发明创造名称：一株嗜乙酰乙酸棒杆菌基因工程菌及其合成琥珀酸的方法
外观设计名称：
决定号：185671
决定日：2019-08-01
委内编号：1F279607
优先权日：
申请（专利）号：201410737760.0
申请日：2014-12-05
复审请求人：江南大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：李娟娟
合议组组长：彭郁葱
参审员：王莉
国际分类号：C12N1/20，C12N15/77，C12P7/46，C12R1/15
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：当要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术存在区别技术特征时，如果现有技术给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术，以解决其存在的技术问题的技术启示，则该技术方案是显而易见的，不具有突出的实质性特点。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410737760.0，名称为“一株嗜乙酰乙酸棒杆菌基因工程菌及其合成琥珀酸的方法”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为江南大学。本申请的申请日为2014年12月05日，公开日为2015年02月25日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年08月09日以权利要求1-8不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：申请日2014年12月05日提交的说明书摘要、说明书第1-6页、说明书附图第1-2页、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-3页，以及2017年02月27日提交的权利要求第1-8项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一株嗜乙酰乙酸棒杆菌的基因工程菌株，其特征在于，是以乳酸脱氢酶基因ldhA缺失了的嗜乙酰乙酸棒杆菌△ldhA为出发菌株，过表达了编码丙酮酸羧化酶的基因pyc，以pXMJ19为表达载体过表达编码丙酮酸羧化酶的基因；所述基因pyc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2. 一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)PCR反应扩增或化学合成pyc基因片段；(2)将pyc基因片段测序验证后，连接到穿梭表达载体pXMJ19上，获得重组表达质粒pXMJ19-pyc；(3)将重组表达质粒转入乳酸脱氢酶基因缺失菌C. acetoacidophilum△ldhA中，通过氯霉素抗性筛选、验证获得阳性克隆子C. acetoacidophilum△ldhA/pXMJ19-pyc。
3. 权利要求1所述基因工程菌在琥珀酸生产中的应用方法。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，分为好氧和缺氧培养两阶段，好氧阶段是在25-37℃、200-800rpm、通气量20-200L/h的条件下培养菌体10-48h；进入缺氧阶段，停止通气，添加适量无机盐和微量元素，添加终浓度为60-120g/L葡萄糖和15-60g/L的碳酸氢钠，25-37℃继续培养30-100h，以生产积累琥珀酸，期间补加碳酸氢钠和葡萄糖，维持pH 6-9。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，从嗜乙酰乙酸棒杆菌△ldhA/pXMJ19-pyc甘油管中接取适量菌液至含1％葡萄糖的LB培养基中，25-37℃，100-300r/min条件下培养12-36h；按接种量1％-10％接入3L发酵罐中进行扩大培养，在25-37℃，200-800rpm，通气量20-200L/h的条件下好氧培养10-48h；之后停止空气的通入，添加适量无机盐和微量元素，添加终浓度为60-120g/L葡萄糖和15-60g/L的碳酸氢钠，25-37℃缺氧培养30-100h，期间补加碳酸氢钠和葡萄糖，并维持pH 6-9。
6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，好氧阶段采用的培养基成分按g/L计含有：葡萄糖10-50，K2HPO4 0.5-5，MgSO4?7H2O 0.5-5，FeSO4?7H2O 0.001-0.06，硫胺素0.00005-0.0005，生物素0.00002-0.0005，尿素0.5-5，玉米浆5-50，pH 7.0-7.2。
7. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，缺氧阶段添加的无机盐和微量元素的终浓度按g/L计为：K2HPO4 0.5-5，KH2PO4 0.5-5，MnSO4?H2O 0.0001-0.05，FeSO4?7H2O 0.001-0.06，MgSO4?7H2O 0.5-5，硫胺素0.00005-0.0005，生物素0.00002-0.0005。
8. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，缺氧阶段所述补加碳酸氢钠和葡萄糖，是当液体中葡萄糖浓度小于5-10g/L时，补加40-80g/L葡萄糖和10-40g/L碳酸氢钠。”
驳回决定指出：对比文件1（CN102634474A，公开日期：2012年08月15日）公开了一株嗜乙酰乙酸棒杆菌，权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）权利要求1限定的菌株还过表达编码丙酮酸羧化酶基因，并限定了基因序列如SEQ ID NO：3所示；（2）限定了以pXMJG19为过表达载体。对于区别技术特征（1），对比文件2（“An efficient succinic acid production process in a metabolically engineered Corynebacterium glutamicum strain”，Shohei Okino等，Appl Microbiol Biotechnol，第81卷第3期，第459-464页，公开日期：2008年09月06日）给出了在敲除了乳酸脱氢酶的谷氨酸棒杆菌中过表达丙酮酸羧化酶促进产生琥珀酸的启示，嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870生理生化特点与谷氨酸棒状杆菌相似，本领域技术人员为了提高对比文件1中嗜乙酰乙酸棒杆菌的琥珀酸产量，有动机过表达丙酮酸羧化酶；本领域技术人员为了使过表达的基因更易于被基因工程菌表达，有动机获取出发菌株自身的基因，进而构建过表达的载体。对于区别技术特征（2），表达载体pXMJ19属于本领域已商品化的产品，本领域技术人员可以根据需要选择具体的表达载体，其效果可以合理预期。因此，权利要求1不具备创造性。权利要求2所述方法限定的步骤属于本领域常规步骤。因此，在其涉及的基因工程菌不具备创造性的基础上，该权利要求2也不具备创造性。根据对权利要求1的评述，获得权利要求3的方法也是显而易见的，因此，权利要求3不具备创造性。权利要求4-8所述的附加技术特征或者被对比文件1、对比文件3（“嗜乙酰乙酸棒杆菌 Corynebacterium acetoacidophilumΔldh 缺氧条件下代谢葡萄糖途径的变化”，杨倩等，生物工程学报，第30卷第3期，第435-444页，公开日期：2014年03月25日）公开，或者为常规技术，因此，也不具备创造性。
申请人江南大学（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年01月24日向国家知识产权局提出了复审请求书，2018年01月22日提交了权利要求书全文替换页(共2页8项)以及意见陈述书，相对于驳回决定所针对的权利要求，修改之处在于：在权利要求1中增加“所述pXMJ19为表达载体过表达编码丙酮酸羧化酶的基因的PCR扩增引物序列为P1和P2，引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述引物的酶切位点，其中，所述P1引物的酶切位点为HindⅢ，所述P2引物的酶切位点为XbaI”。复审请求人认为：（1）本申请P1、P2引物设计、酶切位点的选取、载体的选择并非常规选择，以上选择能够实现对pyc基因的扩增、载体的构建，并能够表达长达3423bp的pyc基因，达到提高酶活四倍的效果，是非显而易见的，此外，参考文献1-3表明在谷氨酸棒杆菌及Aspergillus niger和Arthrobacter globiformis菌株中，丙酮酸羧化酶均被认为是不稳定的，进一步说明在嗜乙酰乙酸棒杆菌中表达pyc酶，实现高效保持酶活是不可预期的；（2）嗜乙酰乙酸棒杆菌与谷氨酸棒杆菌不属于生理生化特点相似的菌种；（3）本申请所构建的菌株表达pyc酶活性比对照菌株高四倍，而对比文件2仅为1.5倍，其副产物也显著高于本申请；本申请解决的技术问题并非提高琥珀酸产率，而是对过表达pyc基因生产琥珀酸的工艺进行优化；对比文件1和2需要在厌氧培养之前富集菌体，大大增加了生产成本，本申请不需要富集菌体，缩短了培养时间，简化了工艺，提高单位浓度菌体的琥珀酸产率，具有产琥珀酸浓度高和转化率高的优点，并大大降低了副产物乙酸的浓度。
意见陈述中提及的参考文献1-3如下：
1. Feir，H.A.等，“Pyruvate carboxylaseof Aspergillus niger：Kinetic study of a biotin-containing carboxylase”，Can. J. Biochem，第47卷，第697-710页， 1969年。
2. Gurr，J.A.等，“Purification and characterization of pyruvate carboxylase fromArthrobacter globiformis”，Arch. Biochem. Biophys，第179卷，第444-455页，1977年
3. Peters-Wendisch，P.G.等，“Pyruvatecarboxylase as an anaplerotic enzyme in Corynebacteriumglutamicum”，Microbiology，第143卷，第1095-1103页，1997年。
复审请求时新修改的权利要求1如下：
“1、 一株嗜乙酰乙酸棒杆菌的基因工程菌株，其特征在于，是以乳酸脱氢酶基因ldhA缺失了的嗜乙酰乙酸棒杆菌△ldhA为出发菌株，过表达了编码丙酮酸羧化酶的基因pyc，以pXMJ19为表达载体过表达编码丙酮酸羧化酶的基因；所述基因pyc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述pXMJ19为表达载体过表达编码丙酮酸羧化酶的基因的PCR扩增引物序列为P1和P2，引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述引物的酶切位点，其中，所述P1引物的酶切位点为HindⅢ，所述P2引物的酶切位点为XbaI。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年03月09日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2018年11月06日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1进一步限定（1）在嗜乙酰乙酸棒杆菌中过表达SEQ ID NO.3所示的丙酮酸羧化酶；（2）限定过表达载体为pXMJ19，以及扩增丙酮酸羧化酶基因的上下游引物P1、P2的序列及引物上的酶切位点。针对区别技术特征（1），对比文件2公开了一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，该工程菌是在敲除乳酸脱氢酶基因的基础上，进一步过表达丙酮酸羧化酶基因，丙酮酸羧化酶催化产生草酰乙酸，促进了琥珀酸的产生速率；还公开了在缺氧条件下，谷氨酸棒杆菌生长停滞，但保留了将葡萄糖代谢为L-乳酸、琥珀酸和乙酸的能力，并在图1中阐述了丙酮酸通过丙酮酸羧化酶在CO2存在下转化为草酰乙酸，进而能够生成琥珀酸，还记载了丙酮酸通过乳酸脱氢酶催化能够生成乳酸。对比文件3公开了一种培养乳酸脱氢酶缺失的嗜乙酰乙酸棒杆菌生产琥珀酸的方法，并公开了嗜乙酰乙酸棒杆菌也属于产谷氨酸棒杆菌，缺氧条件下嗜乙酰乙酸棒杆菌代谢以产有机酸为主，葡萄糖经糖酵解生成丙酮酸，从丙酮酸分3条途径，生成乳酸、琥珀酸、乙酸，并在图4中阐述了丙酮酸通过丙酮酸羧化酶在CO2存在下转化为草酰乙酸，进而能够生成琥珀酸，还记载了丙酮酸通过乳酸脱氢酶催化能够生成乳酸。对于本领域技术人员而言，嗜乙酰乙酸棒杆菌和谷氨酸棒杆菌同属于棒状杆菌属，两者代谢葡萄糖生成乳酸以及琥珀酸的机理相同，且在两种菌中乳酸脱氢酶催化产乳酸以及丙酮酸羧化酶催化产草酰乙酸、进而生成琥珀酸的作用也相同。因此，当本领域技术人员面对对比文件2、3的教导时，有动机将对比文件2所述的基因改造方法应用于嗜乙酰乙酸棒杆菌，即有动机在对比文件1所述的敲除了乳酸脱氢酶基因的嗜乙酰乙酸棒杆菌工程菌的基础上，进一步过表达丙酮酸羧化酶基因，用于增强琥珀酸的生产。此外，本领域技术人员为了使过表达的基因更易于被基因工程菌表达，有动机获取出发菌株自身的基因来构建过表达载体，即选择来自嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870原始菌株的丙酮酸羧化酶基因序列来构建过表达载体属于本领域的常规选择，在已知的丙酮酸羧化酶基因序列，例如对比文件2所述的谷氨酸棒杆菌的丙酮酸羧化酶基因序列的基础上，通过常规技术手段获取嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870菌株丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列也是很容易实现的。针对区别技术特征（2），根据目的基因以及菌株的性质，选择合适的表达载体来过表达目的基因，属于本领域的常规技术，权利要求1所述的pXMJ19表达载体也是本领域已商品化的常用载体，选择该载体在嗜乙酰乙酸棒杆菌中过表达丙酮酸羧化酶基因不需要付出创造性劳动。根据目的基因的序列以及所使用载体含有的酶切位点，来设计扩增引物，用于扩增目的基因序列以及构建相应的载体，均属于本领域的常规技术。因此，权利要求1不具备创造性。权利要求2所述方法及相关步骤均属于本领域构建基因工程菌的常规技术。在权利要求1的菌株不具备创造性的前提下，该权利要求2也不具备创造性。参照上述对权利要求1的评述可知，将权利要求1所述的工程菌用于琥珀酸生产是显而易见的。因此，权利要求3也不具备创造性。权利要求4-8所述的附加技术特征或者被对比文件1-3公开，或者为常规技术，因此，也不具备创造性。
由于复审请求人没有在规定期限内答复复审通知书，合议组于2019年01月28日发出复审案件结案通知书。
复审请求人于2019年01月31日提交了复审程序恢复权利请求书，同时提交了意见陈述书以及权利要求书的全文替换页（共2页7项），相对于复审通知书所针对的权利要求，修改之处在于：删除权利要求1中的“的PCR扩增引物序列为P1和P2，引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述引物的酶切位点，其中，所述P1引物的酶切位点为HindⅢ，所述P2引物的酶切位点为XbaI”；将原权利要求3与原权利要求4合并，适应性修改了权利要求的编号和引用关系。复审请求人认为：（1）本申请单位重量菌株在单位时间、单位体积内生产琥珀酸的速率高于对比文件2；（2）本申请菌株的琥珀酸生产速率高，因此不需要离心富集的要素，而对比文件2无法省略该要素；本申请的菌株已经提前签订了实施许可协议，进一步说明其比对比文件2的菌株效果好；（3）表达载体pXMJ19的选择使pyc酶活性显著提高，其属于目前为止的最优选质粒；（4）本申请使用廉价的培养基实现了琥珀酸的高效生产，降低了成本。
修改的权利要求1、3如下：
“1、一株嗜乙酰乙酸棒杆菌的基因工程菌株，其特征在于，是以乳酸脱氢酶基因ldhA缺失了的嗜乙酰乙酸棒杆菌△ldhA为出发菌株，过表达了编码丙酮酸羧化酶的基因pyc，以pXMJ19为表达载体过表达编码丙酮酸羧化酶的基因；所述基因pyc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述pXMJ19为表达载体过表达编码丙酮酸羧化酶的基因。”
“3、权利要求1所述基因工程菌在琥珀酸生产中的应用方法；所述方法分为好氧和缺氧培养两阶段，好氧阶段是在25-37℃、200-800rpm、通气量20-200L/h的条件下培养菌体10-48h；进入缺氧阶段，停止通气，添加适量无机盐和微量元素，添加终浓度为60-120g/L葡萄糖和15-60g/L的碳酸氢钠，25-37℃继续培养30-100h，以生产积累琥珀酸，期间补加碳酸氢钠和葡萄糖，维持pH6-9。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人于2019年01月31日提交了权利要求书全文替换页(共2页7项)。经审查，其修改符合专利法第33条的规定。本复审决定所针对的文本为：申请日2014年12月05日提交的说明书摘要、说明书第1-6页、说明书附图第1-2页、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-3页，以及2019年01月31日提交的权利要求第1-7项。
有关专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明有突出的实质性特点和显著的进步。
当要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术存在区别技术特征时，如果现有技术给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术，以解决其存在的技术问题的技术启示，则该技术方案是显而易见的，不具有突出的实质性特点。
本案中，权利要求1请求保护“一株嗜乙酰乙酸棒杆菌的基因工程菌株，其特征在于，是以乳酸脱氢酶基因ldhA缺失了的嗜乙酰乙酸棒杆菌△ldhA为出发菌株，过表达了编码丙酮酸羧化酶的基因pyc，以pXMJ19为表达载体过表达编码丙酮酸羧化酶的基因；所述基因pyc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述pXMJ19为表达载体过表达编码丙酮酸羧化酶的基因”。
对比文件1公开了一株嗜乙酰乙酸棒杆菌工程菌，并具体公开了以嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870为出发菌株，敲除其乳酸脱氢酶基因，其可以高产丁二酸（即琥珀酸）（参见对比文件1摘要、权利要求1和2，实施例1和2）。
权利要求1所请求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于：权利要求1进一步限定（1）在嗜乙酰乙酸棒杆菌中过表达SEQ ID NO.3所示的丙酮酸羧化酶；（2）限定过表达载体为pXMJ19。基于上述区别技术特征可以确定，权利要求1技术方案所要解决的技术问题是：进一步提高嗜乙酰乙酸棒杆菌产琥珀酸的能力。
针对区别技术特征（1），对比文件2公开了一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，并具体公开了该工程菌是在敲除乳酸脱氢酶基因的基础上，进一步过表达丙酮酸羧化酶基因，丙酮酸羧化酶催化产生草酰乙酸，促进了琥珀酸的产生速率；还公开了在缺氧条件下，谷氨酸棒杆菌生长停滞，但保留了将葡萄糖代谢为L-乳酸、琥珀酸和乙酸的能力，并在图1中阐述了丙酮酸通过丙酮酸羧化酶在CO2存在下转化为草酰乙酸，进而能够生成琥珀酸，还记载了丙酮酸通过乳酸脱氢酶催化能够生成乳酸（参见对比文件2摘要,460页左栏第2段，第463页右栏第2段，图1）。对比文件3公开了一种培养乳酸脱氢酶缺失的嗜乙酰乙酸棒杆菌生产琥珀酸的方法，并公开了嗜乙酰乙酸棒杆菌也属于产谷氨酸棒杆菌，缺氧条件下嗜乙酰乙酸棒杆菌代谢以产有机酸为主，葡萄糖经糖酵解生成丙酮酸，从丙酮酸分3条途径，生成乳酸、琥珀酸、乙酸，并在图4中阐述了丙酮酸通过丙酮酸羧化酶在CO2存在下转化为草酰乙酸，进而能够生成琥珀酸，还记载了丙酮酸通过乳酸脱氢酶催化能够生成乳酸（参见对比文件3第436页右栏第2段，第441页左栏第1段，图4）。对于本领域技术人员而言，嗜乙酰乙酸棒杆菌和谷氨酸棒杆菌同属于棒状杆菌属，两者代谢葡萄糖生成乳酸以及琥珀酸的机理相同，且在两种菌中乳酸脱氢酶催化产乳酸以及丙酮酸羧化酶催化产草酰乙酸、进而生成琥珀酸的作用也相同（参见对比文件2图1和对比文件3图4）。因此，当本领域技术人员面对对比文件2、3的教导时，有动机将对比文件2所述的基因改造方法应用于嗜乙酰乙酸棒杆菌，即有动机在对比文件1所述的敲除了乳酸脱氢酶基因的嗜乙酰乙酸棒杆菌工程菌的基础上，进一步过表达丙酮酸羧化酶基因，用于增强琥珀酸的生产。此外，本领域技术人员为了使过表达的基因更易于被基因工程菌表达，有动机获取出发菌株自身的基因来构建过表达载体，即选择来自嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870原始菌株的丙酮酸羧化酶基因序列来构建过表达载体属于本领域的常规选择，在已知的丙酮酸羧化酶基因序列，例如对比文件2所述的谷氨酸棒杆菌的丙酮酸羧化酶基因序列的基础上，通过常规技术手段获取嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870菌株丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列也是很容易实现的。针对区别技术特征（2），对于本领域技术人员而言，根据目的基因以及菌株的性质，选择合适的表达载体来过表达目的基因，属于本领域的常规技术，权利要求1所述的pXMJ19表达载体也是本领域已商品化的常用载体，选择该载体在嗜乙酰乙酸棒杆菌中过表达丙酮酸羧化酶基因不需要付出创造性劳动。由此可见，在对比文件1的基础上结合对比文件2、3以及常规技术以获得该权利要求所要求保护的技术方案，对所属技术领域的技术人员而言是显而易见的，该权利要求所要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2请求保护权利要求1所述工程菌的构建方法。对于本领域技术人员而言，当在菌株中过表达某一基因时，使用PCR方法或者化学合成方法来获得目的基因序列，经测序验证后，构建到表达载体上，将该重组表达载体转入相应菌株中，通过抗性筛选（例如氯霉素抗性筛选）并验证获得所需的阳性克隆，以上均属于本领域构建基因工程菌的常规技术。由此可见，在权利要求1的菌株不具备创造性的前提下，该权利要求2所述的方法也是显而易见的，不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求3请求保护权利要求1所述工程菌在琥珀酸生产中的应用方法，限定所述方法分为好氧和缺氧培养两个阶段，并限定了具体的培养条件等。对比文件1公开了嗜乙酰乙酸棒杆菌发酵生产丁二酸的方法，首先采用好氧培养基培养，在35℃、300rpm条件下培养36h，之后按照1%接种，扩大培养48h，离心收集菌体，之后转入缺氧环境培养，37℃培养36h，期间补加NaHCO3和葡萄糖，维持pH 8.5；其中缺氧条件下，培养基中含葡萄糖80g/l，碳酸盐60g/l、并且含有KH2PO4 1.5g/l、K2HPO4 1.5g/l、MgSO4·7H2O 1.5g/l、MnSO4·H2O 0.005g/l、FeSO4·7H2O 0.06g/l、硫胺素0.0004g/l、生物素0.0004g/l（参见对比文件1说明书第26-27段）。可见，对比文件1给出了在好氧和缺氧两阶段培养嗜乙酰乙酸棒杆菌发酵生产丁二酸的方法。除了权利要求1中所述的区别外，该权利要求3与对比文件1的区别技术特征还在于：权利要求3限定了好氧阶段的通气量；没有限定进入缺氧阶段前离心收集菌体，而是在好氧培养之后停止通气进入缺氧阶段；同时限定添加了碳酸氢钠，对比文件1培养基中限定为碳酸盐。虽然该权利要求还限定了好氧阶段的通气量，但是，对比文件1也是在好氧条件下培养菌株，本领域技术人员可以通过简单的实验确定合适的通气量。对比文件1在好氧培养之后，离心收集菌体，然后再进行厌氧培养，是为了增大菌体的浓度，更有利于琥珀酸单位体积的产率；对比文件2也公开了在发酵谷氨酸棒杆菌产琥珀酸时，随着菌体密度的增加，琥珀酸单位体积的生产速率提高（参见对比文件2第462页左栏第2段，图4），在此基础上，本领域技术人员能够根据生产的实际需要来权衡产率等与工艺步骤之间的利弊，在适当降低产率的同时，省略该富集的步骤，在好氧培养产物中直接补加营养物质，停止通气转入缺氧阶段，属于本领域的常规选择，该过程不存在技术障碍。对于厌氧条件下的培养基中碳酸氢钠的使用，因为对比文件1在缺氧条件下发酵期间补加了碳酸氢钠，用于琥珀酸的生产，在此基础上，将对比文件1培养基中的碳酸盐选择为碳酸氢钠是很容易想到的。因此，在权利要求1的菌株不具备创造性的前提下，该权利要求3也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求4对权利要求3做了进一步限定，具体限定了发酵步骤、设备和相关参数等。然而，对比文件1还公开了在含1%葡萄糖的液体LB培养基中培养嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870的技术方案（参见对比文件1说明书第22段），因此本领域技术人员有动机将保存于甘油管中的嗜乙酰乙酸棒杆菌菌种在上述LB培养基中活化，并且对比文件1也公开了在好氧或缺氧两阶段发酵培养、以及在缺氧阶段补加葡萄糖和碳酸氢钠的技术方案（参见权利要求3的评述），此外，对于相关参数以及3L发酵罐培养等都属于本领域常规选择以及常用发酵设备，本领域技术人员可以根据实际情况通过常规试验进行选择。因此，在其引用的权利要求3不具创造性的前提下，该权利要求4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求5、6对权利要求4的培养基做了进一步限定。针对权利要求5的附加技术特征，对比文件3公开了一种培养乳酸脱氢酶缺失的嗜乙酰乙酸棒杆菌生产琥珀酸的方法，其在耗氧条件下培养菌体，之后在缺氧条件下发酵产生琥珀酸（参见对比文件3摘要和第1.2.2节）；并具体公开了其菌体培养基（相当于好氧培养基）组成（g/l）：葡萄糖25、K2HPO4 1.5、MgSO4·7H2O 0.6、FeSO4 0.005（相当于FeSO4·7H2O 0.009）、硫胺素0.0002g/l、尿素2.5、玉米浆10、生物素0.0002g/l（参见对比文件3第1.1.3节第5段）；此外，对比文件1还公开了好氧培养基的pH为7.0-7.2（参见对比文件1说明书第25段）。由此可见，基于对比文件3和对比文件1的记载，本领域技术人员选择对比文件3的好氧培养基将其配置成pH为7.0-7.2，用于培养嗜乙酰乙酸棒杆菌是很容易做到的。针对权利要求6的附加技术特征，参见对权利要求3的评述可知，对比文件1公开了缺氧阶段的培养基，并公开了权利要求6所限定的无机盐和微量元素及相应的含量。因此，在其引用的权利要求不具创造性的前提下，该权利要求5、6也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求7是对权利要求4的进一步限定，其限定了缺氧阶段补加碳酸氢钠和葡萄糖的条件和相关浓度。然而，在对比文件1公开了在缺氧条件下补加碳酸氢钠和葡萄糖的基础上（参见权利要求3的评述），本领域技术人员可以通过简单的实验，确定添加时机以及合适的浓度。因此，在其引用的权利要求不具创造性的前提下，该权利要求7也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对复审请求人相关意见的评述
针对复审请求人的意见陈述，合议组认为：（1）首先，在发酵领域中，比较两种菌株及相关体系生产目的产物的效果指标，包括单位体积的产率、单位重量干细胞的产率、副产物/目的产物的比率、底物产物的转化率等等，需要根据实际生产的需求，对多个指标进行综合考量。其次，对于单位重量的干细胞在单位时间、单位体积内生产目的产物的产量，其受发酵过程中众多因素的影响，例如对比文件2提及了发酵过程中碳酸氢盐浓度对产物的产率和产量有直接的影响（参见对比文件2摘要）。对比文件2公开了该工程菌在60g/L的干细胞浓度下，生产琥珀酸的产率是16.8g/Lh（参见对比文件2第462页左栏第2段），即单位重量的干细胞在单位时间、单位体积内生产目的产物的产率为0.28；还公开了在发酵7小时时琥珀酸浓度是83g/L（参见对比文件2表1），基于对比文件2的记载，初步可以推定其采用高密度的细胞发酵，浓度在50g/L左右，经换算，单位重量的干细胞在单位时间、单位体积内生产目的产物的产率约为0.24；其远高于46小时时0.064的产率，由此可见，同一菌株在不同的发酵时间点时，其单位重量的产率也是相差悬殊的。最后，本申请并没有给出其相应OD610nm所对应的菌体浓度，由于对比文件2所述菌株以及检测环境不同与本申请，因此，不能简单的将对比文件2所述的OD610nm对应的菌体浓度照搬到本申请中，进行相关计算。由此可见，基于目前的数据，无法得出本申请的菌株相对于对比文件2所述菌株产生了预料不到的技术效果。（2）有关实施许可，其涉及多方面的因素，因此，本申请提前签订实施许可的协议，无法证明本申请的菌株相对于对比文件2产生了何种更好的效果。有关琥珀酸的产生，对比文件2公开了46小时，琥珀酸达到146g/L（参见对比文件2摘要，图5），而本申请发酵约46小时后累计了约77g/L（参见本申请图3）；有关副产物乙酸的产生，在发酵46小时，对比文件2积累了0.27mol/L（16g/L左右）（参见对比文件2图5），本申请在约46小时，积累了约为0.21mol/L（13g/L左右）（参见本申请图3），以上数据能够粗略看出，按照乙酸与琥珀酸的单位体积的产生比率来看，对比文件2比本申请要低，况且当本申请在发酵约92小时后，琥珀酸累计量约为110g/L，其乙酸量达到了约20g/L（约0.32mol/L）（参见本申请图3），即在产生等量的琥珀酸的前提下，本申请所述菌株生产的副产物乙酸的量要远高于对比文件2，而且其单位体积生产琥珀酸的速率要远低于对比文件2；有关将葡萄糖转化为琥珀酸的转化率，对比文件2为0.92g/g（参见对比文件2摘要），而本申请为0.88g/g（参见本申请说明书第15段）。由此可见，无论是琥珀酸的单位体积的产生速率、副产物/目的产物的比率、底物产物的转化率，对比文件2都明显优于本申请，本申请省略了富集菌体的步骤，其相应的发酵效果也变差。对比文件2已经明确公开了在发酵谷氨酸棒杆菌产琥珀酸时，菌体的密度与琥珀酸的单位体积生产速率是正相关的（参见对比文件2第462页左栏第2段，图4）。由此可见，本申请相对于对比文件2省略了菌体富集步骤之后，降低了琥珀酸单位体积生产速率等技术效果是在可预期范围之内的。（3）对于本领域技术人员而言，根据目的基因以及菌株的性质，选择合适的表达载体来过表达目的基因，属于本领域的常规技术，权利要求1所述的pXMJ19表达载体也是本领域已商品化的常用载体，通过有限试验，选择该载体在嗜乙酰乙酸棒杆菌中过表达丙酮酸羧化酶基因不需要付出创造性劳动。（4）对比文件3已经公开了使用含玉米浆的类似培养基来发酵嗜乙酰乙酸棒杆菌生产琥珀酸，本领域技术人员能够根据需要来选择合适的培养基进行嗜乙酰乙酸棒杆菌生产琥珀酸的发酵反应，该选择并没有取得意料之外的技术效果。综上所述，复审请求人的意见陈述不具备说服力。
基于上述事实和理由，合议组作出如下复审决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年08月09日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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