发明创造名称：EGFR基因扩增检测探针、试剂盒以及方法
外观设计名称：
决定号：185245
决定日：2019-07-30
委内编号：1F236148
优先权日：
申请（专利）号：201510050952.9
申请日：2015-01-30
复审请求人：益善生物技术股份有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：彭郁葱
合议组组长：韩世炜
参审员：王莉
国际分类号：C12Q1/68，C12N15/11
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果发明是所属技术领域的技术人员在现有技术的基础上仅仅通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验可以得到的，则该发明是显而易见的，不具备突出的实质性特点。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510050952.9，名称为“EGFR基因扩增检测探针、试剂盒以及方法”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为益善生物技术股份有限公司。本申请的申请日为2015年01月30日，公开日为2015年04月29日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年07月25日发出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：权利要求1-4不具备专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定所依据的文本为：申请日提交的说明书第1-21页（即第1-133段）、说明书附图第1页、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-16页，2017年02月04日提交的权利要求第1-4项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. EGFR基因扩增检测试剂盒，其特征在于，包括有标记荧光染料的、针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50，所述第二组探针为SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60；所述第一组探针与第二组探针所标记的荧光染料颜色不一样。
2. 根据权利要求1所述的EGFR基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50依次分别由以下引物扩增制备得到：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。
3. 根据权利要求1所述的EGFR基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60依次分别由以下引物扩增制备得到：SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39和 SEQ ID NO.40。
4. EGFR基因扩增检测探针，其特征在于，包括有针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50，所述第二组探针为SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60。”
驳回决定指出，权利要求1与对比文件1（CN103160578B，公开日2015年01月28日）的区别在于：权利要求1限定了第一组探针为SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.50，第二组探针为SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.60，即具体的探针。由于本领域公知设计探针时，通常会避免基因重复序列，并且增加探针的种类通常会提高检测的灵敏度，并且对比文件1公开了EGFR基因特异性探针、人7号染色体着丝粒特异性探针能特异性地识别EGFR基因和7号染色体着丝粒，而对其他基因不识别，在此基础上结合常规的商业化软件，本领域技术人员通过有限的实验即可获得与本申请技术效果类似的多条探针。因此，权利要求1不具备创造性。基于相同理由，权利要求4不具备创造性。结合常规的商业化软件，本领域技术人员通过有限的实验即可获得与本申请技术效果类似的多条探针和扩增用的相应引物，因此，权利要求2-3不具备创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年10月30日向国家知识产权局提出了复审请求，提交了附件1：cFDA注册证编号：国械注准20153401883的SUREVISION品牌的EGFR基因FISH检测试剂盒的广告页（中文复印件共2页），没有提交修改文件。结合附件1，复审请求人认为：对比文件1与本申请的检测方法和设计的探针，即探针的设计思路，探针的来源、组成和数量都不同。本申请探针序列选取要考虑到探针序列在整个基因组中的非重复性、特异性及是否存在二级结构等因素，避免各种序列之间的非特异结合，而目前的引物或者探针设计软件，即使输入相关的设计参数，也难以自动设计出符合检测要求的高特异性和高准确性的引物和探针，而设计在同一个检测系统中并行检测的多条探针更是难以仅通过设计软件就能满足相关特异性和准确性的要求，本申请中对于目的基因可选择的目标片段很多，哪些引物和探针能够达到特异性和准确性的要求，仅仅依靠设计软件和常规筛选是无法实现的。且并非设计到相应的所有探针，只要用FISH法检测，就能达到特异性强、信号强的特点。2）本申请请求保护的试剂盒也有相应的市售检测试剂盒（参见附件1），该上市的试剂盒通过权威机构的分析性能评估试验表明，对参考品检测的分析灵敏度为100%，分析特异度为100%，阴阳性符合率为100%，这表明该上市的试剂盒对应的本发明的技术方案具有优异的检测效果，能在临床上进行良好的运用。
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年11月17日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，附件1没有公开发表时间，无法确证具体的公开日，也无法确证其组成与本申请中的探针相同。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年02月14日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1限定了具体的探针序列。而根据对比文件1可知EGFR基因和人类7号染色体着丝粒均属于现有技术中已知序列的基因或区域，为了检测EGFR基因是否扩增，本领域技术人员容易想到根据其序列信息分析，选择保守性好的特异性序列作为探针结合的区域，并利用已有的引物设计软件针对该区域设计引物，扩增获得能与该区域特异性结合的产物，即可作为FISH探针，用于EGFR和人类7号染色体着丝粒的检测。探针及其引物的具体设计及筛选过程均属于本领域的常规技术手段，而且本申请说明书并未证明所述探针序列的组合相对于现有技术取得了何种预料不到的技术效果。因此权利要求1不具备创造性。基于相同理由，权利要求2-4也不具备创造性。
复审请求人于2019年03月18日提交了意见陈述书以及权利要求书全文替换页（共1页2项权利要求）。相对于复审通知书针对的文本，将原权利要求2-3并入权利要求1，其余权利要求依次编号。除了与提交复审请求时所陈述的相类似的意见，复审请求人还认为：本申请的检测位点并非与对比文件1所述的7p12-p14，p11.1-q11.1完全一致。附件1所使用的试剂盒广告页是申请人自身的产品，在申请人没有提交其他EGFR基因异常试剂盒专利申请的前提下，申请人陈述该产品是本申请请求保护的试剂盒是合理且可信的，附件1同时明确记载该试剂盒获得了CFDA注册，因此附件1公开的信息足以证明其分析灵敏度、分析特异度、阴阳符合率可以到达100%。本申请以安必平（LBP）的检测试剂盒作为对照，充分体现本申请权利要求1与安必平公司的产品均能够准确地检测出EGFR基因异常，且结果稳定可靠，具有高灵敏度、高特异性的技术效果。复审请求人新提交的权利要求书如下:
“1. EGFR基因扩增检测试剂盒，其特征在于，包括有标记荧光染料的、针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.50，所述SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.50依次分别由以下引物扩增制备得到：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；所述第二组探针为SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.60；所述SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.60依次分别由以下引物扩增制备得到：SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40；所述第一组探针与第二组探针所标记的荧光染料颜色不一样。
2. EGFR基因扩增检测探针，其特征在于，包括有针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.50，所述第二组探针为SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.60。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人答复复审通知书时提交了权利要求书全文替换页（共1页2项权利要求），经审查，所述修改符合专利法第33条以及专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审请求审查决定针对的审查文本为，2019年03月18日提交的权利要求第1-2项，申请日2015年01月30日提交的说明书第1-133段（即第1-21页）、说明书附图第1页、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-16页。
2、专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，如果发明是所属技术领域的技术人员在现有技术的基础上仅仅通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验可以得到的，则该发明是显而易见的，不具备突出的实质性特点。
具体到本申请，权利要求1请求保护“EGFR基因扩增检测试剂盒，其特征在于，包括有标记荧光染料的、针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.50，所述SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.50依次分别由以下引物扩增制备得到：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；所述第二组探针为SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.60；所述SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.60依次分别由以下引物扩增制备得到：SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40；所述第一组探针与第二组探针所标记的荧光染料颜色不一样。”对比文件1公开了基于30-40%非小细胞肺癌患者存在EGFR基因扩增，设计了用于非小细胞肺癌EGFR基因扩增的专用量子点检测试剂盒，包括EGFR基因特异性DNA探针、人7号染色体着丝粒特异性DNA探针，经表面修饰的量子点水溶液……EGFR基因特异性DNA探针为特异性结合人7号染色体短臂7p12-p14的DNA片段；人7号染色体着丝粒特异性DNA探针为特异性结合人7号染色体着丝粒7p11.1-q11.1的DNA片段（参见权利要求第1项）。检测原理是利用与荧光染料量子点相连接的对EGFR基因特异的探针（GLP EGFR），杂交到病变组织细胞的7号染色体短臂（7p12-p14）上，然后在荧光显微镜下观察，在组织原位直接显示此基因是否扩增。同时用连接在荧光染料量子点的标记了绿色荧光信号的对7号染色体着丝粒特异的探针（CSP7）作为对照，杂交到7号染色体着丝粒（7p11.1-q11.1）上。将EGFR基因特异性探针，人7号染色体着丝粒特异性探针与荧光染料量子点及连接试剂组成试剂盒，能特异性地识别EGFR基因和7号染色体着丝粒，而对其他基因不识别，当连接量子点的EGFR探针和着丝粒探针与未知细胞(或未知组织)作用后，可通过细胞/组织中结合的两种荧光量子点的比值来判断EGFR基因是否扩增（参见说明书第2页第[0014]-[0018]段）。与肺癌阳性或肺癌阴性组织切片杂交，连接EGFR探针的量子点几乎与的所有细胞结合，肺癌阳性组织切片每个细胞中有两个以上的红色荧光，与绿色量子点荧光的比值大于或等于2，肺癌阴性组织切片每个细胞中红色与绿色量子点荧光的比值小于2，表明EGFR探针连接的量子点能有效识别EGFR基因（参见说明书第4页第[0050]、[0054]段）。
权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1限定了具体的探针序列以及限定用于扩增所述各探针的引物序列。因此，本申请实际解决的技术问题是，提供另外一种EGFR检测试剂盒。而根据对比文件1可知EGFR基因和人类7号染色体着丝粒均属于现有技术中已知序列的基因或区域，为了检测EGFR基因是否扩增，本领域技术人员容易想到根据其序列信息分析，选择保守性好的特异性序列作为探针结合的区域，并利用已有的引物设计软件针对该区域设计引物，扩增获得能与该区域特异性结合的产物，即可作为FISH探针，用于EGFR和人类7号染色体着丝粒的检测。探针及其引物的具体设计及筛选过程均属于本领域的常规技术手段，而且本申请说明书并未证明所述探针序列的组合相对于现有技术取得了何种预料不到的技术效果。因此在对比文件1的基础上结合本领域的常规技术手段获得权利要求1的技术方案对于本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，从而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2请求保护EGFR基因扩增检测探针，限定针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为SEQ ID NO.41-SEQ ID NO.50，所述第二组探针为SEQ ID NO.51-SEQ ID NO.60，基于与权利要求1的评价相同的理由，也不具有专利法第22条第3款规定的创造性。
对复审请求人相关意见的评述
1）就检测方法而言，对比文件1和本申请都是利用检测探针和对照探针与组织切片原位杂交，通过比较荧光显微镜下观察到的检测荧光和对照荧光的数量关系来判断组织是否为小细胞肺癌患者来源。对比文件1探针与量子点荧光染料相连接，本申请使用的FISH检测方法属于本领域常规方法，通常而言是否与量子点荧光染料相连接并不会影响到探针的设计。对比文件1和本申请的检测探针都是来源于EGFR基因序列，对照探针都是来源于7号染色体着丝粒序列。在对比文件1公开了克隆7号染色体短臂7p12-p14（GenBank： NG_007726.3）的DNA片段至载体上，转化并培养大肠杆菌，提取质粒酶切获得长度为100-750bp的DNA片段作为检测探针，以及对照探针为特异性结合人7号染色体着丝粒7p11.1-q11.1（GenBank：AC019063.4）的序列的基础上，本领域技术人员根据上述信息容易获知探针所针对的靶点，也容易根据公知的序列数据库获得上述靶点的序列并设计引物对其进行扩增，进一步地，由于EGFR基因和人类17号染色体着丝粒均属于现有技术中已知序列的基因或区域，本领域技术人员也容易想到根据其序列信息分析，选择其他保守性好的特异性序列作为探针结合的区域。并且本领域技术人员知晓，对于引物的设计可以借助于引物设计软件例如Oligo6.57、Primer5.0等，以Primer5.0为例，其能够显示引物的各种参数，包括给引物打分，显示引物的起始位置、长度、Tm值、GC含量等，甚至于能够自动分析引物二聚体结构，发卡结构、错配情况以及显示是否存在对PCR扩增有影响的结构以及这些结构的位置，利用这些参数可以对引物作出可靠的评价（参见公知常识性证据1：陈宏主编，《基因工程》第2版，中国农业出版社，2011年6月，第121-122页）。基于上述信息本领域技术人员也容易分析所述区域是否适宜设计针对该靶点的特异性探针。在此基础上本领域技术人员只需进行简单推理选择满足需求的引物从而扩增出目的探针，并经简单实验验证探针的效果，这并不需要付出创造性的劳动。2）复审请求人提供的附件1仅是SUREVISION品牌的EGFR基因异常FISH检测试剂盒的广告页，首先，尽管针对EGFR试剂盒，复审请求人仅提交了一件专利申请，但是该附件1中并未披露本申请权利要求的序列信息，针对同一靶点，可能存在多种试剂盒，因而无法证实该广告页上的试剂盒即为本申请请求保护的试剂盒。在此基础上，广告页中的试剂盒产品获得CFDA审批，与本申请中的试剂盒是否满足专利授权条件也没有必然联系。其次，该附件1中也没有公开任何能够证明参考品检测的分析灵敏度为100%，分析特异度为100%，阴阳性符合率为100%的试验数据，也就不能证明附件1中的产品具有高灵敏度、高特异度和高准确性。3）考虑到本申请中试剂盒及相应探针取得的技术效果，本申请实施例汇总表9的检测结果表明，本申请检测的结果与安必平公司的产品检测吻合率达到100%。表13的检测结果表明，不同数量扩增产物组成的探针库检测效果一致，同时与安必平公司的产品检测结果吻合。本申请说明书中虽声称使用8-10对扩增引物，以使探针库的灵敏度、特异性和稳定性达到最好，但是说明书中并没有记载能体现出灵敏度和特异性的实验数据，也就并不能证明本申请的探针或试剂盒具有高灵敏度、高特异性的技术效果，目前的实验数据仅能证明本申请的试剂盒或探针与现有技术的试剂盒在检测结果一致性方面效果相当，并不能证明本申请的试剂盒或探针取得了预料不到的技术效果。综上，复审请求人的意见不具有说服力。
基于上述事实和理由，作出如下复审请求审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年07月25日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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