发明创造名称：一种构建遗传性状嵌合多细胞结构方法
外观设计名称：
决定号：186382
决定日：2019-08-09
委内编号：1F250317
优先权日：
申请（专利）号：201310214532.0
申请日：2013-05-31
复审请求人：复旦大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：邹凯
合议组组长：吴文英
参审员：杨莹跃
国际分类号：C12N5/071
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求请求保护的技术方案是本领域普通技术人员在最接近的现有技术的基础上结合本领域的公知常识通过合乎逻辑的分析和推理容易想到的，且未取得预料不到的技术效果，则该技术方案相对于所述最接近的现有技术与公知常识的结合不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201310214532.0，名称为“一种构建遗传性状嵌合多细胞结构方法”的发明专利申请。申请人为复旦大学。本申请的申请日为2013年05月31日，公开日为 2014年12月17日 。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年01月05日以权利要求1-5不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请，其理由是：1)权利要求1请求保护一种构建遗传性状嵌合多细胞结构方法。对比文件1（“Programmed Cell-to-Cell Variability in Ras Activity Triggers Emergent Behaviors during Mammary Epithelial Morphogenesis”，Jennifer S. Liu等，《Cell Reports》，第2卷，1461-1470页，公开日期为2012年11月29日）公开了一种构建遗传性状嵌合多细胞三维结构的方法。权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1限定了不同遗传背景的细胞，以及对细胞进行二维密集培养，并预先确定细胞是否具有细胞间连接，对于有细胞间连接的细胞培养构建三维结构限定了具体步骤。而本领域公知现有技术中存在着不同遗传背景的细胞可以产生细胞间连接以及共同培养的情况，采用二维密集培养并进一步构建细胞三维结构是本领域常规技术选择。同时，在对比文件3（“第十八章 体外细胞三维培养技术”，彭双清 等，《毒理学替代法》，北京：军事医学科学出版社，2009年1月第1版，561-570页，2009年1月31日）给出细胞可通过细胞间连接进行三维结构培养的启示的基础上，本领域技术人员在构建遗传性状嵌合多细胞三维结构时，有动机预先确定细胞是否具有细胞间连接。此外，对比文件1公开了对于NHS-DNA标记的两种细胞按比例在聚丙烯管中混匀，采用互补的DNA分子分别进行标记相当于建立了细胞间的连接；在此教导下，本领域技术人员可以想到针对具有细胞间连接的细胞悬浮后按比例混合，并置于低蛋白吸附的离心管中进行混匀，通过有限的试验即可确定静置的温度和时间，进而将细胞与培养液置于容器中生长形成有功能的三维结构，这是本领域的常规技术和常规操作，不会产生预料不到的技术效果。另外，为了进一步提高细胞间连接的效率，针对具有细胞间连接的细胞，本领域技术人员也可以采用NHS-DNA标记的方法进行三维结构的构建。综上，在对比文件1的基础上结合对比文件3以及本领域的常规技术和常规选择得到权利要求1的技术方案，对于本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具备创造性。从属权利要求2-5的附加技术特征或被对比文件1公开，或属于本领域的常规技术，因此也不具备创造性。驳回决定所依据的文本为申请日提交的说明书第1-6页、说明书摘要、摘要附图、说明书附图1-5以及2017年02月13日提交的权利要求1-5项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种构建遗传性状嵌合多细胞结构方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将需要嵌合的具有不同遗传背景的细胞群落进行免疫荧光的染色，确定这些细胞是否具有细胞间连接；对于有细胞间连接的细胞进行步骤(2)的操作；所述的细胞经过二维密集培养；
(2)培养细胞构建：
a.将所需不同遗传背景的细胞分别悬浮后，按比例混合，加入培养液置于低蛋白吸附的离心管内，室温下放置10-20分钟，使细胞在重力作用下沉淀到离心管底部，再取细胞与培养液置于容器中生长，形成有功能的三维结构。
2. 权利要求1所述构建遗传性状嵌合多细胞结构方法，其特征在于，所述不同遗传背景的细胞，包括：基于同一基础细胞通过基因工程手段实现遗传差异的细胞，或来源不同的细胞。
3. 权利要求2所述构建遗传性状嵌合多细胞结构方法，其特征在于，所述的基础细胞为MDCK细胞。
4. 权利要求1所述构建遗传性状嵌合多细胞结构方法，其特征在于，步骤(1)中，对由多聚甲醛固定的生长于二维平面的细胞样品，使用免疫荧光染色，根据荧光，检测观察细胞间粘着连接。
5. 权利要求1所述构建遗传性状嵌合多细胞结构方法，其特征在于，步骤(2)中，用细胞分选仪筛选混合后连接形成的细胞多聚体再进行培养，所述的细胞多聚体具有2-4个细胞。”
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2018年04月19日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了修改后的权利要求书（共1页4项），所作修改在于：删除了权利要求5，修改了权利要求1的部分文字表述。复审请求时新修改的权利要求1如下：
“1. 一种构建遗传性状嵌合多细胞结构方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将需要嵌合的具有不同遗传背景的细胞群落进行免疫荧光的染色，确定这些细胞是否具有细胞间连接；对于有细胞间连接的细胞进行步骤(2)的操作；
(2)将所需不同遗传背景的细胞分别悬浮后，按比例混合，加入培养液置于低蛋白吸附的离心管内，室温下放置10-20分钟，使细胞在重力作用下沉淀到离心管底部，再取细胞与培养液置于容器中生长，形成多细胞三维结构；
所述的多细胞三维结构具有中空的腔。”
结合上述修改后的权利要求书，复审请求人认为：（1）本发明与对比文件1的主要区别特征在于：对比文件1用互补的DNA分子标记不同的细胞，使细胞彼此接近装配，形成三维球状结构，以细胞分选仪筛选出装配连接后形成的细胞多聚体再进行三维培养。而流式细胞仪筛选和DNA标记操作难度大，对细胞有损伤，DNA标记方法导致形成的结构中细胞死亡率高，因此，并不能认为对比文件1采用互补DNA分子装配的方法给了本领域技术人员将有细胞连接的不同细胞通过混合静置连接到一起，形成遗传性状嵌合的多细胞结构的启示；而本发明的方案用产生细胞连接（如粘着连接）的细胞，通过将悬浮细胞置于低蛋白吸附离心管内混合和静置沉淀，使不同来源的细胞相互连接，不需要筛选分离细胞聚合体，取出细胞直接与培养液置于容器中生长，就获得具有空腔的三维多细胞结构。（2）虽然细胞三维培养技术提供了大量选择，但目前没有文献或专利证明产生的多细胞结构是中空单层的，无法有效模拟体内的上皮组织结构，也就是说，即使细胞培养成功、产生细胞连接，也不代表不同遗传背景细胞经过三维培养，就能够获得有功能的嵌合多细胞结构。本申请的方法随着细胞极化导致的定向分泌、细胞培养时间增长，腔室空间不断增大。这种方法看似简单，却相当有效，大大简化了操作过程。但如此简单的处理方法却一直以来被本领域技术人员所忽略，因此本发明的技术方案克服了本领域的技术偏见，具有意想不到的技术效果。而对比文件1用互补DNA分子装配后，所形成的多细胞结构是否能够在继续的培养中保持极性，经过多天培养后是否能产生如本发明的单层有序的上皮结构而满足药物筛选的要求是未知的，对比文件1并未给出技术启示。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年05月04日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年03月29日向复审请求人发出复审通知书，指出：1）对比文件1公开了对遗传性状嵌合多细胞三维结构的形成过程进行研究的内容。权利要求1与其的区别在于：权利要求1限定了预先确定细胞是否具有细胞间连接的步骤，同时限定了对于有细胞间连接的细胞进行悬浮、重力沉淀、再培养以构建三维结构的具体工艺，而对比文件1中未明确提及预先确定是否存在细胞连接的步骤，其中所公开的培养细胞聚集体形成三维结构的具体条件也与权利要求1存在一定差异。但对比文件1已经教导了细胞连接的建立对于后续细胞聚集体的形成和三维微组织形成的重要性，本领域技术人员基于对比文件1的教导容易想到在最终混合细胞培养三维结构组织之前需要先使不同细胞之间建立细胞连接。而不同细胞之间细胞连接的建立一方面可以通过人为添加互补DNA分子等方式来被动建立，另一方面也可以通过获取已经建立了细胞连接因此其表面存在一些细胞间粘附分子的细胞，依靠所获得的细胞表面上存在的粘附分子之间的相互作用来形成连接，因此，本领域技术人员基于对比文件1的教导容易想到通过先确定细胞之间是否有细胞连接，然后再对有连接的细胞进行操作以培养形成三维组织结构。在此教导下，容易进一步想到针对具有细胞间连接的细胞悬浮后按比例混合，并置于低蛋白吸附的离心管中进行混匀，通过有限的试验即可确定静置的温度和时间，进而将细胞与培养液置于容器中生长形成有功能的三维结构，这是本领域的常规技术和常规操作。综上，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。权利要求2限定了不同遗传背景的细胞的选择，权利要求3进一步限定权利要求2所述的基础细胞是MDCK细胞。对比文件1已经公开了利用表达H2B-RFP和H2B-GFP的两种MCF10A细胞（参见权利要求1的评述），实际操作中，本领域技术人员也可以选择来源不同的细胞（或不同遗传背景的细胞），而且对比文件1也公开了基础细胞可以是MDCK细胞的内容（参见1468页右栏第4段）。综上，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求2、3也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。权利要求4限定了检测细胞间粘着连接的方法，根据本领域普通技术知识，本领域技术人员容易想到确定检查细胞间粘着连接的方式，利用免疫荧光对由多聚甲醛固定的生长于二维平面的细胞样品进行染色，之后根据荧光检测观察细胞间粘着连接是本领域的常规操作。综上，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求4也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。2）对于复审请求人的意见陈述，合议组认为，如上所述，对比文件1的上述内容已经给出了建立了连接的细胞混合可以形成细胞聚集体并进而形成三维微组织的启示，本领域技术人员基于对比文件1的教导在一定程度上能够预期产生了细胞连接的细胞经过三维培养很可能会获得有功能的嵌合多细胞结构。基于此，容易进一步想到在最终混合细胞培养三维结构组织之前先使不同细胞之间建立细胞连接。通过获取已经建立了细胞连接因此其表面存在一些细胞间粘附分子的细胞，依靠所获得的细胞表面上存在的粘附分子之间的相互作用来形成连接是本领域技术人员容易想到的。对比文件1中已经公开了所形成的三维微组织呈球形，而且针对所述细胞聚集体形成三维结构的过程研究发现，细胞聚集体在培养过程中形成的天然的以蛋白为基础的粘附逐步代替了以DNA为基础的化学粘附，细胞极化和细胞间粘附分子的检测已经证明了这一点（参见对比文件1第1464页第1段），而且在进一步的延长的3D培养中，也出现了空腔的形成（参见对比文件1第1464页第2段），因此，并没有充分的证据表明在对比文件1的基础上继续培养相应的细胞，细胞会失去极性，事实上，基于对比文件1的教导，本领域技术人员能够在一定程度上预期进一步培养所述细胞能够形成有空腔的三维微组织结构。复审请求人所提出的“目前没有文献或专利证明产生的多细胞结构是中空单层的，无法有效模拟体内的上皮组织结构”的意见陈述不具有说服力。
复审请求人于2019 年06 月10 日提交了意见陈述书，未修改申请文件。复审请求人认为：1）对比文件1的记载表明：在细胞表面修饰互补DNA链，通过DNA杂交的作用，使不同遗传背景的细胞距离彼此接近，组装成细胞聚集体；经过分选后获得细胞聚集体，在DNA连接和三维培养条件下，原有的各细胞之间胞间连接加强，并进一步发生极化，从而形成有功能的遗传性状嵌合多细胞三维结构。简言之，本领域技术人员通过对比文件1所得到的技术启示为：细胞聚集体是因为DNA组装而实现的；细胞间连接在细胞聚集体的三维培养过程中可以起到形成三维结构的作用，但并没有提示细胞间连接的粘附分子在形成细胞多聚体中所起到的作用，因为经过培养的MCF10细胞或MDCK细胞在进行组装前就己经带有细胞间连接的粘附分子（例如图2A所示）。2）对比文件1记载，不经过NHS-DNA修饰的细胞，或者用错配DNA修饰的细胞，在混合后，经过离心和重悬，没有观察到细胞聚集体。需要指出的是，此处所采用的是离心方法，而非本方案的静置沉淀。本领域技术人员并不能从对比文件1中获得启示，认为将带有细胞间连接的不同遗传背景的细胞混合，用静置重力自然沉淀的方法代替离心沉淀，就能够使带有细胞间连接的细胞发生有效的自组装，形成细胞聚合体，并且可以经过三维培养得到遗传性状嵌合的多细胞结构。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在2018年04月19日提出复审请求时提交了修改后的权利要求书（共1页4项），经审查，所述修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审决定所针对的文本为申请日提交的说明书第1-6页、说明书摘要、摘要附图、说明书附图1-5以及2018年04月19日提交的权利要求第1-4项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明有突出的实质性特点和显著的进步。
如果权利要求请求保护的技术方案是本领域普通技术人员在最接近的现有技术的基础上结合本领域的公知常识通过合乎逻辑的分析和推理容易想到的，且未取得预料不到的技术效果，则该技术方案相对于所述最接近的现有技术与公知常识的结合不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
本案中，权利要求1请求保护一种构建遗传性状嵌合多细胞结构方法。对比文件1公开了对遗传性状嵌合多细胞三维结构的形成过程进行研究的内容，其中公开的形成遗传性状嵌合多细胞三维结构的具体步骤包括：利用表达H2B-RFP和H2B-GFP的两种MCF10A细胞（或者MCF10ARAS细胞、或者MCF10ARAS细胞和MCF10AWT细胞的混合物等），采用NHS标记的DNA对上述两种细胞进行表面标记，其中针对上述两种细胞分别进行标记的DNA分子互补，将标记后的细胞按比例在聚丙烯管（相当于低蛋白吸附管）中混匀混合、离心、重悬，两种细胞能够聚集形成小的聚集体，通过流式细胞术筛选所包含的细胞类型和细胞数量符合要求的多个小聚集,然后将细胞小聚集体直接在lrECM包覆的培养腔表面分别进行培养以形成球状的三维微组织，并对所形成的三维组织进行分析（参见对比文件1的1463-1467页、图1-2，以及1470页）。权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1限定了预先确定细胞是否具有细胞间连接的步骤，同时限定了对于有细胞间连接的细胞进行悬浮、重力沉淀、再培养以构建三维结构的具体工艺，而对比文件1中未明确提及预先确定是否存在细胞连接的步骤，其中所公开的培养细胞聚集体形成三维结构的具体条件也与权利要求1存在一定差异。基于上述区别特征，本发明实际解决的技术问题是提供一种不同的构建遗传性状嵌合多细胞结构的方法。
对此，合议组认为，对比文件1公开了利用NHS标记的DNA（NHS-DNA）标记两种细胞的过程，其中采用互补的DNA分子分别对不同细胞进行标记的根本目的就是为了建立细胞间连接，使两种细胞在进行混合的时候能够借助互补DNA分子搭建的连接桥形成含有两种细胞的聚集体。与标记细胞相比，未进行标记的细胞和标记错误的细胞在混合时不会形成两种细胞的聚集体也佐证了这一点（参见对比文件1结论部分第2段、图S1B）。由此可见，对比文件1的上述内容已经教导了细胞连接的建立对于后续细胞聚集体的形成和三维微组织形成的重要性，本领域技术人员基于对比文件1的教导容易想到在最终混合细胞培养三维结构组织之前需要先使不同细胞之间建立细胞连接。而不同细胞之间细胞连接的建立一方面可以通过人为添加互补DNA分子等方式来被动建立，另一方面也可以通过获取已经建立了细胞连接因此其表面存在一些细胞间粘附分子的细胞，依靠所获得的细胞表面上存在的粘附分子之间的相互作用来形成连接，因此，本领域技术人员基于对比文件1的教导容易想到通过先确定细胞之间是否有细胞连接，然后再对有连接的细胞进行操作以培养形成三维组织结构。在此教导下，容易进一步想到针对具有细胞间连接的细胞悬浮后按比例混合，并置于低蛋白吸附的离心管中进行混匀，通过有限的试验即可确定静置的温度和静置的时间，进而将细胞与培养液置于容器中生长形成有功能的三维结构，这是本领域的常规技术和常规操作。综上，在对比文件1的基础上结合及本领域的常规技术和常规选择得到权利要求1的技术方案，对于本领域技术人员来说是显而易见的。权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
权利要求2限定了不同遗传背景的细胞的选择，权利要求3进一步限定权利要求2所述的基础细胞是MDCK细胞。对比文件1已经公开了利用表达H2B-RFP和H2B-GFP的两种MCF10A细胞（参见权利要求1的评述），实际操作中，本领域技术人员也可以选择来源不同的细胞（或不同遗传背景的细胞），而且对比文件1也公开了基础细胞可以是MDCK细胞的内容（参见1468页右栏第4段）。综上，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求2、3也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
权利要求4限定了检测细胞间粘着连接的方法，根据本领域普通技术知识，本领域技术人员容易想到确定检查细胞间粘着连接的方式，利用免疫荧光对由多聚甲醛固定的生长于二维平面的细胞样品进行染色，之后根据荧光检测观察细胞间粘着连接是本领域的常规操作。综上，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求4也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
对于复审请求人意见陈述，合议组认为，1)对比文件1的图2A显示了细胞聚集体在后续的培养过程中的荧光染色变化，结合附图的描述可知，培养24小时时，细胞间的粘附分子开始富集（参见对比文件1的1464页第1段）。由上述内容可知，对比文件1中细胞间粘附分子的存在量是随着细胞培养状态动态变化的，其中所进行的细胞间粘附因子检测是在细胞形成聚集体之后才进行的，在聚集体形成之前，对比文件1并未对细胞之间的细胞粘附分子进行检测。在细胞间粘附分子的存在量会随着细胞培养状态发生动态变化的情况下，本领域技术人员由细胞形成聚集体之后所检测获得的细胞间粘附分子状态难以直接确定在形成聚集体之前的细胞间粘附分子状态，更难以由此直接得出对比文件1暗示或记载细胞在带有细胞间连接粘附分子的情况下，不能形成细胞聚集体的结论。上述内容间接表明，在形成细胞多聚体后，即使细胞间存在粘附分子介导的细胞连接，这种连接也相对比较弱,在后续的培养过程中才随着培养时间的延长得以进一步加强，如细胞聚集体培养12小时后才获得微组织极化。而微组织是否极化决定了是否能形成三维组织，可见粘附分子介导的连接对于后续细胞聚集体的形成和三维微组织形成的重要性，由此本领域技术人员容易想到在最终混合细胞培养三维结构组织之前需要先使不同细胞之间建立细胞连接。而已知不同细胞之间细胞连接的建立既可以依赖外源分子被动建立，也可以依靠细胞表面上存在的粘附分子之间的相互作用来形成。两种方式虽然存在一定的差异，但其目的都是使细胞之间建立连接。在此基础上，纵然对比文件1没有直接验证细胞间粘附分子建立的连接在形成细胞多聚体中所起到的作用，但本领域技术人员基于DNA被动连接形成聚集体的实例能够获得通过细胞间粘附分子建立连接来实现相似目的的技术启示。2)通过静置使某些种类的细胞在重力作用下自然沉降并通过细胞间连接自发性聚集来形成聚集体是本领域常用细胞3D培养模型中的一种，是本领域技术人员容易想到的。因此复审请求人的意见陈述不具有说服力。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年01月05日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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