉米种子相对应的培养基中的2,4-D浓度均为2mg/L，复审请求人针对第一次复审通知书指出的超范围缺陷，机械的将三种玉米种子的2,4-D浓度统一修改为1mg/L，属于本领域技术人员不能从原始文本中直接的、毫无疑义的确定的修改，不符合专利法第33条的规定。综上，复审请求人的意见陈述不具有说服力，无法克服权利要求1修改超范围的缺陷。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下复审决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017 年09 月06 日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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