发明创造名称：一种基于电化学探针检测还原型谷胱甘肽的方法
外观设计名称：
决定号：185577
决定日：2019-08-01
委内编号：1F269279
优先权日：
申请（专利）号：201610764935.6
申请日：2016-08-31
复审请求人：桂林电子科技大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：李明瑞
合议组组长：贺文晶
参审员：黄斌
国际分类号：G01N27/48
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：在创造性判断中，通常根据权利要求与最接近的对比文件的区别技术特征确定发明实际解决的技术问题，之后判断现有技术中是否给出了将所述区别技术特征应用到最接近的对比文件、以解决发明实际解决的技术问题的技术启示，如果不能够找到这样的技术启示，且权利要求所要求保护的技术方案具有有益的技术效果，则权利要求相对于所引用的对比文件具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610764935.6，名称为“一种基于电化学探针检测还原型谷胱甘肽的方法”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请日为2016年08月31日，公开日为2017年02月15日，申请人为桂林电子科技大学。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年09月21日以本申请权利要求1-3不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本申请。驳回决定中引用了如下对比文件：
对比文件1：“Synthesis，characterization and fluorescent properties of cerium(III) glutathione complex”，Guo-Cheng Han等，Luminescence，第25卷，第389-393页，公开日期为2009年08月27日。
驳回决定所依据的文本为：申请日2016年08月31日提交的权利要求第1-3项、说明书第1-26段、说明书附图1-2、说明书摘要和摘要附图。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种基于电化学探针检测还原型谷胱甘肽的方法，包括如下步骤：
步骤一，探针储备溶液的配置
准确称量CeSO4?4H2O，加入蒸馏水超声溶解，然后转入容量瓶中定容，配制成1.0 mmol/LCe(IV) 探针储备溶液；
步骤二，测定探针离子对还原型谷胱甘肽的选择性
将探针储备溶液用蒸馏水稀释，使最终探针离子的浓度为10.0 nmol/L；将待测样品半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的浓度配制为5.0 nmol/L，将探针与待测溶液反应0.5小时后，在CHI660D电化学工作站上应用DPV法进行测定电流-电压曲线；
步骤三，测定探针离子对还原型谷胱甘肽的电流-浓度曲线
将探针储备溶液用蒸馏水稀释，使最终探针离子的浓度为10.0 nmol/L，谷胱甘肽的浓度为0.15，0.4，0.5，0.75，1.5，3.0，5.0 nmol/L，将探针与待测溶液反应0.5小时后，在CHI660D电化学工作站上应用DPV法进行测定，进而得到电流值对浓度变化的曲线，通过计算得出谷胱甘肽的检测限；
步骤四，还原型谷胱甘肽的检测
通过DPV法，将待测样品进行还原型谷胱甘肽测定，根据电流值和线性方程可计算出还原型谷胱甘肽的浓度，实现还原型谷胱甘肽的分析检测。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述还原型谷胱甘肽的检测限为0.05 nmol/L。
3. 按照权利要求1所述的方法所得到的电化学探针为1.0 mmol/LCe(IV)。”
驳回决定认为：本申请权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1的区别在于：对比文件1使用电化学法测试Ce(III)(GSSG)复合物，权利要求1使用电化学法检测还原型谷胱甘肽的浓度；具体检测过程中，制备Ce(SO4)2?4H2O溶液时采用超声溶解和定容的方法配置；测试了探针离子对还原型谷胱甘肽的选择性，以及具体的测试方法；探针离子对还原型谷胱甘肽的电流-浓度曲线以及具体的测定方法；利用DPV法，电流值和线性方程可计算出还原型谷胱甘肽的浓度。而所述区别技术特征或在对比文件1的基础上能够想到，或属于本领域的常规选择。因此，本申请权利要求1的技术方案相对于对比文件1和本领域的公知常识的结合不具备创造性。从属权利要求2-3的附加技术特征均属于本领域的常规选择，因此都不具备创造性。
申请人桂林电子科技大学（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年12月20日向国家知识产权局提出了复审请求，并提交了权利要求书的修改替换页。其中复审请求人在申请日2016年08月31日提交的权利要求书的基础上，将原权利要求1的主题名称“一种基于电化学探针检测还原型谷胱甘肽的方法”修改为“一种能避开半胱氨酸、高半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽干扰的基于10.0 nmol/LCe（IV）电化学检测0.05 nmol/L还原型谷胱甘肽的方法”，限定了探针储备溶液的具体配置参数以及待检测还原型谷胱甘肽的浓度。另外，删除了原权利要求2和3，修改后的权利要求1如下：
“1. 一种能避开半胱氨酸、高半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽干扰的基于10.0 nmol/LCe（IV）电化学检测0.05 nmol/L还原型谷胱甘肽的方法，其特征是，包括如下步骤：
探针储备溶液的配置
称量0.0202g的Ce(SO4)2?4H2O，置于50 mL的烧杯中加入30 mL蒸馏水超声溶解，然后转入50 mL容量瓶中定容后，室温下配制成1.0 mmol/LCe（IV）探针储备溶液；
测定探针离子对还原型谷胱甘肽的选择性
将探针储备溶液用蒸馏水稀释，使最终探针离子的浓度为10.0 nmol/L，而待测样品半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的浓度为5.0 nmol/L，将探针与待测溶液反应0.5小时后，在CHI660D电化学工作站上采用差示脉冲伏安法进行测定电流-电压曲线；
测定探针离子对还原型谷胱甘肽的电流-浓度曲线
将探针储备溶液用蒸馏水稀释，使最终Ce（IV）探针离子的浓度为10.0 nmol/L，谷胱甘肽的浓度为0.15、0.4、0.5、0.75、1.5、3.0、5.0 nmol/L，将探针与待测溶液反应0.5小时后，在CHI660D电化学工作站上应用DPV法进行测定，进而得到电流值对浓度变化的曲线；
（4） 已知浓度和实际生物样品中还原型谷胱甘肽的检测
通过DPV法进行测定0.05 nmol/L的还原型谷胱甘肽。”
复审请求人认为：（1）本申请与对比文件1相比，二者检测的对象虽然相同，但二者干扰的情况不同，要解决的技术问题不同，检测的手段和检测的原理不同，产生的效果也不同，二者有着本质的区别。（2）稀土铈(IV)作为电化学探针不属于对比文件1隐含公开的内容。
经形式审查合格，国家知识产权局于2019年01月03日依法受理了该复审请求，并将本案卷转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，对比文件1给出了采用Ce(IV)或GSH互为电化学探针进行电化学检测的技术启示。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局依法成立合议组对本案进行审理。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，依法作出审查决定。
二、决定的理由
（一）关于审查文本
在复审程序中，复审请求人于2018年12月20日提交了最终的权利要求书全文替换页。经审查，所作的修改符合专利法第33条以及专利法实施细则第61条第1款的规定。本决定所针对的审查文本为：复审请求人于申请日2016年08月31日提交的说明书第1-26段、说明书附图1-2、说明书摘要和摘要附图，以及2018年12月20日提交的权利要求第1项。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
在创造性判断中，通常根据权利要求与最接近的对比文件的区别技术特征确定发明实际解决的技术问题，之后判断现有技术中是否给出了将所述区别技术特征应用到最接近的对比文件、以解决发明实际解决的技术问题的技术启示，如果不能够找到这样的技术启示，且权利要求所要求保护的技术方案具有有益的技术效果，则权利要求相对于所引用的对比文件具备创造性。
就本案而言：
1、权利要求1请求保护一种基于电化学探针检测还原型谷胱甘肽的方法，对比文件1公开了一种用电化学方法表征Ce(III)(GSSG)以及采用Ce(IV)作为探针用荧光法检测GSH的方法（第389-391页，图4和6）：
将0.4g Ce(SO4)2?4H2O（0.4g，1mmol）溶于蒸馏水并移至烧瓶，搅拌加热至60℃，然后滴加GSH溶液（20mL，0.1M），在60℃下连续搅拌反应4小时，得到Ce(III)(GSSG)复合物；电化学测量采用CHI660B电化学工作站，电解质为Na2SO4溶液（参见Experimental）。
另外，还公开了Ce(IV)与GSH的反应机理如下：
Ce(IV) 2GSHCe(III)(GSSG) 2H
其中可以看出，Ce(IV)与GSH反应，Ce(IV)被还原为Ce(III)，GSH被氧化为GSSG。（参见Fluorescent properties of the cerium glutathione complex）。
电化学表征时，将Ce(III)(GSSG)（2.5mM）在0.01M Na2SO4溶液中进行循环伏安扫描，得到循环伏安曲线（参见Electrochemical behavior of Ce(IV)/Ce(III) in Na2SO4 solution，图4）。
以Ce(IV)作为探针用荧光法检测GSH，将GSH加入Ce(IV)溶液，测量溶液的荧光强度，获得荧光强度曲线，进一步得到荧光强度与GSH浓度的线性关系，利用该线性关系检测GSH（参见Determination of GSH in the presence of GSSG，图6）。
将权利要求1与对比文件1公开的技术方案相比较可知：对比文件1公开了一种采用电化学方法对Ce(III)(GSSG)进行表征的方法，还公开了采用Ce(IV)作为荧光探针检测GSH的方法。
本案的争议焦点在于：对比文件1是否隐含公开了Ce(SO4)2?4H2O作为电化学探针检测还原型谷胱甘肽。
对此，合议组认为：从上述公开的内容中可以看出，对比文件1公开了Ce(IV)与GSH的反应机理，以及电化学测量方法表征Ce(III)(GSSG)复合物，但是对比文件1是采用电化学方法对Ce(III)(GSSG)复合物本身进行电化学表征，其目的在于获得Ce(III)(GSSG)复合物的电化学行为，并以此得到了Ce(III)复合物是非常稳定的结果，且证实了配合反应中配体GSH将Ce(IV)还原成Ce(III)（参见“Electrochemical behavior of Ce(IV)/Ce(III) in Na2SO4 solution”），可见对比文件1并非采用电化学方法检测GSH，而仅是对Ce(III)(GSSG)复合物进行电化学表征，对于GSH的检测则是采用Ce(IV)作为荧光探针，通过荧光法实现的，因此对比文件1并没有公开Ce(IV)作为电化学探针检测还原型谷胱甘肽。
因此，权利要求1与对比文件1的区别技术特征为：权利要求1使用Ce(SO4)2?4H2O作为电化学探针，通过电化学法检测还原型谷胱甘肽的浓度；具体检测过程中，制备Ce(SO4)2?4H2O溶液时采用超声溶解和定容的方法配置；测定探针离子对还原型谷胱甘肽的选择性，以及具体的测试方法；探针离子对还原型谷胱甘肽的电流-浓度曲线以及具体的测定方法；利用DPV法测定还原型谷胱甘肽的浓度，所述方法能避开半胱氨酸，高半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽干扰，测定还原型谷胱甘肽浓度为0.05nmol/L。基于上述区别技术特征，本申请实际要解决的问题在于提高检测还原型谷胱甘肽的灵敏度。
然而，对于上述区别技术特征，本领域技术人员知晓，电化学法和荧光法是两种完全不同的检测方法，其检测机理完全不同，电化学法是建立在物质在溶液中的电化学性质基础上的分析方法，而荧光法则是利用物质的荧光光谱进行定性、定量分析的方法，通常是基于荧光探针与待检测物质反应后荧光强度的变化来实现检测的。尽管对比文件1公开了Ce(IV)与GSH的反应机理，但其制备Ce(III)(GSSG)复合物的反应是在溶液中加热条件下进行的，例如60℃下连续搅拌反应4小时，而Ce(IV)与GSH在电化学体系中的反应是在电极表面进行的，其反应物的性质及反应机理是无法预料的。本领域技术人员知晓，电化学分析法测定结果来自电极表面接触的局部样品，分析结果存在着异质性，任何会影响到待测物质移动至电极表面的因素均会反映在测定结果中，待测物的行为与其活性有关，因此，通过电化学法来定量检测，需要考虑物质的活性、氧化还原电位、水溶性等因素，这也导致其检测结果更是无法预料的。因此，对本领域技术人员而言，并没有动机在对比文件1的基础上，基于对比文件1公开的反应方程式和采用Ce(IV)作为荧光探针检测还原型谷胱甘肽的方法，来选择Ce(IV)或GSH两种反应物互为电化学探针进行Ce(IV)或GSH的电化学检测，也就是说，本领域技术人员并没有动机采用电化学法检测还原型谷胱甘肽，进一步来说，本领域技术人员也就没有动机对电化学检测方法的步骤进行改进，而且所产生的技术效果也不是能预料得到的。
综上所述，本申请旨在提供一种基于电化学探针高灵敏度检测还原型谷胱甘肽的方法。本申请权利要求1的方法正是通过采用电化学方法来实现的。对比文件1中没有公开采用电化学方法检测还原型谷胱甘肽，也没有给出相关的技术启示。而且目前也没有证据表明采用本申请的电化学方法以检测还原型谷胱甘肽属于本领域公知常识。
因此，在对比文件1的基础上结合公知常识不能显而易见地得到权利要求1请求保护的技术方案，且权利要求1所要求保护的技术方案具有电压响应值较大，具有良好的选择性，与其它含有巯基和二硫键分子无作用，具有较高的琉基检测灵敏度的有益效果。因此，权利要求1具有突出的实质性特点和显著的进步，具备专利法第22条第3款规定的创造性。
基于上述理由，合议组依法作出下述决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2018年09月21日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局专利实质审查部门在本复审请求审查决定所依据文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
郑重声明：本文版权归原作者所有，转载文章仅为传播更多信息之目的，如作者信息标记有误，请第一时间联系我们修改或删除，多谢。
